睾丸体细胞来源的多能干细胞、其制备方法以及包含其的治疗勃起功能障碍的药物组合物

摘要

本发明提供源于睾丸体细胞的多能干细胞，更具体地说，提供对CD34以及CD73均表现为免疫反应阳性、且源于睾丸体细胞的多能成体干细胞。并且，本发明还提供所述源于睾丸体细胞的多能干细胞的制备方法以及包含其的治疗勃起功能障碍的药物组合物。

说明书

技术领域

本发明提供睾丸体细胞来源的多能干细胞，更具体地说，提供对 CD34以及CD73均表现为免疫反应阳性、且来源于睾丸体细胞的多能 成体干细胞。并且，本发明还提供所述睾丸体细胞来源的多能干细胞 的制备方法以及包含其的治疗勃起功能障碍的药物组合物。

背景技术

由于人的成体组织特异性干细胞能修复及/或替换损伤组织，因 此在临床上具有临床实用性。然而由于缺乏合适的组织特异性干细胞 标记物，成体干细胞的鉴定被证实为是非常困难的。且对成体干细胞 在临床上的应用限制更大的是，其在培养过程中具有有限的寿命，且 相比于人胚胎干细胞（ESCs），其具有有限的分化能力。至今，分离 出的成体干细胞中，骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）的特性分析的 最为清楚。BM-MSCs由于是10年前已被鉴定，衍生出很多中胚层来 源的分化的细胞形态。但是，BM-MSCs的分离会给患者带来极大的 痛苦，且即使成功进行了分离，在培养基中维持为BM-MSCs也非常 困难。其是由于BM-MSCs容易发生老化（通常为第8代细胞）；容易 丧失分化能力；并且有的情况下，进行体外培养扩增后，会形成肿瘤 性细胞。干细胞的其他来源包括牙髓（dental pulp）、脐带胶样组织、 羊膜以及脂肪组织，然而这些其他来源的干细胞具有有限的寿命以及 分化能力。

特异性干细胞标记物中，CD34可在早期造血（hematopoietic）以 及血管相关（vascular-associated）组织中被发现。CD34是一种116-k D型I型跨膜糖蛋白，但对其确切的功能几乎没有报道。在造血系统中， 表面表达CD34的细胞，可在细胞因子或生长因子的刺激下增殖，并 且可分化为整个的淋巴造血系统（Lymphohematopoietic lineages）。 因此，CD34一直被用作辅助鉴定以及分离淋巴造血干细胞/前体细胞 群的标记物；且最近用于辅助鉴定包括肌卫星细胞以及表皮前体细胞 的其他组织特异性干细胞的标记物。最近，有报道指出CD34阳性基 质细胞在包括乳房、输卵管（fallopian tubes）、甲状腺、直肠、胰腺、 子宫颈部以及睾丸等的多种器官中均有分布（Kim J,Seandel M,Fa lciatori I,et al.CD34+testicular stromal cells support long-term ex pansion of embryonic and adult stem and progenitor cells.Stem Cel ls.2008；26：2516-2522）。脂肪来源基质细胞（adipose-derived stro mal cell,ASC）群中，CD34阳性细胞是通过与内皮细胞的结构以及 功能上的相互作用，从而在血管稳定性方面发挥重要的作用的常驻血 管周细胞（resident pericyte，）。其他研究中，CD 34阳性细胞较CD34阴性细胞表现出更高的增殖能力以及集落形成能 力，且表现出更低的分化能力。因此，研究人员提出CD34的表达在 未成熟状态下，针对向特定系统的生理分化过程反相关（Suga H,M atsumoto D,Eto H,et al.Functional implications of CD34expressi on in human adipose-derived stem/progenitor cells.Stem Cells Dev. 2009;18:1201-1210）。但是，CD73是连接有糖基磷脂酰肌醇（GPI） 的膜结合糖蛋白，将细胞外核苷一磷酸水解为生物活性的核苷中间 体。该抗原可在间充质干细胞、B-细胞及T-细胞的亚型（subsets）以 及包含内皮细胞的大部分细胞中被发现。因此，该分子作为鉴定来源 于不同的组织的间充质干细胞的标记物而使用。有趣的是，至今分离 出的间充质干细胞中没有一个是同时表达CD73以及CD34。

并且，哺乳动物的睾丸由生殖细胞以及多种种类的体细胞构成。 由于缺乏特定标记物，因此在组织中鉴定及定位潜在的干细胞十分困 难。有研究人员分离及增殖过精原干细胞（spermatogonial stem cell s，SSCs）以及睾丸间质干细胞（Leydig stem cells）等单能（unipot ent）干细胞（Kanatsu-Shinohara M,Ogonuki N,Inoue K,et al.Lo ng-term proliferation in culture and germline transmission of mouse  male germline stem cells.Biol Reprod.2003；69:612-616；以及Ge  RS,Dong Q,Sottas CM,et al.In search of rat stem Leydig cells: identification,isolation,and lineage-specific development.Proc Natl  Acad Sci USA.2006;103:2719-2724）。并且，还有研究人员利用睾 丸活检，从人和小鼠生成了来源于原始生殖细胞（primordial germ c ell-derived）的胚胎干细胞样细胞（Conrad S,Renninger M,Hennenl  otter J,et al.Generation of pluripotent stem cells from adult huma n testis.Nature.2008；456：344-349；Guan K,Nayernia K,Maier  LS,et al.Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mou se testis.Nature.2006；440：1199-1203；Seandel M,James D,Sh melkov SV,et al.Generation of functional multipotent adult stem c ells from GPR125+germline progenitors.Nature.2006；449：346-3 50;Kanatsu-Shinohara M,Inoue K,Lee J,et al.Generation of plur ipotent stem cells from neonatal mouse testis.Cell.2004；119：100 1-1012）。所述细胞分化成所有3个胚层的细胞，且将细胞注射至NOD -SCID小鼠时，形成了肿瘤（Conrad S,Renninger M,Hennenlotter J, et al.Generation of pluripotent stem cells from adult human testis. Nature.2008；456：344-349）。

但是，对于睾丸成体干细胞的研究几乎没有。直到最近才从成人 睾丸分离出了间充质干细胞样细胞群，并且通过将其分化为中胚层系 统的细胞，对其进行了特性分析（Gonzalez R,Griparic L,Vargas V, et al.A putative mesenchymal stem cells population isolated from  adult human testes.Biochem Biophys Res Commun.2009；385：57 0-575）。此类细胞对于CD90表现为阳性、而对于CD34表现为阴性， 说明其是在体外具有有限寿命的睾丸来源的间充质干细胞。在小鼠 中，CD34阳性基质细胞有效地支持了成体睾丸前体细胞的增殖（Sea ndel M,James D,Shmelkov SV,et al.Generation of functional mu ltipotent adult stem cells from GPR125+germline progenitors.Natur e.2006；449：346-350）。但是，还没有进行对确定CD34/CD73双阳 性睾丸基质细胞能否成为其他成体干细胞的来源的研究，以及如果 是，它们的分化以及增殖能力如何进行的研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题

本发明发明人发现了CD34/CD73双阳性细胞，相比于CD34阴性 细胞具有显著优异的增殖能力，并且显示出了明显更高的向脂肪、骨、 神经、胰腺系统等细胞的分化能力。所述细胞未在NOD-SCID小鼠中 形成畸胎瘤，且在30代后也能维持正常的核型，显示出了具有极高的 遗传稳定性。其在双侧海绵体神经粉碎损伤（bilateral cavernous ner ve crush injury）大鼠模型中，促进了勃起功能障碍的功能恢复。并 且，指出了表达CD34的细胞比例随着体外细胞传代数的增加而减少， 且随着细胞分化而减少。

由此，本发明的目的在于，提供来源于睾丸体细胞的，CD34/C D73双阳性的多能成体干细胞。

本发明的目的还在于，提供所述来源于所述睾丸体细胞的，CD3 4/CD73双阳性的多能成体干细胞的制备方法。

本发明的目的还在于，提供包含来源于所述睾丸体细胞的，CD3 4/CD73双阳性的多能成体干细胞作为有效成分的，治疗勃起功能障碍 的药物组合物。

技术方案

一方面，本发明提供一种对于CD34以及CD73均表现为免疫反应 阳性，来源于睾丸体细胞的多能成体干细胞。

另一方面，本发明提供一种对于CD34以及CD73均表现为免疫反 应阳性的多能成体干细胞的制备方法，其包括：（a）从分离自人体的 人睾丸组织中分离生精小管的外周细胞，并对其进行传代培养的步 骤；以及（b）对于步骤（a）中获得的细胞，利用抗-CD34抗体以及 抗CD-73抗体进行细胞分选（sorting），分离出CD34阳性以及CD73阳 性细胞，并对其进行传代培养的步骤。

另一方面，本发明提供一种包含对于CD34以及CD73均表现为免 疫反应阳性，来源于睾丸体细胞的多能成体干细胞作为有效成分的， 治疗勃起功能障碍的药物组合物。

有益效果

本发明中首次分离出了CD34/CD73双阳性的睾丸基质细胞，即来 源于睾丸体细胞的多能成体干细胞。所述多能成体干细胞显示出了优 异的增殖能力（细胞群倍加数平均约为67.3±2.1），并且显示出了极高 的向3个胚层系统细胞的分化能力，所述3个胚层系统细胞包括脂肪细 胞、骨细胞、神经细胞、胰腺细胞（例如胰岛素分离细胞）。所述多 能成体干细胞不形成畸胎瘤，30代后也能维持正常的核型，具有极高 的遗传稳定性。尤其是，在双侧海绵体神经粉碎损伤大鼠模型中，所 述多能成体干细胞促进了勃起功能障碍的功能恢复。因此，所述多能 成体干细胞可有效应用于治疗勃起功能障碍的药物组合物。

附图说明

图1表示在非闭塞性无精子症（NOA，图1a）以及闭塞性无精 子症（OA，图1b）患者的睾丸中，对CD34、CD73、αSMA和CD31 进行同时定位。4’,6’-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核染色显示蓝色； 异硫氰酸荧光素（FITC）染色显示绿色；Cy3染色显示红色。白色箭 标表示CD34、CD73双阳性信号。开放箭头（open arrowheads）是指 对于αSMA的信号。白色箭头是指对于CD31的信号。

图2表示根据骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）、睾丸来源的干细 胞（TSCs）以及高增殖性睾丸来源的干细胞（HTSCs）的特异性标记 物表达。图2a表示在人睾丸来源的干细胞群中，CD34表达情况的免 疫细胞化学的分析结果（100×）,红色信号表示CD34的表达。图2b 表示在BM-MSCs、TSCs以及HTSCs中，CD34及CD73表达情况的 免疫细胞化学的分析结果，DAPI核染色显示蓝色。图2c表示在 HTSCs中，多能干细胞标记物（OCT4、c-Kit、Tra-1-60、Tra-1-81、 SSEA3以及SSEA4）表达的免疫细胞化学的分析结果，FITC染色显 示绿色；Cy3和四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）染色显示红色。

图3表示多种TSCs的形态以及增殖特性。图3a表示在相同培养 条件下，维持的细胞形态差异的相差显微镜图片（phase contrast  image）（MSC-类似与老化类似的形态），其分别为第1代以及第6代 的BM-MSCs、第1代以及低13代的人TSCs以及第5、13、20及27 代的HTSCs的相差图片。图3b表示对BM-MSCs、TSCs以及HTSCs 的累积倍增数的比较结果。

图4表示额外培养前后，对分选的细胞群的流式细胞分析。图 4a表示对BM-MSCs、TSCs、HTSCs以及再分选的HP-TMSCs的累 积倍增数的比较结果。图4b表示对HTSCs额外培养后，CD34阳性 细胞减少，但CD73阳性细胞维持了较高的密度。图4c表示在培养 期间，HTSCs对CD34表达逐渐消失，且没有恢复对CD34的表达， 然而通过磁性细胞分选法（MACS）对CD34阳性细胞分选，并进行 增殖后，显示延长了HTSCs的增殖进一步延长。

图5表示在体外，BM-MSCs、TSCs、HTSCs，向中胚层系统（如 软骨、脂肪、骨细胞）的分化能力。图5a表示在进行3周的软骨分 化后，第5代的BM-MSCs、第3代的TSCs、第5、13、20代以及再 分选的第20代的HTSCs中，对于硫酸化多糖（sulfated proteoglycans） 的阿尔新蓝染色（左侧附图），以及在同一细胞群中，软骨分化前后 分析的SOX9（右侧附图的左侧）以及COMP（右侧附图的右侧）的 基因表达。图5b表示使用油红O的脂肪滴（lipid droplets）的染色（左 侧附图）以及PPARγ（右侧附图的左侧）及C/EBPα（右侧附图的右 侧）的基因表达。图5c表示茜素红S的钙沉积物（左侧附图）以及 为评价骨分化的CBFAⅠ（右侧附图的左侧）及COLⅠ（右侧附图 的右侧）的基因表达。

图6表示在体外，BM-MSCs以及HTSCs，向胰岛素分泌细胞的 分化能力。图6a及图6b表示在多种不同分化条件下培养后，对于胰 岛素以及C肽分泌的酶联免疫吸附分析结果。图6c表示分别源自 HTSCs及BM-MSCs的胰岛素分泌细胞之间的胰岛素及NGN-3的基 因表达的比较。

图7a表示与大鼠损伤部位较为接近的海绵体神经（cavernous  nerve）的电刺激，利用24号（gauge）针，在所述海绵体中进行插管。 图7b表示测定勃起功能的结果，红色、蓝色以及绿色曲线分别表示 对于神经刺激的平均血压（mean arterial pressure，MAP）、阴茎海绵 体内压（intracavernous pressure，IAP）以及ICP/MAP的比例。图7c 表示相对于损伤组，注入BM-MSCs及HTSCs，增加了ICP/MAP的 比例。图7d是为了使HTSCs（箭头）可视化，而利用CellTracker（红 色荧光）及神经元标记物（TuJI，深褐色）进行染色的外周神经性前 列腺（perineural prostatic）组织。图7e是TuJI（紫色，箭标）以及 人细胞特异性抗体Stem121（绿色，白色箭头）。DAPI核染色显示蓝 色；CellTracker显示红色（开放箭头）。

图8表示分离CD34阳性以及CD73阳性的，睾丸来源间充质干 细胞过程的一个实施例。

图9a表示在初期睾丸间质细胞中的特异性标记物的表达。在免 疫细胞化学分析结果中，第1列显示了CD34（红色，白色箭头）及 3β-HSD（绿色，开放箭头）；第2列显示了GFRα1（红色，白色箭头） 及Thy-1（绿色，开放箭头）；以及第3列显示了αSMA（红色）以及 肌间线蛋白（绿色）的表达。图9b表示每100mg睾丸组织中，各个 步骤分离出的细胞数。起始物质在第0天时计数，粘附细胞在第3天 进行计数，CD73分选细胞在第2代进行计数，CD34分选细胞在第3 代进行了计数。图9c表示第3代以及第8代的HTSCs中特异性标记 物的表达。免疫细胞化学分析表示CD34（红色）的表达以及GFRα 或者Thy-1（绿色）的非表达。图9d为表示CD34（红色）的表达以 及3β-HSD的非表达的免疫细胞化学分析结果。图9e为表示CD34（红 色）的表达以及肌间线蛋白或者αSMA的非表达的免疫细胞化学分 析结果。

图10表示HTSCs的流式细胞分析结果。HTSCs对于HLA-ABC、 CD73、CD166、CD44、CD29、CD90、CD105以及CD34呈强阳性； 对于CD14、CD133以及StroI呈弱阳性；并且，对于SSEA3、TRA-1-81、 c-Kit、CD31、TRA-1-60、CD140、HLA-DR、CD45以及SSEA4抗 原呈阴性。其中，APC是别藻蓝素（allophycocyanin）；FITC是异硫 氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate）；PE是藻红素（phycoerythrin） 的缩写。

图11表示HTSCs的特性。图11a表示HTSCs在表示的传代中 具有正常的核型（2n，46XY）。图11b表示HTSCs中的多能万能性 标记物（Oct4、NANOG、SOX2）以及生殖细胞标记物（VASA）的 RT-PCR分析结果。

图12表示对BM-MSCs以及HTSCs进行的集落形成单位测定 （Colony forming unit assay）的结果。结果显示，BM-MSCs以及 HTSCs在造血条件下，不会显示集落形成（B），但在非造血条件下， 显示集落形成（A）。

图13a表示在肾脏（A1-A4）以及睾丸（A5-A8）中测定的，HTSCs 的畸胎瘤形成分析结果（100×）。在两个组织中均未形成畸胎瘤。图 13b表示胚胎干细胞的畸胎瘤形成（×200）。消化道样上皮（gut-like  epithelium）（内胚层，H-E染色，B1），软骨（中胚层，阿尔新蓝染 色，B2），分泌性上皮（secretory epithelium）（内胚层，PAS染色g， B3），以及肌纤维（muscle fibers）（中胚层，马松三色染色（Masson’s  trichrome staining），B4）。图13C表示在小鼠以及人的睾丸组织中， 特定人细胞特异性标记物（Stem121）的表达。免疫细胞化学分析中， 第1列显示不表达Stem121，但在第2列及第3列中则显示表达。

图14表示胚胎干细胞（ESCs）、BM-MSCs、脂肪来源（AD）间 充质干细胞以及HTSCs，向中胚层系统（脂肪、骨以及软骨细胞） 的体外分化能力。（A）表示PPARγ（上部左侧）以及C/EBPα（上部 右侧）的基因表达；（B）表示COLⅠ（中间左侧）以及CBFAⅠ（中 间右侧）的基因表达；（C）表示COMP（下部左侧）以及SOX9（下 部右侧）的基因表达。

图15表示BM-MSCs以及HTSCs，向神经系统细胞的体外分化 能力。图15a表示从BM-MSCs以及HTSCs分化而来的神经细胞中 有巢蛋白表达（×200）。图15b表示从BM-MSCs以及HTSCs分化而 来的神经细胞的相差显微镜图片（100×）。图15c显示与BM-MSCs 相比，利用诱导出的HTSCs的分化成神经的处理的细胞中，具有 GFAP以及β-微管蛋白3基因的表达。

图16表示HTSCs向中胚层系统（脂肪、骨以及软骨细胞）的体 内分化能力。图16a以及图16b显示在分化成脂肪细胞的HTSCs中 具有PPARγ以及C/EBPα的基因和蛋白质的表达；在分化成骨细胞的 HTSCs中具有COLⅠ以及CBFAⅠ的基因和蛋白质的表达；且与非 诱导的细胞相比，分化成软骨细胞的HTSCs中具有COMP以及SOX9 的基因和蛋白质的表达。图16c以及图16d表示使用特异性染色以及 特定标记物的免疫细胞化学的分析结果。

图17a以及图17b是分析表达CD34的细胞比例以及细胞分化程 度的分析结果。表达CD34的细胞的比例，随着传代培养（第5、13 以及20代）发生了降低，且向所有3个胚层系统的标记基因（中胚 层基因：PPAR、C/EBP、COLⅠ、CBFAⅠ、COMP及SOX9；内胚 层基因：胰岛素及NGN；以及外胚层基因：GFAP及β-微管蛋白3） 的表达水平也发生了降低。

具体实施方式

本发明提供对CD34以及CD73均表现为免疫反应阳性、且来源于 睾丸体细胞的多能成体干细胞。

本发明的多能成体干细胞具有优异的增殖能力（细胞群倍加数平 均约为67.3±2.1），并且显示出了极高的向3个胚层系统细胞的分化能 力，所述3个胚层系统细胞包括脂肪细胞、骨细胞、神经细胞、胰腺 细胞（例如胰岛素分离细胞）。所述多能成体干细胞不形成畸胎瘤，3 0代后也能维持正常的核型，从而具有极高的遗传稳定性。所述多能 成体干细胞中，所述睾丸的体细胞可以是生精小管（seminiferous tu bles）的外周细胞（outer surrounding cells），优选间质细胞（intersti tial cells）。

本发明还提供所述多能成体干细胞的制备方法。即本发明提供一 种对于CD34以及CD73均表现为免疫反应阳性的多能成体干细胞的 制备方法，其包括：（a）从分离自人体的人睾丸组织中分离生精小管 的外周细胞，并对其进行传代培养的步骤；以及（b）对于步骤（a） 中获得的细胞，利用抗-CD34抗体以及抗CD-73抗体进行细胞分选， 分离出CD34阳性以及CD73阳性细胞，并对其进行传代培养的步骤。

从人体分离的人睾丸组织是指在不育门诊中，为临床目的取得的 男性睾丸组织。即在不育门诊中，不育男性患者（例如无精子症患者） 为了进行睾丸取精-胞浆内精子注射技术（TESE-ICSI）的手术，采集 睾丸组织，临床使用后剩余的组织将被废弃。本发明的制备方法可使 用如上所述的，不育门诊中被废弃的从人体分离的男性睾丸组织。所 述睾丸组织可以是从闭塞性或者非闭塞性无精子症患者，进行体外分 离的睾丸组织。

将体外分离的睾丸组织，优选利用红细胞（RBC）裂解缓冲液洗 涤的睾丸组织，通过酶处理获得生精小管的外周细胞，优选获得生精 小管的间质细胞。例如，所述分离可利用胶原酶、分散酶或其混合物 的酶，对分离的人睾丸组织进行酶处理而实现。所述酶处理可在约3 7℃条件下，搅拌30分钟而实现。

获得的生精小管外周细胞（例如，间质细胞）可在常用的细胞培 养基中进行传代培养（subculturing）。例如，可在包含饲养细胞以及 血清的培养基中培养至第2至4代，优选培养至第3代。在一实施例中， 所述饲养细胞可以是明胶。并且，所述包含血清的培养基可优选使用 添加胎牛血清、青霉素/链霉素的DMEM-F12（Gibco）以及Stempro3 4（英俊公司，Camarillo，CA）的混合培养基。各个传代培养可通过 如下的方式进行：例如传代培养中细胞融合度（confluency）达到8 0%时，利用胰蛋白酶-EDTA等分离成单个细胞后，可进行连续的传 代。

本发明制备方法包括：对步骤(a)获得的细胞，利用抗-CD34抗体 以及抗-CD73抗体进行分选，分离出CD34阳性以及CD73阳性细胞后， 进行传代培养的步骤[即步骤（b）]。

所述分选可采用生命工程领域通常采用的方法进行，优选采用磁 性细胞分选法（magnetic activating-cell sorting，MACS）进行。所述 磁性细胞分选法是将与特定标记物反应的细胞分选出来的方法，可利 用Dynabeads Flowcomp（英俊公司）等设备执行。可通过论文(Lim, J.J.,et al.Long-term proliferation and characterization of humansper  matogonial stem cells obtained from obstructive and non-obstructive  azoospermia under exogenous feeder-free culture conditions.Cell P rolif43,405-417(2010))公开的方法，利用抗-CD34抗体以及抗-CD73 抗体进行所述磁性细胞分选法。所述文献的全部内容引入本说明书。

步骤（b）中所述的传代培养，优选在包含饲养细胞以及血清的 培养基中培养至第7至9代。在一实施例中，所述饲养细胞可以是明胶， 所述含有血清的培养基可以是添加了胎牛血清、青霉素/链霉素的DM  EM-F12（Gibco）以及Stempro34（Invitorgen Corpporation，Camarill o，CA）的混合培养基，但并不仅限于此。各个传代培养通过如下方 式进行：例如，传代培养中细胞融合度达到80%时，利用胰蛋白酶-E DTA等分离成单个细胞后，可进行连续的传代。

在步骤（b）中，对利用抗-CD34抗体以及抗-CD73抗体，采用磁 性细胞分选法分选的细胞，进行长时间传代培养时，第7至第9代（约 第8代）之后，显示CD34阳性的干细胞数极具减少。本发明人发现， 对于培养至第7至9代（约第8代）的细胞进行额外的分选，例如采用 磁性细胞分选法进行分选时，能在更长时间的传代培养过程中，维持 显示CD34阳性的干细胞。

因此，在一实施例中，可包括额外的传代培养的步骤，其是对所 述培养至第7至9代细胞的细胞，利用抗-CD34抗体抗体，优选采用磁 性细胞分选法[即，二次磁性细胞分选法]进行分选后进行的。所述额 外的传代培养可在所述步骤（b）的传代培养的基础上，额外培养至 第7至12代[例如，步骤（b）中的初期传代培养进行至第8代时，可进 一步培养至第15至20代]。

在另一实施例中，所述额外的传代培养，在所述步骤（b）的传 代培养基础上，额外培养至第12代[例如，步骤（b）中的初期传代培 养进行至第8代时，进一步培养至第20代]后，利用抗-CD34抗体，优 选采用磁性细胞分选法[即，三次磁性细胞分选法]进行分选后，可进 行继续的传代培养。

并且，本发明还提供将对于CD34以及CD73均表现为免疫反应阳 性，来源于睾丸体细胞的多能成体干细胞作为有效成分的，治疗勃起 功能障碍的药物组合物。

本发明中还明确了，将在本发明中获得的所述多能成体干细胞局 部注射于双侧海绵体神经粉碎损伤（bilateral cavernous nerve crush  injury,BCNCI）大鼠的前列腺周边（periprostatic）时，双侧海绵体神 经粉碎损伤得到了恢复。因此，所述多能成体干细胞可有效应用于治 疗勃起功能障碍。尤其是由于本发明中获得的CD34阳性以及CD73阳 性的多能成体干细胞不会形成畸胎瘤，因此可安全地应用于患者。并 且，通过常用前列腺活检（transrectal biopsy）,例如根治性前列腺切 除术（radical prostatectomy）诊断前列腺癌时，通过本发明的制备方 法，从获得的睾丸活检物中可获得自体（autologous）睾丸来源的干 细胞，因此所述多能成体干细胞应用时可以不用担心免疫排斥反应等 安全性问题。因此，本发明药物组合物尤其适合应用于，由根治性前 列腺切除术引起的勃起功能障碍的治疗。

本发明的药物组合物可包含所述CD34阳性以及CD73阳性的，睾 丸体细胞来源的多能成体干细胞，还可包含药用载体，并可通过通常 的方法，以液剂、混悬剂、乳剂、冷冻干燥剂等非口服剂型的形态进 行制剂。所述药用载体可包含磷酸盐缓冲液（phospate buffered salin e）、纯净水、灭菌水等稀释剂或者溶剂。并且，还可根据需要包含保 存剂等。

对于本发明的药物组合物，所述CD34阳性以及CD73阳性的，睾 丸体细胞来源的多能成体干细胞的给药量根据勃起功能障碍患者的 状态及体重、疾病的程度、给药形式、给药途径以及期间而不同。例 如，将所述CD34阳性以及CD73阳性的，睾丸体细胞来源的多能成体 干细胞一次性给药时，可以10⁵至10⁸个细胞/ml的使用量进行给药，但 并不仅限于此。

以下将通过实施例详述本发明。但是，下述实施例仅是为了例示 或者说明本发明，并不会限制本发明。

1.材料及方法

（1）高增殖性睾丸来源的干细胞（HTSCs）的分离及培养

经患者同意（informed consent）后，从25名从通过睾丸取精-胞 浆内精子注射技术（TESE-ICSI）进行治疗的男性患者取得临床使用 后剩余的睾丸组织。其中10个样品在传代培养第1-2代过程中，细胞 显示支原体污染阳性反应（mycoplasma detection kit,L onza,Rockland,ME），从而被排除。最终选取了从闭塞性（OA，n= 2）或者飞闭塞性（NOA）无精子症患者（n=13）取得的睾丸组织用 于本实验。本研究获得了江南CHA医院（首尔，韩国）的机构伦理审 查委员会（Institutional Review Board）的承认。

在图8的流程图中，对整体的研究设计进行了概括。睾丸组织用 红细胞裂解缓冲液（罗氏诊断，巴塞尔，瑞士）洗涤后，用酶溶液[含 有0.5mg/ml胶原酶（type Ⅳ；Gibco）、0.25mg/ml分散酶Ⅱ（中性蛋 白酶Ⅲ，罗氏）的Hank’s平衡盐溶液（HBSS,Gibco,大岛,纽约）]， 在37℃条件下，搅拌30分钟，从而对生精小管的间质细胞进行酶分离。 为分离间质细胞，尽量仅对生精小管外周细胞进行酶分解以及通过物 理搅拌进行分离，并尽可能避免生精小管的分离。收集间质细胞的悬 浮液进行洗涤后，利用40μm的筛网（BD,Franklin,NJ）过滤。之后， 将其在基础培养基（添加10%胎牛血清（FBS,Gibco）、青霉素/链霉 素（1×,Gibco）的DMEM-F12（Gibco）以及Stempro34（英俊公司, Camarillo,CA）的50：50混合物）中，转移至用0.1%明胶（Gibco） 进行包被的培养皿进行贴壁培养（5.0×10⁵/ml）。7-8天后，将融合度 为80%的细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco）剥离后，进行传代 培养。传代培养2-3代后，将初始培养的细胞剥离，利用Dynabeads F lowcomp（英俊公司）进行分选获得CD73（圣克鲁兹生物技术）/CD 34（圣克鲁兹生物技术,CA）双阳性细胞。即，将获得细胞用CD73 抗体以及生物素结合羊抗-小鼠IgM（biotin-conjugated goat anti-mous e IgM）一同孵育后，与结合链霉亲和素的磁珠（streptavidin-bound  magnetic Dynabead）混合。分选后，将细胞在释放缓冲液（releasing  buffer）中进行孵育，再将其转移至Dynal MPC-1magnet。收集游 离的CD73阳性细胞追加培养4-7天后，进行分离，并通过上述方法， 利用生物素化的CD34抗体进行二次分离。将分选出的CD34阴性/CD7 3阳性细胞称为TSCs，从基础培养基中，转移至用0.1%明胶（Gibco） 进行包被的培养皿进行贴壁培养（5.0×10⁵/ml）。并且，将分选的CD3 4阳性/CD73阳性细胞称为HTSCs，重新将其转移至新的培养皿中进行 贴壁（1,000细胞/25cm²），并在基础培养基中培养10-14天。每两天更 换培养基。在各个代中，利用累积倍增数（cumulative population do  ubling）利用公式2^X=N_H/N_I进行计算，其中，N_I是指接种的细胞数，N _H是培养至融合度（＞80%）时获得的细胞数，X是群倍增数。计算出 的增加的群倍增数，加上之前的群倍增数，获得累积倍增数。

（2）流式细胞分析（Flow Cytometric Analysis）

第2代后，将具有80%融合度的HTSCs以3-4天的间隔进行传代培 养。在第5代，取部分HTSCs进行重悬，与抗体一同在暗室中，在4℃ 条件下，孵育20分钟，对CD34、CD73、HLA ABC、CD166、CD44、 CD29、CD105、CD90、CD31、CD45、HLA DR、TRA-1-60、SSEA 3、SSEA4、TRA-1-81、CD14（BD）、CD133（eBioscience inc,San  Diego,CA）、c-Kit（Santa Cruz Biotechnology）以及Stro-1（Biorege nd,San Diego,CA）进行测定。洗涤细胞，在500μl磷酸盐缓冲液中 进行悬浮后，马上利用流式细胞分析仪（FACS Vantage SE System, BD）进行分析。为确认死亡的细胞，将HTSCs与碘化丙啶（西格玛 奥德里奇,St.Louis,MO）一同孵育。通过与合适的同型对照组比较 后，对各个特异性抗体显示阳性的细胞的百分比进行计算。

（3）免疫细胞化学

用4%的多聚甲醛（PFA）固定HTSCs，在4℃条件下保存。利用0. 1%曲通X-100（西格玛）进行透化（permeabilization）以及利用封闭 液（blocking solution）（Dako Cytomation Inc.,Carpinteria,CA）进 行封闭后，将稀释于封闭缓冲液的1抗，在4℃条件下过夜反应。将细 胞与稀释于封闭缓冲液的2抗，在室温条件下孵育后，利用DAPI（1: 500,Jakson Immunoresearch,West Grove,PA）进行染色（counter s taining）及封固（mounting）（Dako Cytomation Inc.）。使用的1抗为 CD34（1:100,圣克鲁兹生物技术）、CD73（1:100,圣克鲁兹生物技 术）、OCT4、c-Kit、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3、SSEA4（1:100, CHemicon,Thmecula,CA）、GFRα1、Thy-1、3β-HSD、肌间线蛋白、 αSMC以及巢蛋白（1:100,Millipore,Billerica,MA）。并使用了结合2 抗的CY3（1:200,Jakson Immunoresearch）以及TRITC（1:200,Jaks  on Immunoresearch）。

在人睾丸中为定位CD34以及CD73，将冷冻切片（cryosections） 在10%中性甲醛固定1小时。经过洗涤及封闭后，与稀释于封闭缓冲 液的1抗，在4℃条件下过夜反应。将组织与稀释于封闭缓冲液的2抗 一起在室温条件下孵育后，利用DAPI进行染色及封固。使用的1抗为 CD34（1:100,圣克鲁兹生物技术）、CD73（1:10,圣克鲁兹生物技术）、 CD31（1:50,Abcam,Cambridge,UK），αSMA（1:50,Abcam）。并 使用结合了2抗的FITC（1:100）或Cy3（1:100）。

（4）核型分析（Karyotying）

为对HTSCs进行细胞遗传学分析，将第5、13、20以及30代细胞 在包含0.1μg/ml秋水仙胺（KaryoMax Colcemid Solution;Gibco）的 基础培养基中培养3小时。之后，用低渗溶液（hypotonic solution，1% 柠檬酸缓冲液）处理30分钟，利用甲醇以及乙酸（3:1,体积/体积） 进行固定。将细胞铺在载玻片上进行干燥后，通过G显带（G bandin g）技术确认染色体。为进行各细胞株的核型分析，由专门研究人员 对20个以上的中期染色体进行计数。

（5）实时逆转录聚合酶链式反应（Real time-RT-PCR）

根据制造商的使用指南，利用Tri-reagent（西格玛奥德里奇）分 离RNA。RNA的纯度是利用分光光度计（ND-1000,NanoDdrop,The  rmo Scientific Wilminton,DE）进行分析的。逆转录聚合酶链式反应 （RT-PCR）是利用Prime script1st strand cDNA合成试剂盒（TakaR  a Bio Inc,Otsu,Shiga,Japan）进行的。接下来的聚合酶链式反应， 利用cDNA、下述表1的引物对以及第5代的TSCs、第5代的HTSCs、h  ESCs（第72代的CHA-hES4）（Lee,J.E.,et al.Evaluation of28hu man embryonic stem cell lines for use as unrelated donors in stem  cell therapy：implications of HLA and ABO genotypes.Cell Transpl  ant19,1383-1395(2010)）、第3代的BM-MSCs（PT-2501,LONZA,Wa lkersville,MD）、以及第3代的脂肪来源的BhMSCs（AD-MSC）（Hwa ng ST,Kang SW,Lee SJ,et al.The expansion of human ES and i PS cells on porous membranes and proliferating human adipose-deri ved feeder cells.Biomaterials.2010；31：8012-8021）来源的RNAs 进行。

表1

目的mRNA相对于β-肌动蛋白进行定量。扩增产物利用DyNAmo  SYBR green qPCR试剂盒（Finnzymes,Espoo,芬兰），在DNA Engi ne2荧光检测系统（MJ research）中进行定量。其中，用20μl容积的 反应混合物进行了反应，该反应混合物含有：4μl经焦磷酸二乙酯（D EPC）处理的水；2μl正向引物（5pmol）；2μl反向引物（2pmol）；10 μl预混SYBR green（premix with SYBR green）；以及2μl的cDNA模 板。在72℃延伸步骤（extension step）期间，在各个循环的最后测定 了荧光。在实时定量聚合酶链式反应的最后步骤中，利用恒定的荧光 测定值使温度以0.1℃/s的速度，迅速从65℃上升至95℃后，接着又在 30秒内迅速冷却至40℃，从而生成融化曲线（melting curve）。相对 的基因表达利用2-ΔΔCT方法进行定量。

（6）集落形成单位测定

为形成克隆，将三个不同的浓度（2x10⁵、1x10⁵、0.5x10⁵个细胞 /ml）的HTSCs以及BM-MSCs接种于含有NH CFU-F的培养基（Milte ny Biotec,Bergisch Gladbach,Germany）的培养皿中。在第14天时， 用甲醇固定细胞后进行干燥。利用吉姆萨染色液（西格玛奥德里奇） 进行染色，在室温孵育5分钟。洗涤及干燥后，对直径在1-8mm的集 落（20个细胞以上）进行计数。

（7）在免疫缺陷小鼠中畸胎瘤的形成

为分析肿瘤生长，将未分化的HTSCs重悬于磷酸盐缓冲溶液（1 ×10⁶个细胞/20μl），将其注射于免疫缺陷的SCID小鼠的肾内膜（kidn ey capsules）以及睾丸。作为形成畸胎瘤的阳性对照组，将人ESCs （CHA-hESC35：hES12012006,Korea Stem Cell Registry,KNIH, 五松，韩国）注射于免疫缺陷的SICD小鼠睾丸。使其致瘤的操作后1 2至16周后处死小鼠。将畸胎瘤放置在4%的多聚甲醛溶液后，放进石 蜡里。取得组织切片（sections）后利用苏木精以及伊红（西格玛） 染色后进行组织学检测。为在小鼠组织内确认人细胞，利用人特异性 抗体（Stem-121^TM,Stem Cells Inc.,Cambridge,UK）对注射以及未 注射HTSCs的SCID小鼠睾丸进行免疫细胞化学分析。

（8）向脂肪细胞（adipogenic cells）、骨细胞、软骨细胞的体 外分化

收集第5代、第13代以及第20代的HTSCs，以及收集第20代的再 分选的HTSCs。作为对照组，还收集了第72代的hESCs以及第3代的B M-MSCs，分析了向3个胚层的细胞层的分化能力。将所有细胞重悬， 在6孔板中重新涂抹。24小时后更换培养基，将未贴壁细胞去除，后 将贴壁细胞培养至融合。之后，将所述细胞在不同的培养基中进行2 1天的培养，所述培养基分别是为了脂肪形成、骨形成、软骨形成的 培养基（Invitrogen）。脂肪分化是利用油红O（Oil Red,西格玛奥德 里奇）进行染色，使其可视化。脂肪形成特异性基因（PPARγ及C/E BPα）的表达利用实时RT-PCR进行分析。骨分化是利用茜素红S（A lizarin Red S，西格玛奥德里奇）进行染色，使其可视化，并且通过 骨形成特异性基因（COLⅠ以及CBFAⅠ）的表达进行分析。软骨分 化利用阿尔新蓝（Alcian blue，西格玛奥德里奇）进行染色，使其可 视化，并且通过软骨形成特异性基因（COMP以及SOX9）的表达进 行分析。

（9）向神经细胞（neurogenic cells）的体外分化

在含有N2添加剂（Gibco）、2mM的L-谷氨酰胺（Gibco）以及青 霉素/链霉素溶液（1×,Gibco）的DMEM-F12培养基（Gibco）中，诱 导了HTSCs以及BM-MSCs向神经的分化（neurogenic differentiation）。 3天后，固定所述细胞后，为免疫细胞化学分析进行了处理。形成像 神经球（neurospheres）的漂浮的球形细胞（spheric cells）后，剥离 细胞（1×10⁶个细胞/ml），重新涂抹于包被纤维连接蛋白（10μg/ml, 西格玛）的培养皿中，用添加了2mM的L-谷氨酰胺、10ng/ml表皮生 长因子（EGF,英俊）、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） 以及青霉素/链霉素溶液的神经祖细胞培养基（Neural Progenitor Bas al Medium,NPBM,Cambrex,One Meadowlands Plaze,NJ）培养3 天，且每天添加生长因子。后将细胞涂抹到添加了0.5μM全反式维甲 酸（all-trans-retinoic acid，西格玛）、1%胎牛血清（Gibco）、5%马血 清（Gibco）、1%的N2添加剂以及青霉素/链霉素溶液的神经培养基（G ibco），开始了最后的神经分化。细胞分化进行了10-14天。在显微镜 下观察神经分化，且用RT-PCR进行确认。

（10）HTSCs向胰岛素分泌细胞的体外分化

根据制造商的指南，利用特定培养基（Bcell Bio,Seoul,Korea) (Kang,H.M.,et al.Insulin-secreting cells from human eyelid-derive d stem cells alleviate type I diabetes in immunocompetent mice.Ste m Cells27,1999-2008(2009))将细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞。 通过测定分泌至培养基的胰岛素以及C肽分析分化效率。即将细胞用 包含0.5%牛血清白蛋白的低糖（5.5mM）-DMEM处理12小时后，用 高糖（25mM）-DMEM在37℃条件下，刺激2小时。根据制造商的指 南，利用人胰岛素及C肽酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（Merc odia,Winston Salem,NC），测定释放至培养基的胰岛素以及C肽的 量。在分化细胞中的胰岛素以及C肽的合成是通过RT-PCR进行确认。

（11）向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞的体内分化

小鼠相关的实验得到了CHA医科大学动物实验伦理委员会（Inst itutional Animal Care and Use Commitee）的承认。将BALB/c雌性 小鼠（6周龄）分成了4个组别。将包含HTSCs（30mg）的载有右旋 糖酐（DEX）的微球（30mg）皮下移植至12只裸鼠的背部。第Ⅰ组 为对照组（n=3），将载有DEX的微球注射至雌性小鼠背部皮下。第Ⅱ 组（n=3）将涂覆有100ng/ml的TGFβ3的微球注射至雌性小鼠背部皮 下。第Ⅲ组（n=3）将涂覆有100ng/ml的BMP-2的微球小心注射至雌 性小鼠背部皮下。第Ⅳ组（n=3）将涂覆有50ng/ml的IGF以及bFGF（英 俊）的微球注射至雌性小鼠的背部皮下。处理四周后，通过注射过量 的麻醉剂（氯胺酮）处死小鼠，将包含注射部位的周围皮肤（2×2cm ²）小心切开，进行后续生物学检查。获取组织后，通过RT-PCR式反 应、蛋白免疫印迹、免疫细胞化学以及免疫组织化学，确认其体内分 化。

（12）向双侧海绵体神经粉碎损伤（BCNCI）大鼠模型，移植 HTSCs

将32只，12周龄的雄性斯普拉-道来氏大鼠，随机分成4个组别（每 组8只）：1）仅开腹的组别（假手术组）；2）BCNCI以及滴注0.1mol/ L的磷酸盐缓冲液（损伤组）；3）BCNCI以及在前列腺周边滴注BM- MSCs，在100μl灭菌PBS中混悬1×10⁷个细胞（BM组）；4）BCNIC以 及在前列腺周边滴注HTSCs，在100μl灭菌PBS中混悬1×10⁷个细胞（H TSC组）。注入之前，为追踪干细胞利用Cell Tracker^TMCM-Dil（C700 0，Invitorgen）标记干细胞。

移植4周后，利用海绵体神经电刺激（3V、0.2ms、50s、20HZ）， 在损伤部位周边评价勃起功能（图7a）。记录全身平均血压（mean ar terial pressure，MAP）以及海绵体内压（intracavernosal pressure,I CP），进行了电分析（Powerlab,ADInstruments,Colorado Springs,C o,USA,图7b）。比较不同组别间的ICP/MAP比例。测定勃起功能后， 获取各个大鼠前列腺叶（Prostate lobes）。核以及神经染色（Nuclear  and neural staining）利用苏木精-巢蛋白抗体（圣克鲁兹生物技术） 进行。并且，在各个大鼠的粉碎损伤部位，利用人特异性抗体（Ste m-121^TM）以及神经元特异性β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulin classⅢ）（Tu  JI，圣克鲁兹生物技术）进行免疫细胞化学分析。

（13）统计分析

所示实验均至少重复了3次，数据以平均值±标准误差（SEM）的 形式表示。组间差异利用方差分析（ANOVA检验）进行分析。P值＜ 0.05时，被视为具有统计学显著性差异。CD34的表达以及3个胚层系 统（lineasge）的特异性基因关联性，通过皮尔森相关系数（Pearson’ s coefficient of correlation）进行分析。

2.试验结果

（1）人HTSCs的分离及增殖

15名捐赠者的平均年龄为36.7±6.7（29岁以及55岁之间）。人睾丸 组织中，CD34阳性细胞主要分布在生精小管内以及生精小管之间。C D31仅定位在血管，αSMA仅存在于生精小管中（图1）。并且，CD34、 CD73、CD31以及αSMA的表达模式，在闭塞性以及非闭塞性患者睾 丸中非常类似。但是，CD73的表达非常少，且在生精小管的基底膜 （basal lamina）中没有表达。并且，在睾丸中未观察到CD34/CD31 双阳性细胞。在人睾丸中，为定位CD34/CD73双阳性细胞，制备活检 的生精小管的冷冻切片（cryosections），利用CD34以及CD73抗体进 行染色。CD34/CD73双阳性细胞广泛分布于生精小管外[间质细胞 内]，但其数量较少（图1）。

先将收集的间质细胞培养至第2-3代（图9a）。体外培养时，将分 离自人睾丸生精小管的贴壁细胞，利用CD73进行分选。所述细胞具 有间充质干细胞样的形态，且能持续表达CD73抗体，因此将其称为 睾丸来源的干细胞（testis-derived stem cells，TSCs）。TSCs包括两种 细胞群（CD34阴性以及CD34阳性）。CD34阳性的TSCs利用磁性细胞 分选法（megnetic activating-cell sorting，MACS）进行分选后，重 新涂抹至培养皿。由于利用CD73分选的TSCs中，CD34阳性细胞占极 少数（图2a），因此相比于CD34阴性TSCs，CD34/CD73共同表达为阳 性的细胞数特别少[100mg的活检组织中约有1000个细胞（0.02%）]。 并且，由于其初期数量特别少，因此CD34/CD73双阳性细胞直至培养 14天后才达到80%融合度，其表示该细胞的第1代（p1）。然而，其一 旦经过额外的增殖，CD34/CD73双阳性细胞显示了很高的增殖活性； 因此，将其称为高增殖性睾丸来源的干细胞（high proliferative-TSCs， HTSCs）。每3-4天向细胞提供新的培养基，直至第26代或者第27代一 直维持间充质干细胞样形态（图3）。与此相比，BM-MSCs以及TSCs 分别维持间充质干细胞样形态至第6代以及第13代，而之后则显示老 化（senescent）的形态（细胞肿大（gross enlargement）以及扁平化 （flattening），图3a）。在整个培养过程中，CD34阴性/CD73阳性的T SCs的显示出了平均34.3±2.1的细胞群倍加数，且平均从每个患者获取 的该细胞总数为2.2×10¹³个。与此相比，HTSCs显示出了平均67.3±2. 1的细胞群倍加数，且平均从每个患者获取的该细胞总数为5.6×10¹⁶ 个（图3b）。

（2）HTSCs（CD34/CD73双阳性TSCs）的特性分析

为了对HTSCs进行特性分析，进行了流式细胞分析、免疫细胞化 学以及RT-PCR。在第3代细胞中，利用多种标记物进行了多色（mult i-color）流式细胞分析。HTSCs对于CD34（96.53%±3.5）、CD73（95. 65%±1.5）、Ⅰ型主要组织相容性复合体抗原（class I major histocom  patibility(MHC)，HLA ABC）、CD29、CD44、CD90、CD105以及C D166显示比较强的阳性；对于CD14、CD133以及StroⅠ显示比较弱的 阳性；并且，对于CD31、CD45、HLA DR、TRA-1-60、SSEA3、SS EA4、TRA-1-81，c-Kit以及CD140呈阴性（图10）。

根据免疫细胞化学分析确认了HTSCs同时表达CD34以及CD73， 而TSCs和BM-MSCs仅表达CD73，而并不表达CD34（图2b）。并且， 根据流式细胞分析结果可知，HTSCs不表达多能万能性（pluripotent） 标记物c-Kit、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3以及SSEA4，且也不表 达OCT4（图2c）。

为了分析生殖细胞以及体细胞的污染，利用生殖细胞标记物（G FRα1以及Thy-1）、睾丸间质（Leydig）细胞标记物（3β-HSD）以及 管周肌样细胞（peritubular myoid cell）标记物（肌间线蛋白以及αS MC），采用免疫细胞化学法分析了HTSCs。如图9a所示，包含多种体 细胞的初始培养的细胞中，存在少数的CD34阳性细胞。根据CD73以 及CD34分选后，大部分细胞在第3代中表达了CD34，然而不表达对 生殖细胞或者睾丸体细胞的标记物。分选后第8代（p8）之后，CD34 阳性细胞数发生了显著性减少。虽然，没有再次检测出对生殖细胞以 及睾丸间质细胞的标记物，但对于肌间线蛋白以及αSMC的信号，重 新出现在了CD34阴性细胞中（图9b至图9d）。

为分析在体外长期增殖过程中，HTSCs的遗传稳定性，在第5代、 第13代、第20代以及第30代进行了核型分析，结果显示持续维持了二 倍体核型（46，XY），未发生染色体异常（chromosomal aberrations） （图11a）。并且，通过逆转录聚合酶链式反应证明了在第5代、第13 代或者第20代的HTSCs表达了极低水平的多能万能性相关OCT4，SO X2以及NANOG基因，并且不表达生殖细胞特异性的VASA mRNA （图11b）。

为确定HTSCs是否显示干细胞的其他典型特征，对分离出的HTS Cs进行了集落形成分析，并将其结果与BM-MSCs比较。HTSCs形成 了典型的干细胞集落，且集落形成效率显著高于BM-MSCs（分别为1 5.2±2.1%和1.0±0.1%，图12a）。然而，在两种干细胞中未观察到造血 细胞的集落（图12b）。为确定肿瘤形成能力，将HTSCs注入至SCID 小鼠肾内膜以及睾丸中。到注入后12-16周，注入至10只小鼠的所有H TSCs株，均没有形成肿瘤，但少数注入的人HTSCs（Stem-121^TM阳性 细胞）仍留在了睾丸中（图13）。

（3）长期培养期间CD34表达变化以及依据分流的细胞群的恢 复

分析了在长期培养HTSCs期间，CD34阳性细胞的细胞群。随着 持续的培养，CD34阳性细胞的细胞群逐渐减少（图4b）。HTSCs培养 至第15-20代时，CD34阳性细胞群几乎消失。以此为起点，细胞的倍 增数时间开始增加，形态也发生了变化（图3a以及图4a）。在第8代时， 利用CD34通过MACS对HTSCs进行再分选后（再分选的HTSCs），分 析了其增殖。如图4c所示，再分选的HTSCs中，CD34阳性细胞的细 胞群在额外的8代期间维持后减少，其重新增殖至第30代。将所述再 分选的HTSCs，在第18代时利用CD34进行再一次分选时（双重再分 选的HTSCs）,所述双重再分选的HTSCs的增殖维持至第36代（p36） （其中双重再分选的HTSCs中，倍增数为79.8±2.4以及1.3×10¹⁹个细 胞；再分选的HTSCs中，倍增数为81.1±1.5以及1.84×10²⁰个细胞）（图 4c）。

（4）向软骨细胞、脂肪细胞、骨细胞的体外分化

收集第5代、第13代以及第20代的HTSCs进行再分选后（第20代； 分选后的第20代中），将其在软骨细胞分化培养基中分化3周。将第3 代的BM-MSCs以及第3代的TSCs作为对照组使用。由HTSCs、TSCs 以及BM-MSCs诱导出的细胞，被多糖类生成物标记物阿尔新蓝所染 色。然而，HTSCs来源的软骨细胞中的软骨形成基因COMP以及SOX 9的mRNA水平显著高于BM-MSCs来源的软骨细胞（图5a）。随着持 续的传代培养，在HTSCs中COMP以及SOX9的表达逐渐减少，然而 在再分选的HTSCs中则维持。

为测定其脂肪形成能力，将HTSCs在脂肪形成培养基中培养3周。 将第3代的BM-MSCs以及第3代的TSCs作为对照组使用。在此条件下， 从HTSCs来源的脂肪细胞诱导出的细胞，显示出了含有细胞间脂肪滴 （intracellular lipid droplets）的含脂肪细胞（lipid-laden）的典型形 态，且对油红O染色呈阳性。并且，从BM-MSCs及初期传代的HTSC s分化的脂肪细胞相似地表达脂肪形成基因PPARγ以及C/EBPα（图5 b）。但是，在TSCs中其水平非常低。随着持续的培养，在HTSCs中P PARγ以及C/EBPα的表达水平随着持续的培养逐渐减少，然而使再分 选的HTSCs分化时则可以维持。

还将HTSCs、TSCs、BM-MSCs在骨形成培养基中培养了3周。在 此条件下，从所有HTSCs以及BM-MSCs诱导出的细胞，对于钙生成 物的标记物茜素红S染色呈阳性。并且，两种种类的细胞均显示出了 骨细胞标记物基因COLⅠ以及CBFAⅠ类似的表达水平（图5c）。但在 TSCs中，染色的强度以及骨细胞基因表达均较低。

（5）向软骨细胞、脂肪细胞、骨细胞分化后，多种干细胞的基 因表达谱

通过测定与软骨化、脂肪细胞化以及骨细胞化相关的特异性基因 的相对表达水平，测定了胚胎干细胞（ESCs）、BM-MSCs、脂肪来源 hMSCs（AD-MSC）、TSCs以及HTSCs的分化能力（图14）。HTSCs 的软骨分化能力显著高于BM-MSCs、AD-MSC以及TSCs（p≤0.001）， 但未能达到ESCs的水平。HTSCs的脂肪形成能力与ESCs以及BM-MS Cs相当，且显著优于AD-MSC以及TSCs。

（6）向神经细胞的体外分化

将第5代、第13代以及第20代的HTSCs，在第20代进行再分选的H TSCs以及第3代的BM-MSCs，在神经元性步骤I的培养基培养3天。在 此步骤的最后，来源于HTSCs以及BM-MSCs的一部分细胞，对于抗- 巢蛋白抗体呈阳性染色（图15a）。将这些巢蛋白阳性细胞在神经元性 步骤II的培养基再次培养3天时，来源于HTSCs以及BM-MSCs的形态 变化成了具有两极形态（bipolar form）特征的神经。并且，在来源 于HTSCs以及BM-MSCs的所述两极细胞中，观察到了GFAP以及β-微 管蛋白3的神经细胞特异性基因的表达（图15b）。

（7）向胰岛素分泌细胞的体外分化

还利用HTSCs、再分选的HTSCs以及BM-MSCs多能在体外分化 成胰岛素分泌细胞，从而测定其中胚层系统多能。在胰岛素生成培养 基（insulinogenic media）中培养后，通过低（5.5mM）或高（25mM） 浓度的葡萄糖刺激细胞，对胰岛素分泌活性（尤其是对细胞的葡萄糖 依赖性分泌）进行分析。未诱导分化细胞时，在HTSCs（第5代、第1 3代、第20代以及再分选的第20代）以及BM-MSCs（第3代）中，葡 萄糖的刺激后，释放至培养基的胰岛素以及C肽的量类似。将相同细 胞在分化培养基中培养时，通过高葡萄糖刺激，细胞释放的胰岛素以 及C肽显著增加。利用高葡萄糖刺激时，第5代以及第13代的HTSCs 分泌的胰岛素以及C肽的量与BM-MSCs类似。结果显示，在第20代的 HTSCs的胰岛素以及C肽的分泌能力减小，但在第8代时经过以CD34 再分选后能避免所述分泌能力的减小，使细胞在第20代时仍能维持比 较高的胰岛素以及C肽的释放（图6a以及图6b）。并且，在胰岛素生成 分化培养基中培养的HTSCs以及BM-MSCs，均能表达胰腺β细胞标记 物的胰岛素以及NGN3，但在非分化细胞中则没有表达（图6c）。

（8）向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞的体内分化

将与包含生长因子的微球混合的HTSCs分成4个组别，移植到了1 0只裸BALB/C雌性小鼠的背部皮下。通过RT-PCR检测包括PPARγ、C /EBPα、CBFAⅠ、COLI、SOX9以及COLII的分化相关基因的表达。 用含有特异性生长因子的微球进行移植的，分化HTSCs中，脂肪、骨、 软骨细胞的基因特征呈现高表达（图16a）。

蛋白免疫印迹分析显示了在这些小鼠血清中，相应蛋白质的存在 （图16b）。并且，通过特异性染色或者特定标记物的免疫细胞化学分 析，在体内以及体外均确认了HTSCs的脂肪、骨、软骨分化（图16c 以及图16d）。

（9）通过移植的HTSCs的，对于双侧海绵体神经粉碎损伤的功 能恢复

为确认在临床相关的细胞疗法中，HTSCs的应用可行性，使用了 双侧海绵体神经粉碎损伤的大鼠模型。将HTSCs或者BM-MSCs注射 至双侧海绵体神经粉碎损伤的大鼠的前列腺周边。通过评价粉碎损伤 部位的功能恢复、全身平均动脉压以及阴经海绵体内压，比较了HTS Cs与BM-MSCs的治疗效果（图7a以及图7b）。损伤组（0.20±0.01）的 平均ICP/MAP比例显著小于假手术组（0.70±0.02）（p＜0.001）（表2， 图7c）。在前列腺周边注入BM-MSCs或者HTSCs时，与损伤组相比， 可显著增加ICP/MAP的比例（p＜0.001）。刺激海绵体神经的末端部 位，在BM-MSCs组（0.44±0.05）以及HTSCs组（0.44±0.07）中均显 示出了勃起反应的部分恢复，但两组之间没有显著性差异。利用Cell  Tracker^TMCM-Dil，在经过处理的动物前列腺中，检测出了人来源的 细胞（红色），其被证明为是TuJI（神经）阳性，这能证明注入的HT SCs融入进了大鼠海绵体神经周围，且分化成了神经细胞（图7d）。并 且，还确认了在粉碎损伤部位中可观察到Stem-121^TM（FITC，绿色， 箭头）及TuJI（Cy5，紫红色，箭标）的双阳性细胞，以及少数CellT  racker^TMCM-Dil（红色，开放箭头）。因此，其表示注入的HTSCs能向 神经元分化并融合（图7e）。

表2

（10）CD34表达与细胞分化的相关关系

分析了表达CD34的细胞比例和细胞的分化程度。随着表达CD34 的细胞比例，在连续的传代培养（第5代、第13代以及第20代）过程 中减少，3个胚层系统的细胞（3germ layer lineage cells）的标记物 基因表达水平也发生了减少。中胚层（mesodermal）基因：PPARγ、 C/EBPα、COL I、CBFA I、COMP及SOX9；内胚层（endodermal） 基因：胰岛素及NGN；以及外胚层（ectodermal）基因：GFAP及β- 微管蛋白3的表达均显著性降低（图17a以及图17b）。

3.讨论

本研究中，本发明人从人睾丸组织分离HTSCs后，进行了特征分 析。自Kanastsu-Shinohara等的关于睾丸的小鼠多能精原干细胞的报告 （Kanatsu-Shinohara M,Inoue K,Lee J,et al.Generation of plurip  otent stem cells from neonatal mouse testis.Cell.2004；119：1001- 1012）以后，很多研究均将研究焦点放在了人对应细胞（counterpart s）的分离、特征分析以及增殖（Conrad S,Renninger M,Hennenlot ter J,et al.Generation of pluripotent stem cells from adult human  testis.Nature.2008；456：344-349；Kossack N,Meneses J,Shefi  S,et al.Isolation and characterization of pluripotent human spermat  ogonial stem cell-derived cells.Stem Cells.2009；27：138-149；G olestaneh N,Kokkinaki M,Pant D,et al.Pluripotent stem cells der ived from adult human testes.Stem Cells Dev.2009；18：1115-11 26；Mizrak SC,Chikhovskaya JV,Sadri-Ardekani H,et al.Embryo nic stem cell-like cells derived from adult human testis.Hum Repro d.2010；25：158-167）。这些分离的人细胞被认为是从精原干细胞而 来的，但对其确切的来源仍存在争论（onrad S,Renninger M,Henn  enlotter J,et al.Generation of pluripotent stem cells from adult hu man testis.Nature.2008；456：344-349；Tapia N,Arauzo-Bravo  MJ,Ko K,et al.Concise review：challenging the pluripotency of h uman testis-derived ESC-like cells.Stem Cells.2011；29：1165-1169； Chikhovskaya JV,Jonker MJ,Meissner A,et al.Human testis-deri ved embryonic stem cell-like cells are not pluripotent,but possess p otential of mesenchymal progenitors.Hum Reprod.2012；27：210-2 21）。总体来讲，以现有的研究，所有睾丸干细胞是从睾丸的生殖细 胞而来的，并不是来源于体细胞。所述细胞具有ESC样集落形态，在 干细胞基因表达的方面与人HTSCs具有不同的特性。虽然HTSCs显示 与人睾丸MSC样细胞以及BM-MSCs类似的形态和特性，但HTSCs在 初期同时表达CD34以及CD73，与其他公知的MSCs或者MSCs样细胞 不同，且其与MSCs现有的定义相反，所述MSCs现有的定义中MSCs 具有存在CD73、CD90以及CD105的膜抗原，但缺少其他细胞标记物 基因（CD34以及CD45）表达的特性。因此，HTSCs是新型的人睾丸 体细胞来源的干细胞/前体细胞。即CD34/CD73双阳性细胞几乎在体 内不存在（图1），其在初期CD73-分离的TSC细胞群中仅占不到0.03% 的比例（图2a）。并且，根据CD34/CD73双阳性细胞不存在于睾丸， 并且生精小管的基底层不表达CD73的发现（图1），本发明人假定CD 34/CD73双阳性细胞（HTSCs）存在于间质细胞，并且假设其可能是 对于间质细胞的间叶细胞（mesenchymal）或者前体细胞。

CD34一直被认为是造血干细胞的标记物，但实际上CD34在多种 非造血组织，例如血管内皮细胞以及软组织肿瘤（soft tissue neoplas m）中表达。在人脂肪来源干细胞中检测出了CD34的表达，但随着培 养时间逐渐减少，其可能与增殖能力、分化能力以及细胞的未成熟或 者干性有关联。由于CD73表达于多种MSCs中，为了从人睾丸活检样 品中分理出具有再生能力的干细胞本发明人将CD73与CD34一同作 为额外的筛选标记物。

CD34/CD73双阳性HTSCs，相比于CD34阴性/CD73阳性TSCs， 显示出了更高的增殖能力。将极少量的HTSCs培养至第23-32代之后， 可增殖至非常多的细胞群。所述细胞的增至以及分化能力与其CD34 水平具有很大的关系。如图17所示，CD34的表达与细胞分化状态呈 反相关。细胞随着分化成特定细胞形态，CD34的表达减少，这说明C D34是所述干细胞的干细胞性/未成熟性（stemness/juvenility）的标记 物。并且，研究表明CD34阳性细胞（即HTSCs）的比例以及其增殖 能力随着连续的传代培养而减少，这与所述脂肪来源的干细胞类似。 于此相比，通过30代的连续培养，显示CD73能持续呈高表达，其表 达不受培养时间的影响（图4b）。CD34的再分选扩大了培养的增殖能 力，并且提高了分化能力。CD34的再分选可去除CD34阴性（-）/CD 73阳性（+）细胞，留下CD34阳性/CD73阳性细胞。由于HTSCs向特 定细胞形态的分化引起CD34的低表达，且长时间的培养可引起通常 的老化以及分化，因此睾丸间质细胞的CD34表达程度可以是对于较 为新生且健康的干细胞的有效筛选标记物。并且，由于CD34的表达 与细胞的干性以及寿命密切相关，在睾丸间质细胞中CD34的过表达 或者延长表达，能否增加细胞的寿命以及可塑性（plasticity）就极为 重要。

虽然HTSCs具有与MSCs相同的特征，但是与ESCs则不同（图2c）。 本发明人直接对ESCs、BM-MSCs（第3代）、TSCs（第5代）以及HT SCs（第5代）等不同种类的干细胞的分化能力进行了比较。在体外以 及体内研究中，用能与BM-MSCs相比较的方法，可将HTSCs分化成 脂肪、骨、软骨细胞（图5以及图14）。当应用特定的方法时，HTSCs 可分化成神经细胞以及胰岛素分泌细胞（图15以及图6）。

在体内细胞移植研究中，未分化的HTSCs对于双侧海绵体神经粉 碎损伤的恢复起到了作用，并且在注入初始细胞4周后，对于损伤大 鼠模型的血流恢复起到了作用（图7）。为治疗前列腺癌的根治性前列 腺切除术，由于损伤沿前列腺后侧面存在的神经血管丛（海绵体神 经），经常会引起勃起功能障碍。本发明人发现了在粉碎损伤部位周 边（前列腺周边注入）注入HTSCs或者BM-MSCs后能够改善勃起功 能。实际上，本发明人在所述大鼠的海绵体神经内部发现了外源性H TSCs来源的神经元（图7e），并且还观察到了血压功能的改善。本研 究中注入HTSCs后，在损伤部位周边的一些神经元（TuJI阳性细胞） 还对于人细胞预染色标记物（CellTracker^TMCM-Dil）以及人特异性抗 体呈阳性，这说明注入的HTSCs具有移植后分化成神经元细胞的能力 （图7d以及图7e）。因此，患者被诊断为前列腺癌时，为了治疗之后 的勃起功能障碍，本方法可用于睾丸活检获得自体来源的HTSCs，并 对其进行扩增以及储存。

睾丸不仅包括生殖细胞，还包括多种不同种类的培养诱导的万能 干细胞。所述培养诱导的干细胞不会引起非常重大的伦理问题，可作 为患者特异性细胞治疗剂使用，但是干细胞株建立效率非常低，且分 离的细胞株在人体内没有进行特性分析（Ko K,Azauzo-Bravo MJ, Tapia N,et al.Human adult germline stem cells in question.Natur e.2010；465：E1；discussion E3）。并且，利用精原生殖细胞（sper  matogonial germ cells）建立的干细胞株注入至NOD-SCID小鼠后可形 成肿瘤（Seandel M,James D,Shmelkov SV,et al.Generation of f unctional multipotent adult stem cells from GPR125+germline prog enitors.Nature.2007；449：346-350），因此对于其能够用作临床上 治疗人类的药物仍存在疑问。本研究中，发明人使用特定培养条件以 及简单、高效的磁性细胞分选系统（100%分离率），建立了捐赠者的 多能干细胞，其中所述捐赠者包括具有正常（闭塞性无精子症患者2） 以及非正常睾丸生理（没有间质细胞的非闭塞性无精子症患者13）的 患者。一般人成体干细胞只能增殖有限代数，且经过分离以及体外增 殖时，迅速进入老化步骤（senescence phase）。并且，人成体干细胞 在体外增殖过程中显示非常高的染色体异常。本研究中，试验的细胞 株均未在免疫缺陷小鼠中形成肿瘤，且染色体完整性（chromosomal  integrity）也维持到第30代，这说明相对于胚胎干细胞，所述细胞株 是非常安全的替代物。并且，两种从男性捐赠者分离出的HTSCs间， 没有分化效率的差异，因此所述方法可适用于所有男性。

4.结论

本发明人发现人睾丸间质细胞中CD34/CD73共同表达与增殖能 力、分化能力、以及未成熟性或者干细胞性密切相关。因此，CD34 以及CD73可作为为了从简单的睾丸活检获得高增殖性的成体干细胞 的初期筛选标记物而使用。所述细胞可用于患者特异性细胞疗法，其 不会导致使用ESCs时的肿瘤形成或者伦理争论。并且，由于非常高 的增殖能力，所述同时表达CD34/CD73的HTSCs可对大多数需要利用 细胞进行的治疗有用。