一种负载5-氨基乙酰丙酸的富勒烯水溶性衍生物的合成方法与应用

摘要

本发明涉及负载5-氨基乙酰丙酸的富勒烯水溶性衍生物的合成方法与应用，可有效解决富勒烯衍生物的制备以及在制备治疗肿瘤药物中的应用问题，解决的技术方案是，将5-氨基乙酰丙酸溶解在去离子水中，加入氢氧化钠，混匀，加入无水乙醇，得淡黄色液体；将富勒烯加入甲苯中，超声，得富勒烯甲苯溶液；将淡黄色液体放入容器中磁力搅拌，逐滴加入富勒烯甲苯溶液，磁力搅拌，静置分层，下层液体旋转蒸发，加去离子水，先用无水乙醇沉淀，再用混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，重复3次，冷冻干燥，得5-氨基乙酰丙酸的富勒烯水溶性衍生物，本发明制备方法简单，制备条件容易满足，是治疗肿瘤药物上的创新。

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种负载5-氨基乙酰丙酸的富勒烯水溶性衍生物的合成方法与应用。

背景技术

 富勒烯（Fullerene），又名C₆₀，是碳元素的第三种同素异形体，是二十世纪重大发现之一。C₆₀是一种由60个碳原子构成的平截20面体，由C₅——C₅单价键组成的五边形和C₅——C₆双价键组成的六边形构建的封闭球面。C₆₀具有π电子体系，它可以吸收一定波长的光子能量，由基态变成激发态，激发态的C₆₀与组织内的氧发生作用，催化活性氧的生成和超氧负自由基团，这些产物与肿瘤细胞内的大分子作用，损伤细胞的结构和功能，从而杀伤肿瘤细胞。富勒烯作为光敏剂可用于肿瘤光动力治疗(photodynamic therapy, PDT )治疗。

光动力治疗(photodynamic therapy, PDT )是指给予光敏剂之后，在一定波长的光照射下，才产生治疗作用的一种新兴的治疗方法。PDT 的优势在于能选择性地消灭局部的原发、复发肿瘤却不损伤正常组织, 且可与放疗、化疗同时进行, 发挥一定的协同作用。

5-氨基乙酰丙酸( 5- aminolevulinic acid, 5-ALA )是近年来开发的第二代光动力药物。5-ALA 是一种体内血红蛋白合成过程的前体物，本身并不具有光敏性, 经 5-ALA 脱水酶等一系列酶作用下生成具有强光敏作用的内源性光敏剂原卟啉 IX( Protoporphyrin IX, PpIX)。正常情况下, 5-ALA 的合成受细胞内血红蛋白含量的调控，体内不会有过多蓄积。当给予过量的外源性 5- ALA 时, 调节机制被破坏,机体某些增殖较快的组织或某些肿瘤细胞即产生过量的 PpIX，导致PpIX的积聚。此时经过一定波长的光照射后发生光动力反应, 生成具有细胞杀伤作用的单线态氧或其他自由基等细胞毒性物质, 杀伤肿瘤细胞,达到治疗目的, 而邻近正常组织则不受任何影响。同时，肿瘤组织中选择性聚积的PpIX在405nm波长的激光照射下,发射出较强且具有635nm波长的红色荧光,而正常组织无此吸收峰或吸收峰很弱,可以将肿瘤和正常组织区分开来，因此5-ALA还可以用于早期肿瘤的荧光诊断(Photodynamic diagnosis,PDD)。

5-ALA是一种小分子水溶性化合物，在局部透皮给药、局部注射或全身给药等给药方式下，5-ALA 在肿瘤组织中聚集的浓度低，是 5-ALAPDT 不能彻底地杀伤肿瘤细胞的主要原因。因此，为了提高 5-ALAPDT的疗效，可从：1．提高肿瘤细胞吸收5- ALA 转换成原卟啉 IX 的能力，增强光动力反应效率；2．提高5- ALA 在组织中的渗透深度、分布的均匀性，对肿瘤的靶向选择性。若采用衍生物的形式即可实现，但至今未见有衍生物的公开报道。

发明内容

    针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种负载5-氨基乙酰丙酸的富勒烯水溶性衍生物的合成方法与应用，可有效解决富勒烯衍生物的制备以及在制备治疗肿瘤药物中的应用问题。

本发明解决的技术方案，是由以下步骤实现：

    1）将70-100mg 5-氨基乙酰丙酸溶解在800μL的去离子水中，加入100-120mg的氢氧化钠，混匀后，溶液中加入3mL无水乙醇，涡旋混匀5分钟，得淡黄色液体；

    2）将25mg富勒烯加入6-8mL甲苯中，超声5-10分钟，得富勒烯甲苯溶液；

3）将步骤1）制得的淡黄色液体放入容器中，在磁力搅拌下，逐滴加入步骤2）制得的富勒烯甲苯溶液，室温磁力搅拌24小时，静置分层，弃去上层无水乙醇、甲苯、水混合液，下层深棕色液体旋转蒸发，加入3-6mL去离子水，先用无水乙醇沉淀，再用0.45μm的混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，如此重复操作3次，冷冻干燥，得5-氨基乙酰丙酸的富勒烯水溶性衍生物。

本发明制备方法简单，制备条件容易满足，产品水分散性强，并且不会对富勒烯及5-ALA本身的特性进行破坏，可作为光敏剂用于肿瘤光动力治疗及肿瘤早期荧光诊断，是治疗肿瘤药物上的创新。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1

    1）将70mg 5-氨基乙酰丙酸溶解在800μL的去离子水中，加入100mg的氢氧化钠，混匀后，溶液中加入3mL无水乙醇，涡旋混匀5分钟，得淡黄色液体；

    2）将25mg富勒烯加入6mL甲苯中，超声5分钟，得富勒烯甲苯溶液；

3）将步骤1）制得的淡黄色液体放入容器中，在磁力搅拌下，逐滴加入步骤2）制得的富勒烯甲苯溶液，室温磁力搅拌24小时，静置分层，弃去上层无水乙醇、甲苯、水混合液，下层深棕色液体旋转蒸发，加入3mL去离子水，先用无水乙醇沉淀，再用0.45μm的混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，如此重复操作3次，冷冻干燥，得5-氨基乙酰丙酸的富勒烯水溶性衍生物。

实施例2

    1）将85mg 5-氨基乙酰丙酸溶解在800μL的去离子水中，加入110mg的氢氧化钠，混匀后，溶液中加入3mL无水乙醇，涡旋混匀5分钟，得淡黄色液体；

    2）将25mg富勒烯加入7mL甲苯中，超声7分钟，得富勒烯甲苯溶液；

3）将步骤1）制得的淡黄色液体放入容器中，在磁力搅拌下，逐滴加入步骤2）制得的富勒烯甲苯溶液，室温磁力搅拌24小时，静置分层，弃去上层无水乙醇、甲苯、水混合液，下层深棕色液体旋转蒸发，加入4.5mL去离子水，先用无水乙醇沉淀，再用0.45μm的混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，如此重复操作3次，冷冻干燥，得5-氨基乙酰丙酸的富勒烯水溶性衍生物。

    实施例3

    1）将100mg 5-氨基乙酰丙酸溶解在800μL的去离子水中，加入120mg的氢氧化钠，混匀后，溶液中加入3mL无水乙醇，涡旋混匀5分钟，得淡黄色液体；

    2）将25mg富勒烯加入8mL甲苯中，超声10分钟，得富勒烯甲苯溶液；

3）将步骤1）制得的淡黄色液体放入容器中，在磁力搅拌下，逐滴加入步骤2）制得的富勒烯甲苯溶液，室温磁力搅拌24小时，静置分层，弃去上层无水乙醇、甲苯、水混合液，下层深棕色液体旋转蒸发，加入6mL去离子水，先用无水乙醇沉淀，再用0.45μm的混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，如此重复操作3次，冷冻干燥，得5-氨基乙酰丙酸的富勒烯水溶性衍生物。

    实施例4

    1）将75mg 5-氨基乙酰丙酸溶解在800μL的去离子水中，加入115mg的氢氧化钠，混匀后，溶液中加入3mL无水乙醇，涡旋混匀5分钟，得淡黄色液体；

    2）将25mg富勒烯加入7.5mL甲苯中，超声9分钟，得富勒烯甲苯溶液；

3）将步骤1）制得的淡黄色液体放入容器中，在磁力搅拌下，逐滴加入步骤2）制得的富勒烯甲苯溶液，室温磁力搅拌24小时，静置分层，弃去上层无水乙醇、甲苯、水混合液，下层深棕色液体旋转蒸发，加入4mL去离子水，先用无水乙醇沉淀，再用0.45μm的混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，如此重复操作3次，冷冻干燥，得5-氨基乙酰丙酸的富勒烯水溶性衍生物。

 实施例5

    1）将95mg 5-氨基乙酰丙酸溶解在800μL的去离子水中，加入105mg的氢氧化钠，混匀后，溶液中加入3mL无水乙醇，涡旋混匀5分钟，得淡黄色液体；

    2）将25mg富勒烯加入6.5mL甲苯中，超声8分钟，得富勒烯甲苯溶液；

3）将步骤1）制得的淡黄色液体放入容器中，在磁力搅拌下，逐滴加入步骤2）制得的富勒烯甲苯溶液，室温磁力搅拌24小时，静置分层，弃去上层无水乙醇、甲苯、水混合液，下层深棕色液体旋转蒸发，加入5.5mL去离子水，先用无水乙醇沉淀，再用0.45μm的混合纤维素脂微孔滤膜抽滤，如此重复操作3次，冷冻干燥，得5-氨基乙酰丙酸的富勒烯水溶性衍生物。

本发明方法制得的产物经常规的紫外分光光度检测鉴定，5-ALA及C₆₀-5-ALA水溶液均在267nm处有紫外吸收峰，证明5-ALA化学键合到C₆₀分子上_，并经核磁共振氢谱分析证明¹H NMR（D₂O, δ/ppm）：8.43（s,C60-H），3.039-3.065(m,,CH₂)，2.407-2.603(m,,CH₂)，3.039-3.065(m,,CH₂)，1.327-1.338(m,,CH₂).说明5-ALA化学键合到C60分子上，确定为负载5-氨基乙酰丙酸的富勒烯水溶性衍生物。

富勒烯（C₆₀）本身具有强烈的疏水性，难以在生理介质中直接使用，用水溶性的5-ALA对C₆₀表面进行化学修饰合成C₆₀水溶性纳米衍生物，不但保存了C₆₀的球形结构和光敏性，同时加入了一些5-ALA独特的生物学活性。并且纳米颗粒对肿瘤组织有特殊的EPR效应（enhancedpermeability and retention effect，EPR effect）。这是基于肿瘤组织血管增生、血管内皮缺陷、淋巴回流受损等病理生理改变，纳米级别的颗粒容易渗透进入肿瘤组织深部后不易被淋巴系统清除，从而能够长时间地在肿瘤组织中聚集、滞留，增强了5-ALA对肿瘤组织的靶向选择性，并且提高肿瘤细胞吸收5- ALA 转换成原卟啉 IX 的能力，同时C60本身具有光敏性，因此将5-ALA负载在C60制备的纳米材料可以增强光动力反应效率，并经试验取得了有益的技术效果，有关试验资料如下：

本发明5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物作为光敏剂的应用分为体内和体外两部分。

1）体外：将制得的5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物溶解于水中制成溶液加入到肿瘤细胞A中进行培养，给药后4h用光源B照射，照射强度为5-20J/CM2，继续培养24h,测定肿瘤细胞A的存活率。

2）体内：将制得的5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物溶解于0.9%的氯化钠注射液中制成溶液，静脉注射到荷瘤小鼠C上，给药给药后4h用光源D照射，光照时间1-5min，测量荷瘤小鼠C的肿瘤体积大小。

上述步骤1中的肿瘤细胞A为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血癌，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑癌，小肠癌，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴道癌，睾丸癌，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。

上述步骤1中的光源B为：400-800nm的宽波长光源或者激光中的一种。优选405nm激光。

上述步骤2中的荷瘤小鼠C为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血癌，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑癌，小肠癌，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴道癌，睾丸癌，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。

上述步骤1中的光源D为：400-800nm的宽波长光源或者激光中的一种。优选405nm激光。

本发明5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物作为光敏剂来进行光动力学治疗深部肿瘤时，这些光源不能够穿透照射时，可通过适用部位的照射方法，来改善外部光源的穿透能力进行肿瘤治疗。

本发明5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物作为光敏剂可以制成任意的药物制剂剂型。比如：注射剂、注射用无菌粉针、分散剂、贴剂、凝胶剂、口服液体制剂等。本发明5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物可以加入各种制剂的添加剂，例如生理盐水、葡萄糖、缓冲溶剂、防腐剂等以便制成合适的剂型需要。给药方式可分为：静脉注射、肌内注射、瘤内注射、口服给药、透皮给药、皮下植入等。

本发明5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物作为肿瘤的荧光诊断剂在肿瘤治疗中的应用可分为体内和体外两部分：

1）体外：将制得的5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物溶解于水中制成溶液加入到肿瘤细胞A中进行培养，给药后4h，在荧光显微镜下，肿瘤细胞胞浆呈现红色荧光。

2）体内：将制得的5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物溶解于0.9%的氯化钠注射液中制成溶液，静脉注射到荷瘤小鼠C上，给药后4h,实体瘤分离后冷冻切片，在荧光显微镜下肿瘤组织呈现红色荧光。

上述步骤1中的肿瘤细胞A为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血癌，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑癌，小肠癌，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴道癌，睾丸癌，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。

上述步骤2中的荷瘤小鼠C为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血癌，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑癌，小肠癌，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴道癌，睾丸癌，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。

本发明作为光敏剂治疗肿瘤药物，经过多次试验，均取得良好试验结果，相关实验数据如下：

实验1：

通过光照射5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物，测定其对肿瘤细胞生长的抑制作用，体外测定其抗肿瘤活性。将B16-F10小鼠黑色素瘤细胞（由上海细胞库提供）用作待考察的肿瘤细胞。将B16-F10培养在含10%胎牛血清（FBS）和1%青链霉素混合液的DMEM中培养基中，培养箱条件为37℃,5%CO2，每2天传代1次，收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入200μL，细胞稠度调制8×103个/每孔，培养箱中孵育24h，加入浓度梯度（250、200、100、50、0μg/mL）的5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物，设置复孔5个-6个。光照组给药4h后，405nm激光照射强度2J/CM2-20 J/CM2，光照结束后避光孵育24h。对于非光照组直接避光孵育24h。终止培养，吸出含药培养基，每孔用PBS洗两遍，用SRB法检测肿瘤细胞存活率，计算公式：存活率=实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。当5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物浓度为200μg/mL时，光照组肿瘤细胞存活率仅为45.07±7.74%，而非光照组肿瘤细胞存活率为99.61±3.81%；衍生物浓度为0μg/mL时，光照组肿瘤细胞存活率为100.63±9.61%。

结果表明，当激光照射强度超过5J/CM2时，5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物的加入直接影响B16-F10肿瘤细胞的生长。非激光照射，5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物的加入不影响B16-F10肿瘤细胞的生长。

实验2：

光照后，5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物体内抗肿瘤活性测定。将B16-F10小鼠黑色素瘤细胞计数后，用生理盐水稀释成2×106个/mL细胞悬液，接种在小黑鼠右侧腹部皮下。接种肿瘤7天后，取其中肿瘤体积>100mm³的小鼠，随机分为4组，每组5只，具体分组如下：1）生理盐水组2）生理盐水光照组3）5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物光照组4）阳性对照5-氨基乙酰丙酸光照组。4组均采用静脉注射给药方式，其中光照组使用光源为405nm激光照射，功率为100mW，给药4h后照射肿瘤部位，每次为3分钟。每2天给药一次，每次注射剂量为100mg/kg，每次注射100μL，共给药5次。整个实验过程每日观察小鼠生活状态，每2d称小鼠体重并用游标卡尺测量小鼠黑色素瘤的长径（A）与短径（B），计算肿瘤体积。

结果表明，当光照给药5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物时，小鼠肿瘤体积的增加得到了明显抑制。5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物作为肿瘤的荧光诊断剂可以明显诱导肿瘤细胞产生红色荧光。

实验3：

将B16-F10小鼠黑色素瘤细胞（由上海细胞库提供）用作待考察的肿瘤细胞。将B16-F10培养在含10%胎牛血清（FBS）和1%青链霉素混合液的DMEM中培养基中，培养箱条件为37℃,5%CO2，每2天传代1次，在6孔板每孔中放入盖玻片1片，收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度1×105个/mL，6孔板每孔加入1.5mL细胞悬液，培养24小时，用PBS冲洗2次，加入含100μg/mL5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物的DMEM培养液，培养4h后，用PBS冲洗2次，取出盖玻片，放在载玻片上，荧光显微镜下镜检。

结果表明，在荧光显微镜观察，5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物可诱导肿瘤细胞胞浆中产生红色荧光，Hochest33342核染后，胞浆中产生明显红色荧光，而细胞核被Hochest33342染成蓝色。

实验4：

将B16-F10小鼠黑色素瘤细胞（由上海细胞库提供）用作待考察的肿瘤细胞。将细胞按1×105个/mL密度接种于6孔培养板中，待其贴壁进入对数生长期后，吸出培养液，PBS液轻轻漂洗后弃去，加入含5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物的培养液，2h后终止培养，PBS洗2次，再加入新鲜培养液培养4小时，终止培养，PBS洗2次，收集细胞，探头超声破碎细胞，1200转/min低温离心15min，取上清20μL进样。荧光色谱条件为：1）流动相：甲醇：乙腈：乙醇=50:40:10,2）pH值为7.0，3）流速为1mL/min，4）激发波为403nm，发射波长为628nm，5）色谱柱：ODS-C18柱。

结果表明，荧光高效液相检测显示给药后2小时，每10⁵个细胞中，原卟啉 IX的含量为6.68ng/mL，给药后5小时，每10⁵个细胞中，原卟啉 IX的含量升高至57.14ng/mL， 5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物可诱导肿瘤细胞中原卟啉 IX升高。

实验5：

5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物体内原卟啉 IX测定，将B16-F10小鼠黑色素瘤细胞计数后，用生理盐水稀释成2×106个/mL细胞悬液，接种在小黑鼠右侧腹部皮下。接种肿瘤7天后，取其中肿瘤体积>100mm3的小鼠，采用静脉注射给药方式，注射给予5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物氯化钠溶液，2h,3h,4h后，处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织，加入1mL去离子水，组织匀浆5min，光镜显微镜下观察无完整细胞结构，1200r/min，低温离心15分钟，取上清0.3mL，加入甲醇0.7mL，涡旋混匀1min，1200r/min，低温离心15分钟，取取上清20μL进样。荧光色谱条件为：1）流动相：甲醇：乙腈：乙醇=50:40:10,2）pH值为7.0，3）流速为1mL/min，4）激发波为403nm，发射波长为628nm，5）色谱柱：ODS-C18柱。

结果表明，荧光高效液相检测，给药后2小时，每克肿瘤组织中，原卟啉 IX的浓度为63.64ng/g, 给药后4小时，每克肿瘤组织中，原卟啉 IX的浓度为416.98ng/g；而在心、脾中未检测到原卟啉 IX；肺中原卟啉 IX的最高浓度仅为126.16 ng/g，其他脏器中原卟啉 IX的最高浓度均低于20 ng/g.给药后5-氨基乙酰丙酸的富勒烯纳水溶性衍生物可诱导小鼠肿瘤组织中原卟啉 IX升高。

本发明与现有技术相比具有以下突出的有益技术效果：

1）本发明5-氨基乙酰丙酸的富勒烯水溶性衍生物，制备方法简单，制备条件容易满足，产品水分散性强，物理及化学稳定性好，原料来源丰富，成本低，并且不会对富勒烯及5-ALA本身的特性进行破坏；

2）本发明5-氨基乙酰丙酸的富勒烯水溶性衍生物，可作为抗肿瘤光动力学治疗的一种良好光动力学光敏剂。光照时可发挥抗肿瘤活性，而不光照时，抗肿瘤活性较小；

3）本发明5-氨基乙酰丙酸的富勒烯水溶性衍生物，可诱导肿瘤组织中原卟啉 IX升高，在外加绿光光源照射下，呈现红色荧光，可作为肿瘤的荧光诊断剂用于肿瘤的检测及治疗，是治疗肿瘤药物上的创新。