5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的克隆表达及生物合成5-氨基乙酰丙酸的研究

摘要

本文从微生物中克隆得到了ALA合成酶基因，构建了高产5-氨基乙酰丙酸的工程菌，通过对工程菌培养条件的优化，大幅度提高了ALA的产量。 研究工作的主要创新点和进展包括：1)分别从放射形土壤杆菌(Agrobacteriumbacteriumzju-0121)和类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)细胞中克隆得到了5-氨基乙酰丙酸合成酶(5-aminolevulinicacidsynthase，ALAS)hemA基因，通过对基因的序列分析，发现来自放射形土壤杆菌的hemA基因属于一个新的基因，而来自类球红细菌的hemA基因第335位的氨基酸发生了突变。 2)分别构建了含放射形土壤杆菌和类球红细菌hemA基因的多个表达质粒并转化到大肠杆菌中。通过对胞外5-氨基乙酰丙酸产量和5-氨基乙酰丙酸合成酶的比活力进行比较，发现用来源于放射形土壤杆菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因所构建的重组菌E.coliBL21(DE3)(pET28-A.R-hemA)具有最高的ALA产量和ALAS活力。 3)研究了重组菌E.coliBL21(DE3)(pET28-A.R-hemA)的摇瓶发酵条件。考察了初始葡萄糖浓度、溶氧、温度、前体及抑制剂对重组菌发酵生产5-氨基乙酰丙酸的影响。确定了最佳的诱导条件和培养条件。在最适发酵条件下，重组菌E.coliBL21(DE3)(pET28-A.R-hemA)摇瓶发酵的5-氨基乙酰丙酸的产量可达1.3g/L，比优化前(没加前体)提高了16.2倍。 4)利用5L的发酵罐进行工程菌培养生产5-氨基乙酰丙酸的研究，对影响产物产量的因素，如：初始葡萄糖浓度、溶氧、pH值、培养方式进行了考察，在优化条件下，发酵罐中的5-氨基乙酰丙酸的产量可达到3.1g/L，比摇瓶发酵提高了238.5％。以5L发酵罐分批发酵的实验数据为依据，对5-氨基乙酰丙酸发酵动力学进行了研究，分别建立了菌体生长、底物消耗和产物生产的非结构模型。该模型能较好的反映5-氨基乙酰丙酸的分批发酵过程。 5)针对目标产物ALA非蛋白质，外源基因所表达的产物ALA合成酶只是催化ALA合成的催化剂的特点，提出了基因工程菌培养时必需提高产量酶的催化活性而不是翻译得到的更多蛋白质的观点，并采用了较弱的诱导剂乳糖代替价格昂贵而且有毒的强诱导剂异丙基-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)的新方法进行ALA合成酶的诱导表达。在发酵罐分批培养中，胞外5-氨基乙酰丙酸的产量和ALA合成酶的比活力分别提高了43％和15％。 6)为了有利于ALA的分离和降低生产成本，采用了以D-葡萄糖代替乙酰丙酸作为ALA脱水酶的抑制剂的方法，通过合适的流加策略使胞外ALA的产量提高到了3.1g/L。 7)对影响发酵液中5-氨基乙酰丙酸稳定性的各因素进行了研究。发现高浓度5-氨基乙酰丙酸、高溶氧水平、高温、碱性条件和光的存在都将促使5-氨基乙酰丙酸发生的缩合反应。研究结果对工程菌培养条件确定及分离提纯工艺设计具有指导意义。

目录

文摘

英文文摘

第一章绪论

1.1引言

1.2 ALA在农业、医学等领域的应用与前景展望

1.2.1ALA在植物中的作用机理及农业上的用途

1.2.2医学领域的应用价值

1.3 5-氨基乙酰丙酸的稳定性

1.4生物合成5-氨基乙酰丙酸的机理

1.4.1碳四途径(Shemin pathway)ALA合成的调节机制

1.4.2碳五途径(C5 pathway)ALA合成的调节机制

1.4生产5-氨基乙酰丙酸的方法

1.4.1化学方法合成ALA

1.4.2生物法合成ALA

1.5重组大肠杆菌高密度培养

1.5.1影响重组大肠杆菌的高密度培养因素

1.6重组大肠杆菌分批发酵动力学研究进展

1.6.1微生物发酵培养中的结构模型

1.6.2微生物发酵培养中的非结构模型

1.7本课题拟研究的内容

参考文献

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌种和质粒

2.1.2工具酶及试剂

2.1.3培养基

2.1.4主要仪器

2.2实验方法

2.2.1分子克隆相关实验

2.2.2 A.radiobacter zju-0121基因组的提取

2.2.3大肠杆菌菌体浓度测定

2.2.4大肠杆菌菌体干重测定

2.2.5大肠杆菌细胞超声破碎及胞内蛋白提取

2.2.6蛋白浓度测定

2.2.7 SDS-PAGE电泳

2.2.8还原糖浓度测定

2.2.9葡萄糖浓度的测定

2.2.10 ALA合成酶比活性的测定

2.2.11发酵液中有机酸的测定

2.3 5-氨基乙酰丙酸的分析方法

2.3.1化学显色法

2.3.2反相高效液相色谱柱前衍生法分析

参考文献

第三章含5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的重组菌的构建

3.1引言

3.2材料和方法

3.2.1质粒

3.2.2菌株和培养基

3.2.3酶和试剂盒

3.2.4质粒提取和转化

3.2.5 5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS)基因的克隆与重组质粒的构建

3.2.6菌体培养及酶蛋白表达

3.3结果与讨论

3.3.1 5-氨基乙酰丙酸合成酶的序列分析

3.3.2宿主细胞及质粒选择的原则

3.3.3融合His·Tag对来源于类球红细菌的hemA基因表达ALAS和ALA合成的影响

3.3.4来源于A.radiobacter和R.sphaeroides的hemA基因对重组菌ALAS和ALA合成的影响

3.3.5质粒和宿主细胞对来源于A.radiobacter的hemA基因表达的影响

3.4小结

参考文献

第四章重组菌生产5-氨基乙酰丙酸发酵条件的初步研究

4.1引言

4.2材料和方法

4.2.1实验材料

4.2.2实验方法

4.3实验结果与讨论

4.3.1培养基的优化

4.3.2诱导条件的选择

4.3.3正交实验

4.3.4前体添加量的优化

4.3.5摇瓶装液量

4.3.6初始葡萄糖浓度对ALA产量的影响

4.3.7 ALA脱水酶抑制剂对工程菌生长和ALA合成的影响

4.3.8乳糖作为诱导剂对ALA合成酶表达及ALA合成的影响

4.4小结

参考文献

第五章 发酵罐培养基因工程生产5-氨基乙酰丙酸及其动力学研究

5.1引言

5.2材料和方法

5.2.1菌株

5.2.2种子培养基

5.2.3发酵培养基

5.2.4培养条件

5.2.5分析方法

5.2.6实验主要仪器

5.3结果与讨论

5.3.1影响重组菌罐上培养的各因素的优化

5.3.2 5-氨基乙酰丙酸分批发酵动力学

5.3.3重组菌的分批补料培养产ALA的研究

5.4小结

参考文献

第六章发酵液中5-氨基乙酰丙酸稳定性的研究

6.1引言

6.2材料和方法

6.2.1实验材料

6.2.2实验方法

6.2.3实验设备

6.3实验结果与讨论

6.3.1发酵液中不同ALA初始浓度的稳定性研究

6.3.2温度对发酵液中ALA稳定性的影响

6.3.3pH值对ALA稳定性的影响

6.3.4溶氧对ALA稳定性的影响

6.3.5光强对ALA稳定性的影响

6.4小结

参考文献

第七章结论与展望

7.1结论

7.2展望

攻读博士学位论文期间发表的论文

致射