甜菜夜蛾microRNA Sex-miR4924基因及其在害虫生物防治中的应用

摘要

本发明公开了一种能抑制甜菜夜蛾幼虫正常生长发育，并引发蜕皮障碍异常表型的microRNASex-miR4924，核苷酸序列为：5’-UGUAAGUAUCAACUGUUCUGUCGGGCA-3’。本发明利用新兴的高通量测序技术获得对害虫较高活性的microRNA基因，并且将人工合成的microRNA模拟物作为活性成分引入到害虫的生物防治中，为植物介导RNAi生物防治害虫提供重要的靶标基因资源。

说明书

技术领域

本发明属于害虫生物防治和基因工程领域，具体涉及一种能抑制甜菜夜蛾幼虫正常生长发育，并引发蜕皮障碍等异常表型的microRNA Sex-miR4924，同时利用该microRNA Sex-miR4924通过人工合成其模拟物作为活性成分饲喂昆虫，使昆虫体内过表达Sex-miR4924，导致Sex-miR4924的靶标基因Chitinase1显著下降，破坏了昆虫生长发育调控机制的平衡，使甜菜夜蛾不能正常生长发育，从而实现对甜菜夜蛾害虫的生物防治。

背景技术

甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)是对农业生产危害性最大的害虫之一，它不仅危害棉花还危害许多其它农作物，包括十字花科及豆科和茄科等作物。近年来，甜菜夜蛾的危害已成为长江流域及全国棉花主产区的主要灾害性害虫。它是继棉铃虫之外另一制约棉花产量和品质的一个重要害虫，随着杀虫剂长时间的广泛应用，甜菜夜蛾对有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类、昆虫生长调节剂等许多杀虫剂都产生了抗性，近半个世纪以来，人们通过各种方法来控制甜菜夜蛾的危害，包括人工杀虫剂的合成应用、转基因抗虫棉花种植等。当Bt蛋白的出现，将其作为杀虫剂或将其Bt-Cry1Ac蛋白基因Cry1Ac导入棉花，获得的Bt抗虫棉，能够有效控制甜菜夜蛾的危害。但近些年研究发现，甜菜夜蛾对转基因棉花的抗性水平存在逐年上升的趋势，因此研究甜菜夜蛾对Bt的抗性及寻找更有效的基因和途径已成为当前害虫生物防治及转基因研究的热点问题。

随着世界人口的急剧增长，如何提高农作物产量和品质是一个迫在眉睫的问题。据联合国粮农组织（FAO）估计，全世界每年因病虫草害损失约占粮食总产量的三分之一，其中因病害损失10％，因虫害损失14％，因草害损失11％。农作物病虫害除造成产量损失外，还可以直接造成农产品品质下降，出现腐烂、霉变等，营养、口感也会发生改变，甚至产生对人体有毒、有害的物质。因此，如何有效控制虫害是提高作物产量和品质的一个重要因素。化学农药的大量使用虽然可以有效杀灭害虫，但化学农药的不合理使用、滥用、过量使用等都严重破坏生态环境，不利于人类的可持续健康发展，并同时极易造成害虫的抗药性。随着现代分子生物学技术的快速发展，通过高通量small RNA测序技术、转录组测序技术等，挖掘害虫生物防治的靶标基因资源，再通过基因工程的办法，实现转基因技术改造植物，提高植物自身的抗虫害能力。上个世纪九十年代，科学家们利用转基因手段使农作物表达Bt蛋白以提高农作物对农业害虫的生物防治在全球被广泛使用。然而，最近的研究发现已有少数昆虫对Bt蛋白产生了抗性。有些昆虫的中肠上皮细胞中丢失了一类能与Bt蛋白结合的受体而使昆虫产生了抗性。因此，采用新的策略研究和开发新的靶标基因转基因抗虫作物等途径，越来越多地应用到对农业害虫的生物防治上来。其中高通量测序技术是近年来新兴的生命科学新亮点，它可以为开发转基因抗虫作物提供新的靶标基因资源，广泛应用于现代农业和分子育种工作上来。

高通量测序技术具体包括Small RNA测序、转录组测序、动植物基因组重测序、真菌基因组测序、外显子测序、甲基化测序、目的区域深度测序等方面。目前高通量测序仪以Illumina公司独立生产的Hiseq2000最为流行，其性能指标远超过Genome Analyzer，具体表现在测序数据的高通量、高精确度、重复性好、较低测序成本等。Hiseq2000具有独特边合成边测序核心技术，又融合了光学和信息系统设计及可逆中止化合物染料技术。目前广泛应用在动物、植物、细菌、真菌、病毒等转录组测序和基因组测序、注释方面。

目前Hiseq2000测序主要应用以下几个方面：

1）Small RNA测序：Small RNA是一类长度在20～30nt的RNA分子，主要包括miRNA、siRNA和piRNA。Small RNA能够调控基因的表达，在细胞的生长、发育、代谢等基础生物学过程中起着极为关键的作用。通过Small RNA深度测序就能够获得细胞或者组织中的全部Small RNA并对其定量分析等研究。测序过程为：首先将18-30 nt范围的Small RNA从总RNA中分离出来，两端分别加上特定接头后体外反转录做成cDNA再做进一步处理后，利用测序仪对DNA片段进行单向末端直接测序。高通量Small RNA测序可以一次性产生上百万条Small RNA序列，可以从中获得物种全基因组水平的miRNA图谱，实现包括新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、miRNAs聚类和表达谱分析等科学应用。

2）转录组测序：转录组测序（RNA-Seq）是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。例如，选择对甘蔗黑穗病高抗、高感的2个品种(高抗品种Q171和高感品种Funong40)，通过差异转录组测序，高抗的Q171甘蔗中只有甘蔗转录组数据，而高感品种Funong40除了甘蔗转录组数据还有病原真菌黑穗病的转录组数据，这样从转录组测序中就可以获得主要结论：即从高抗品种Q171中获得甘蔗抗黑穗病的抗病基因（R基因等）、防御基因、免疫基因等，同时从高感品种Funong40甘蔗中获得病原真菌黑穗病的致病因子基因，从而为揭示甘蔗抗黑穗病的分子机制打下基础。

3）动植物基因组重测序：它是对已知动植物基因组序列物种的个体进行基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行比较基因组学分析。通过全基因组重测序可以找到大量的单核苷酸多态性位点（SNPs）、拷贝数变异（Copy Number Variation，CNV）、插入缺失（InDel）、结构变异（Structure Variation，SV）等变异信息，从而获得生物群体的遗传特征。利用全基因组重测序有助于快速发现与动植物重要性状相关的遗传变异，缩短分子育种的实验周期。

4）真菌基因组测序：真菌属于较低等的真核生物，种类繁多，在自然界中分布广泛。文献资料显示，全世界约有150万种真菌，其中包含了大量能引发动植物病害的致病菌。因此，基于高通量测序技术开展真菌尤其是病原真菌基因组测序研究，对控制预防有害真菌、对人类生产生活都具有重要的理论意义和现实价值。而真菌基因组的阐明，将为真菌特性的分析提供有用的依据。随着高通量测序技术的成熟，基因组测序成本已大大降低，使得真菌基因组测序的步伐大大加快，目前真菌基因组学研究已经进入了一个快速增长时期。

5）外显子测序：外显子(expressed region)是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。外显子测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。是一种选择基因组的编码序列的高效策略，外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势，它能够直接发现与蛋白质功能变异相关的遗传突变。

6）甲基化测序：能够直接对任何物种的高甲基化片段进行测序，无需已知的基因组信息，它的检测范围广，覆盖整个基因组范围的甲基化区域。目前甲基化测序的方法主要有Bisulfite Sequencing （全基因组甲基化测序）和MeDIP-seq。前者是利用Bisulfite（亚硫酸盐）对基因组进行处理后上机测序。测序可精确到单个碱基的甲基化，能得到全基因组的甲基化位点信息，可用于全基因组DNA甲基化图谱制作。后者是利用MeDIP技术富集甲基化的DNA片段，再利用大规模测序技术测序。研究者可快速高通量的发现靶基因组上的甲基化区域，凭借较小的数据量快速有效地寻找基因组上的甲基化区域。

7）目标区域深度测序：是指利用特制的探针对感兴趣的蛋白编码区域DNA或某段特定序列进行捕获，富集后进行高通量测序的基因组分析方法。该方法能够获得指定目标区域的遗传信息，极大的提高了基因组中目标区域的研究效率，显著降低了研究成本。主要用于识别和研究与疾病、种群进化相关的编码区域内的结构变异。结合大量的公共数据库平台提供的数据，有利于更好地解释所得变异结构之间的关联和致病分子机理。

目前，国内外尚未有通过高通量测序技术获得甜菜夜蛾microRNA的方法和将其应用在害虫生物防治方面的报道。本发明通过高通量测序技术获得甜菜夜蛾microRNA Sex-miR4924，并验证了其具有调控Chitinase1基因导致甜菜夜蛾幼虫无法正常蜕皮而致死的作用。

发明内容

本发明目的在于提供一种能抑制甜菜夜蛾幼虫正常生长发育，并引发蜕皮障碍等异常表型的microRNA Sex-miR4924基因及其在害虫生物防治中的应用。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种能抑制甜菜夜蛾幼虫正常生长发育，并引发蜕皮障碍异常表型的microRNA Sex-miR4924，其核苷酸序列为：5’-UGUAAGUAUCAACUGUUCUGUCGGGCA-3’。 

根据上述的microRNA Sex-miR4924，通过人工合成Sex-miR4924的模拟物作为活性成分，饲喂甜菜夜蛾幼虫，实现Sex-miR4924在甜菜夜蛾害虫生物防治中的应用。

所述的应用，具体为：饲喂甜菜夜蛾害虫Sex-miR4924的模拟物，使害虫体内过表达Sex-miR4924，从而有效地下调Sex-miR4924的靶标基因Chitinase1，由于Chitinase1基因与昆虫正常生长发育密切相关，当Chitinase1酶功能缺陷或表达量显著降低时，即过量表达Sex-miR4924打破了害虫生长发育关键基因的平衡，甜菜夜蛾不能正常完成生长发育，实现害虫生物防治的目的。

高通量Small RNA测序中小RNA是生物体内一类重要的特殊分子，可以诱导靶标基因沉默，参与细胞生长、发育、转录、翻译及表达调控等许多生命活动的代谢过程。高通量Small RNA测序采用边合成边测序流程，一次可获得几个到几十个million的小RNA序列，能够快速准确地鉴定被测样品中含有的全部小RNA分子，并通过生物信息学软件分析和数据处理。本申请从127个甜菜夜蛾microRNAs中选择其靶标基因与甜菜夜蛾生长发育相关的10个microRNAs作为主要对象，将人工合成的10个microRNAs 模拟物进行甜菜夜蛾饲喂生测活性试验，结果显示其中3个生物活性最高，其中甜菜夜蛾microRNA Sex-miR4924的靶标基因为Chitinase1。为进一步验证其分子机制，采用qRT-PCR技术发现，饲喂甜菜夜蛾microRNA Sex-miR4924的模拟物后，自身靶标基因Chitinase1出现了明显下调，进而从分子调控角度证实了甜菜夜蛾microRNA Sex-miR4924可作为害虫生物防治的一个重要靶标资源。

本发明挖掘可用于甜菜夜蛾害虫生物防治的靶标基因资源，利用现代高通量small RNA测序技术获得甜菜夜蛾幼虫全部的microRNAs，采用生物信息学软件和分析技术，选择与甜菜夜蛾生长发育密切相关的靶标基因对应的microRNA作为重点研究对象，人工合成其模拟物作为活性成分，通过饲喂甜菜夜蛾幼虫，使昆虫体内过表达Sex-miR4924，导致Sex-miR4924的靶标基因Chitinase1显著下降，这时甜菜夜蛾就不能正常生长发育，并将引发蜕皮障碍等异常表型，破坏了昆虫生长发育调控机制的平衡，从而实现了在甜菜夜蛾害虫生物防治中的应用。

和现有技术相比，本发明的技术优势和有益效果：

1）本发明首次证实了microRNA Sex-miR4924能成功抑制甜菜夜蛾幼虫正常生长发育，并将引发蜕皮障碍等异常表型。

2）本发明的甜菜夜蛾microRNA Sex-miR4924是通过人工合成模拟物作为活性成分，使昆虫体内过表达Sex-miR4924，导致Sex-miR4924的靶标基因Chitinase1显著下降，由于几丁质酶是分解昆虫体壁和中肠围食膜几丁质的重要酶类，在调控昆虫正常生长发育中起着关键作用。当几丁质酶功能缺陷或者显著降低时，这将破坏昆虫生长发育调控机制的平衡，使甜菜夜蛾不能正常生长发育，实现了microRNA Sex-miR4924在甜菜夜蛾害虫生物防治中的应用。

3）本发明首次报道一种抑制甜菜夜蛾幼虫正常生长发育，并将引发蜕皮障碍等异常表型microRNA Sex-miR4924，可通过人工合成模拟物方法或农杆菌介导Sex-miR4924过表达的遗传转化，实现甜菜夜蛾的害虫生物防治应用。

附图说明

图1为饲喂甜菜夜蛾2龄幼虫microRNA模拟物后的体重变化情况；

图2为饲喂Sex-miR-10-1a、Sex-miR-4924、Sex-miR-9后对甜菜夜蛾生长发育的影响；图中A为清水对照组；B为Mimic Control阴性对照组；C为Sex-miR-10-1a试验组；D为Sex-miR-4924试验组；E为Sex-miR-9试验组；

图3 为饲喂Sex-miR-4924模拟物后的Chitinase1基因转录水平变化情况。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1：高通量Small RNA测序获得甜菜夜蛾幼虫microRNA

甜菜夜蛾卵块由湖北省农业科学院国家生物农药工程技术研究中心张志刚老师惠赠，幼虫生测饲料配方为：维生素C 5g，酵母粉40g，大麦粉50g，黄豆粉60g，36%醋酸14ml，琼脂20g，苯甲酸1g，苯甲酸钠3g，加水定容到1 L。甜菜夜蛾幼虫培养条件25℃，相对湿度70 %，光周期L:D=14:10。

选取甜菜夜蛾幼虫2、3、4、5龄幼虫各3只，采用Invitrogen公司Trizol试剂提取幼虫各个时期混样总RNA，小RNA测序送至深圳华大生物科技有限公司测序，具体为：1）甜菜夜蛾幼虫总RNA的高质量提取，2）甜菜夜蛾10-30 bp小RNA分离，3）文库构建，4）文库纯化，5）文库插入片段检测，6）文库定量，7）Hiseq2000 SE50测序。一共获得甜菜夜蛾幼虫的127个 microRNA基因，详见表1。

表 1. 测序获得甜菜夜蛾127个microRNAs

 

实施例2：预测甜菜夜蛾microRNA的靶标基因

综合已获得的甜菜夜蛾microRNAs和GenBank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/est）已知的甜菜夜蛾表达序列标签数据，使用miRanda软件（版本号3.0 http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do）预测获得microRNA的潜在靶标基因。从实施例1测序获得127个甜菜夜蛾microRNAs中选取预测靶标基因中与甜菜夜蛾生长发育密切相关的microRNA作为重点研究对象，其中各个microRNA预测靶标基因详细见表2所示。

表 2.与甜菜夜蛾生长发育密切相关的microRNA靶标基因预测

实施例3：人工合成10个甜菜夜蛾microRNA的模拟物

选择与甜菜夜蛾生长发育相关的10个microRNAs，委托上海吉玛制药技术有限公司人工合成其模拟物（合成引物见表3）。合成好的模拟物，加RNasefree水稀释至浓度为1 μM，饲喂2龄甜菜夜蛾幼虫。每个处理饲喂100 μL，每个处理设置3个生物学重复。

实施例4：饲喂模拟物对甜菜夜蛾生长发育的影响

甜菜夜蛾2龄幼虫饲喂试验分为11个处理组，分别为Sex-miR-10-1a试验组、Sex-miR-3403b试验组、Sex-miR-4924试验组、Sex-miR-745a试验组、Sex-miR-9试验组、Sex-miR-927试验组、Sex-miR-2试验组、Sex-miR-14试验组、Sex-miR-2766a试验组、Mimic Control阴性对照组和清水对照组（CK）。每个处理选用6个幼虫。每个处理设置3个生物学重复。

挑选生长表现一致的甜菜夜蛾2龄幼虫作为生测对象。每个处理中添加100 μL浓度1μM的模拟物，饲养条件为25℃，相对湿度70%，光周期L:D=14:10。饲喂模拟物后的第1~4 d，准确记录和观察甜菜夜蛾的生长、蜕皮、体重及死亡表型变化。

试验结果显示：Sex-miR-10-1a试验组、Sex-miR-4924试验组和Sex-miR-9试验组的甜菜夜蛾2龄幼虫个体，随时间发展体重增长速度明显降低（见图1）；同时这三个试验组均不能正常完成蜕皮，身上存在畸形特征，生长发育受到严重影响（见图2，图中A为清水对照组；B为Mimic Control阴性对照组；C为Sex-miR-10-1a试验组；D为Sex-miR-4924试验组；E为Sex-miR-9试验组）。而Sex-miR-3403b试验组、Sex-miR-745a试验组、Sex-miR-927试验组、Sex-miR-2试验组、Sex-miR-14试验组、Sex-miR-2766a试验组、Mimic Control阴性对照组和清水对照组的甜菜夜蛾2龄幼虫个体，随时间发展体重持续增加，个体增重明显（见图1），生长情况良好，正常完成蜕皮及龄期过渡，上述各试验组与阴性对照组、清水对照之间无明显差异。

实施例5：qRT-PCR检测Sex-miR-4924靶标基因Chitinase1转录变化

为了验证甜菜夜蛾异常表型变化与饲喂microRNA模拟物的相关性，本研究选择了甜菜夜蛾Sex-miR-4924与其靶标基因Chitinase1进行进一步的验证。当甜菜夜蛾2龄幼虫饲喂Sex-miR-4924模拟物第4 d后，对Sex-miR-4924试验组、Mimic Control阴性对照组和清水对照组幼虫的Chitinase1基因进行分析，每组随机选3头幼虫中肠组织，实验重复3次。

采用Invitrogen公司Trizol一步法提取甜菜夜蛾幼虫的总RNA，合成cDNA。通过实时荧光定量PCR技术检测Chitinase1基因饲喂microRNA模拟物处理后的转录变化情况。

Chitinase1基因实时定量PCR引物：

Se-Chitinase1-F:5’-GGACAATGGGCATCGTATC-3’，

Se-Chitinase1-R:5’-ATGGCATTCAGTAGTGAGCAA-3’。

选择甜菜夜蛾肌动蛋白β-actin作为内标基因，其实时定量PCR引物：

Se-actin-F:5’-CCCATCTACGAAGGTTACGC-3’，

Se-actin-R:5’- CTTGATGTCACGCACGATTT -3’。

实时荧光定量PCR扩增的反应体系及反应条件：每一个处理样品的总体积为25 μL，其中12.5 μL FastStart SYBR Green I，1μL cDNA和0.5μL PCR特异性引物即靶标基因Se-Chitinase1-F和Se-Chitinase1-R引物，内标基因Se-actin-F和Se-actin-R引物，加水补至25μL。反应条件为 95℃ 2 min，95℃30 sec，54℃ 30 sec，72℃30 sec，40个循环。

实时荧光定量PCR实验在Stratagene Mx3005P定量PCR仪上进行，采用2^?△△CT方法（Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25: 402-408）分析实时荧光定量PCR实验结果。

结果显示：饲喂Sex-miR-4924模拟物的试验组其Chitinase1基因转录水平明显低于Mimic Control阴性对照组和清水对照组，Chitinase1基因转录水平降低了50%，降低水平呈显著性差异；而Mimic Control阴性对照组与清水对照组之间不存在显著性差异（见图3），由此说明通过饲喂甜菜夜蛾幼虫Sex-miR-4924的模拟物，使昆虫体内过表达Sex-miR-4924，从而使Sex-miR-4924靶标基因Chitinase1转录受到抑制，破坏了甜菜夜蛾正常的生长发育过程，使之出现了异常生物表型，达到害虫的生物防治。 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国热带农业科学院热带生物技术研究所

 

<120>  甜菜夜蛾microRNA Sex-miR4924基因及其在害虫生物防治中的应用

 

<130> 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.4

 

<210>  1

<211>  27

<212>  RNA

<213>  Spodoptera exigua

 

<400>  1

uguaaguauc aacuguucug ucgggca                                         27