一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体及其应用

摘要

本发明公开了一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体及其应用，是2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列第13位由Pro突变为Ala和/或第20位由Arg突变为Lys，将突变后的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶与大肠杆菌原有的MEP途径结合，构建了高效合成异戊二烯的工程菌株，利用该菌株进行发酵生产异戊二烯。重组菌异戊二烯合成能力较原始菌株提高1.5倍以上。

说明书

技术领域

本发明涉及一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，以及利用该突变体构建重 组菌发酵生产异戊二烯的方法。

背景技术

异戊二烯又名2-甲基-1,3-丁二烯，是一种共轭二烯烃，易自身聚合，也易与其它不饱和 化合物共聚合，因此，异戊二烯是一种重要的合成橡胶单体。在工业上，可被齐格勒-纳塔催 化剂催化聚合合成聚异戊橡胶，即天然橡胶；异戊二烯还可以用作合成丁基橡胶的一种共聚 单体，以改进丁基橡胶的硫化性能。此外，异戊二烯在农药、医药、香料及粘结剂等领域也 有广泛的应用。

目前，异戊二烯的主要来源是石油裂解精馏，是碳五馏分的重要组分。碳五馏分组成复 杂，直接精馏难以得到纯度较高的异戊二烯产品，通常采取萃取精馏及共沸精馏法由裂解碳 五馏分中分离高纯度异戊二烯，增加了异戊二烯的生产成本。除碳五馏分分离得到异戊二烯 外，工业上还采用合成法生产；例如采用碳五以下的有机原料，如丙烯、异丁烯、甲醛、丙 酮和乙炔来合成。随着石化资源的枯竭，研究者们开始寻找新的异戊二烯生产方法，利用微 生物转化可再生的生物质资源生成异戊二烯，因其可再生型和对环境友好型，是一条具有潜 在应用前景的途径。

生物体内有两条途径合成异戊二烯，MVA途径和MEP途径。MVA途径存在于真核生物 及古细菌中，而MEP途径主要存在于植物质体、真菌和各种细菌中。到目前为止，采用生物 法合成异戊二烯的最有产量是通过MVA途径实现的，美国的Genercor公司在工程大肠杆菌 中利用MVA途径进行异戊二烯合成，最高产量可以达到60g/L以上（美国发明专利： 2009/0203102）；通过MEP途径合成异戊二烯的报道产量目前都还比较低（Zhao et al.,Applied  Microbiology and Biotechnology,2011,90(6):1915-22）。然而，与MVA途径相比，MEP途径 具有更高的理论产量，其产量较低推测是由于该途径中的关键酶活性不高的原因造成的。

2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶催化MEP生成2-甲基-4-二磷酸胞苷赤藓糖醇 （CDP-ME）（图1），是MEP途径中的关键反应。在大肠杆菌中，该酶是一个同源二聚体， 由ispD基因编码，其结构已经得到了解析（Kemp et al.,Acta Crystallographica Section D,2003, 59:607）。本发明通过采用易错PCR技术对该酶进行定点突变，获得了改性的2-甲基赤藓糖 醇4-磷酸胞苷酰转移酶，并整合到完整的MEP途径中，在发酵水平提高了异戊二烯的产量。

发明内容

本发明提供了一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，是2-甲基赤藓糖醇4-磷酸 胞苷酰转移酶氨基酸序列第13位由Pro突变为Ala。

本发明提供了一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，是2-甲基赤藓糖醇4-磷酸 胞苷酰转移酶氨基酸序列第20位由Arg突变为Lys。

本发明提供了一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，是2-甲基赤藓糖醇4-磷酸 胞苷酰转移酶氨基酸序列第13位由Pro突变为Ala，第20位由Arg突变为Lys。

本发明采用易错PCR的手段对大肠杆菌的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶进行突变， 并结合下游合成β-胡萝卜素的途径进行筛选，获取了较之大肠杆菌（Escherichia coli K-12  MG1655）原始2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶催化活性明显提高的酶。

所述2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明专利还提供了采用2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体增强大肠杆菌合成 异戊二烯能力的方法。

利用突变后的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶提高异戊二烯合成能力的方法还包 括：（a）将突变后的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体连接原核表达载体；（b）将该 表达载体导入大肠杆菌感受态细胞与大肠杆菌已有的MEP途径相整合；（c）利用导入该2-甲 基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶的重组大肠杆菌发酵合成异戊二烯。

本发明所提供的利用突变后的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶提高异戊二烯合成能 力的宿主细胞，优选大肠杆菌（Escherichia coli BL21(DE3)）。

有益效果：

1）本发明所制备的提供的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，导入大肠杆菌中 后，所获得的工程菌株其异戊二烯合成能力较原始菌株提高1.5倍以上，该结果有望推动生物 法制备异戊二烯工业化的进程。

2）本发明是针对异戊二烯合成途径单一关键酶进行的改造，可以与合成途径中其它酶进 行整合，并对其它酶的改造提供指导作用，从而有望进一步提高异戊二烯的合成能力。

3）本发明所提供的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，其作用不仅仅限于提高 异戊二烯的合成能力。该突变体对于异戊二烯合成途径下游的各种萜类化合物的合成理论上 同样具有促进作用，有可能应用于其它高附加值产品的合成。

附图说明

图12-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶催化的反应

图2pEASY-ispD载体图谱

图3ispD基因突变子与原始基因序列的比对

图4异戊二烯气相色谱检测

具体实施方式

实施例1：

大肠杆菌2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因（ispD）的克隆，具体过程如下：

以寡核苷酸5’- CAT GCC ATG GCA ACC ACT CAT TTG GAT G -‘3和5’- CCG GAA TTCTTA TGT ATT CTC CTG ATG GAT GG -‘3为引物，以大肠杆菌的总DNA为模版，采用聚合 酶链式反应（PCR）方法扩增出2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因，PCR体系和条件 如下所示：

采用凝胶回收试剂盒（购自Omega Bio-tek）对扩增片段进行电泳回收，然后连接到 pEASY-Blunt载体（购自北京全式金生物技术有限公司）上：

在微量离心管中配制下列溶液：

25℃反应30min，全量加入至50μl大肠杆菌感受态细胞中，冰中放置30min。42℃热 击90s后，再在冰中放置1分钟，加入890μl的SOC培养基，37℃振荡培养60min，在含 有Amp抗性的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落；采用PCR扩增法鉴定阳性克隆， 得到重组质粒pEASY-ispD（图2）。

实施例2：

大肠杆菌2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因（ispD）的随机突变，具体过程如下：

以实施例1中构建得到的重组质粒pEASY-ispD为模板，进行易错PCR扩增，扩增引物 与实施例1中相同，PCR体系和条件如下所示：

PCR体系：

对扩增后的片段进行电泳回收，然后用限制性内切酶NcoI和EcoRI分别对PCR产物和 pET30a空质粒（购自Novagen公司）进行酶切，酶切条件如下：

将上述PCR产物及载体酶切后的产物进行电泳回收，然后进行连接反应，连接体系及反 应条件如下：

连接体系：

连接条件：16℃连接反应过夜。

连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)（购自Invitrogen）感受态细胞，涂布于卡那霉素抗性 的平板上筛选阳性克隆，得到ispD基因的突变文库。

实施例3：

大肠杆菌2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因ispD突变体催化活性的筛选，具体步 骤如下：

从实施例2中的ispD基因突变文库中提取pET-ispD重组质粒，并转化携带有pAC-BETA 质粒（表达β-胡萝卜素合成酶，由本实验室保藏，参见刘敏等,武汉科技大学学报,2013, 36(3):214-218）的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组工程菌 BL21/pET-ispD&pAC-BETA。对不同突变子的上述工程菌采用LB培养基进行液体培养至菌 液OD₆₀₀达到0.6左右，加入IPTG至终浓度为0.5mM诱导重组蛋白的表达和β-胡萝卜素的 合成，诱导24h后，离心收集细胞，并用去离子水洗涤。菌体细胞用1ml丙酮重悬后，置于 黑暗条件下55℃孵育15min。再次离心收集含有β-胡萝卜素的丙酮上清液。提取液中的β-胡 萝卜素含量通过其在480nm的吸光度测定，比较不同ispD基因突变子的β-胡萝卜素产量， 对其中β-胡萝卜素含量明显增加（分别提高2.1倍和2.7倍）的两个突变子的序列进行分析， 经鉴定分别在Pro13位和Arg20位发生了突变（图3）。

实施例4

利用突变的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因工程大肠杆菌提高异戊二烯的合成 能力：

采用碱裂解法分别提取表达两个ispD突变子以及表达原始ispD基因的重组质粒，转化 携带有pYJM8（表达异戊二烯合成酶，由本实验室保藏，参见Yang et al.,Bioresource  Technology,2012,104:642-647）的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组工程菌 BL21/pET-ispD&pYJM8。采用LB培养基对上述工程菌在厌氧瓶中进行液体培养至OD₆₀₀达 到0.6左右，加入IPTG至终浓度为0.5mM诱导重组蛋白的表达和异戊二烯的合成，诱导24h 后，取发酵液上层空气进行气相色谱检测，结果如图4所示，A为对照表达未突变的ispD基 因的工程菌；B为表达Pro13→Ala突变子的工程菌；C为表达Arg20→Lys突变子的工程菌。 异戊二烯的保留时间约为1.8min。采用外标法计算不同菌株的异戊二烯产量，表达Pro13→ Ala突变子的菌株异戊二烯产量达到了27.3μg/L，表达Arg20→Lys突变子的菌株异戊二烯产 量达到了32.5μg/L，而表达原始ispD基因的对照菌株异戊二烯产量仅为10.8μg/L，这表明 这两个位点的突变对于异戊二烯合成均有较好的促进作用。

为了考察Pro13→Ala和Arg20→Lys同时突变的突变体对异戊二烯合成的影响，我们进 一步采用Easy Mutagenesis System试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）将Pro13→Ala突 变子的20位Arg突变成Lys，然后将双突变子导入到合成异戊二烯的工程菌中，结果表明， 异戊二烯的产量可进一步提高到37.2μg/L。