一种海带磷酸甘露糖异构和GDP-甘露糖焦磷酸化双功能酶基因

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，具体是一种海带磷酸甘露糖异构和GDP-甘露糖焦磷酸化双功能酶基因，该基因核苷酸序列及编码蛋白质的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。本发明通过基因克隆技术克隆出基因序列，构建真核表达载体，通过对重组蛋白进行酶活性检测，证实了其具有微弱的催化果糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸变构的功能，却具有显著的GDP-甘露糖焦磷酸化酶的活性，属于褐藻胶生物合成途径的关键酶编码基因。该基因对于提高海带等藻类褐藻胶和岩藻多糖含量具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种海带磷酸甘露糖异构和GDP-甘露糖焦磷酸化双功能酶的编码酶基因。特 别涉及一种海带（Saccharina japonica）磷酸甘露糖异构和GDP-甘露糖焦磷酸化双功能酶基 因的核苷酸序列，及其编码蛋白以及在合成褐藻胶和岩藻多糖的能力和在改良重要经济成分 性状中的应用。

背景技术

海带是全世界主要栽培的海洋植物（藻类）种类。作为一种海洋蔬菜，海带具有很高的 营养价值，同时，褐藻胶、岩藻多糖（褐藻糖胶）等主要经济成分，可以作为原材料广泛应 用于各行各业。褐藻胶的用途广泛，主要应用在食品工业、医药卫生、纺织工业、科学研究 等方面。岩藻多糖不仅可以作为金属离子的结合剂和阻吸剂，同时还具有如抗HIV病毒、抗凝 血、抗血栓、抗肿瘤等生理功能和功效，是一种重要的药用物质。

克隆产物合成相关基因并验证其功能，揭示基因与产物之间的关系，辅助开展品种改良 已成为国际农业育种领域提高经济成分含量的有效途径之一；同时，利用基因工程技术生产 活性物质与经济产物已成为现代生物技术产业发展的核心内容。

褐藻胶（Algin）是水溶性的褐藻酸钠、钾等碱金属盐类和水不溶性的褐藻酸（Alginic  acid）及其与二价以上金属离子结合的褐藻酸盐类；其基本结构是由α-1,4-L-古洛糖醛酸嵌 段（α-L-guluronicacid，G）和β-1,4-D-甘露糖醛酸嵌段（β-D-mannuronic，M）通过β -1-4糖苷键不规则的连接而成的多糖。

岩藻多糖（岩藻多糖硫酸酯，fucoidan或fucan sulfate，FS）是一种主要存在于褐藻细 胞壁和一些海洋无脊椎动物中的多糖，由L-岩藻糖和硫酸基团组成，此外还有D-木糖、D-半 乳糖或者糖醛酸。

褐藻胶和岩藻多糖的生物来源仅为褐藻纲藻类、海洋无脊椎动物及微生物，如真海带 （Saccharina japonica）、马尾藻属（Sargassum）、棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii）、 海洋假单胞细菌（Pseudomonas sp.）、铜绿假单胞细菌（Pseudomonas aeruginosa）、Halomonas  marina等。

不同生物来源的褐藻胶和岩藻多糖结构上有所不同，但是其合成过程基本是一致的。微 生物褐藻胶和岩藻多糖的生物合成途径研究的较为详细，如假单胞菌（Pseudomonas  aeruginosa）、固氮菌（Azotobacter vinelandii）和γ-变形菌（Gammaproteo bacteria）。 假单胞菌中，合成通路由多步反应构成，磷酸甘露糖异构酶（AlgA）、磷酸甘露糖变位酶（AlgC） 和GDP-甘露糖脱氢酶（AlgD）负责合成褐藻胶和岩藻多糖的前体物质GDP-甘露糖醛酸 （Guanosine diphosphate mannuronic acid，GDP-ManA）。而该合成通路在褐藻中仍然是不 明确的。Michel等学者对长囊水云（Ectocarpus siliculosus）基因组数据进行生物信息学 分析，重组了长囊水云的褐藻胶和岩藻多糖合成通路。在其基因组数据库中搜索到了与AlgA、 AlgC、AlgD和AlgG同源的基因PMI（磷酸甘露糖异构酶，Mannose-6-phosphate isomerase）、 PMM（Phosphomannomutase）、GMD（GDP-D-mannose dehydratase）和MC5E（Mannuronan  C-5-epimerase）。在细菌等微生物中AlgA是一种双功能酶基因，即PMI的Type2类型，能 催化合成反应的第一步和第三步反应，但是学者在长囊水云中只搜索到了单功能酶基因PMI， 并没有找到催化第三步反应的酶基因GMP（GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶，GDP-D-mannose  pyrophosphorylase，MPG），见图2。

海带等褐藻是褐藻胶和岩藻多糖天然来源，其大生物量和高含量的特点使其一直以来就 是褐藻胶和岩藻多糖提取的主要原料。但对于其合成褐藻胶和岩藻多糖的基因通路研究十分 薄弱，对于其关键的催化甘露糖-6-磷酸转化为GDP-甘露糖反应的编码酶基因仍属于未知，从 而使海带等褐藻植物基于基因克隆的品种改良无法实现。

发明内容

针对目前现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种磷酸甘露糖异构和GDP-甘露糖焦 磷酸化双功能酶基因，其可编码一种磷酸甘露糖异构和GDP-甘露糖焦磷酸化双功能酶蛋白， 所述蛋白仅具有微弱的催化果糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸变构酶（PMI）活性，但具有显著的 催化甘露糖-6-磷酸和GDP-甘露糖转化的酶（MPG）活性，所述基因及其编码蛋白可用于提高 褐藻胶和岩藻多糖合成含量。

本发明的目的之一在于提供一种磷酸甘露糖异构和GDP-甘露糖焦磷酸化双功能酶基因， 所述基因是从海带（Saccharina japonica）中分离出来的磷酸甘露糖异构和GDP-甘露糖焦磷 酸化双功能酶基因，命名为SjPMI4；所述基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO：1所示。

本发明的目的之二在于提供一种所述基因编码的蛋白，所述蛋白由SEQ ID NO：1所示的 核苷酸序列编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；其仅具有微弱的催化果糖-6-磷酸和甘 露糖-6-磷酸变构活性，但具有显著的催化甘露糖-6-磷酸和GDP-甘露糖转化的活性。

本发明目的之三是所述基因及其编码蛋白在合成褐藻胶和岩藻多糖中的应用。

本发明目的之四是所述基因及其编码蛋白在改良经济成分性状中的应用。

本发明通过基因克隆的方法，从海带中克隆到了一个磷酸甘露糖异构和GDP-甘露糖焦磷 酸化双功能酶基因，并通过实验证明了其编码的蛋白仅具有微弱的催化果糖-6-磷酸和甘露糖 -6-磷酸变构活性，但具有显著的催化甘露糖-6-磷酸和GDP-甘露糖转化的活性，是合成褐藻 胶和岩藻多糖的关键基因。克隆和分析海带磷酸甘露糖异构和GDP-甘露糖焦磷酸化双功能酶 基因有助于深入理解海带等褐藻褐藻胶和岩藻多糖合成机制，同时也会为褐藻胶和岩藻多糖 基因工程和分子育种提供了基因资源。本发明首次从海带（Saccharina japonica）中分离到 磷酸甘露糖异构和GDP-甘露糖焦磷酸化双功能酶基因，并通过真核表达载体对重组蛋白进行 酶活性检测，证实了其具有微弱的催化果糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸变构活性功能，但同时 具有显著的催化甘露糖-6-磷酸和GDP-甘露糖转化的活性功能，具有褐藻胶和岩藻多糖基因工 程和分子育种的应用价值。

附图说明

图1为以GDP-甘露糖作为前体的褐藻胶和岩藻多糖合成通路示意图。

图2为磷酸甘露糖异构酶（PMI）的生物学功能。

图3为本发明的SjPMI4基因cDNA全长的PCR扩增图。

图4为本发明的SjPMI4基因及其编码氨基酸序列（方框中分别为起始密码子和终止密码 子）。

图5为本发明的SjPMI4基因转化酵母后PCR检测阳性克隆PCR扩增图。

图6为本发明的SjPMI4基因转化酵母表达产物纯化后SDS-PAGE检测图。

图7为本发明的SjPMI4基因转化酵母表达产物的Western-Blot检测图。

图8为本发明的SjPMI4基因转化酵母表达产物的不同温度对酶活性的检测图。

图9为本发明的SjPMI4基因转化酵母表达产物的pH对酶活性的检测图。

图10为本发明的SjPMI4基因转化酵母表达产物的不同金属离子对酶活性的检测图。

图11为本发明的SjPMI4基因转化酵母表达产物的不同底物浓度酶活性变化图

图12为本发明的SjPMI4基因转化酵母表达产物的不同底物浓度双倒数曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件， 分子克隆实验指南（Sambrook J,et al.2008.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd  Ed.）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：基因全长编码区的克隆与分析

海带采集自山东省荣成市，采集时间为2011年7月。采用Trizol法提取海带雌配子体总R NA，使用TAKARA公司PrimeScript II1^st Strand cDNA Synthesis试剂盒以海带配子体总RNA 反转录的第一链cDNA为模板，利用cDNA末端快速扩增技术，使用BDSMART^TM RACE cDNA Ampl  ification Kit进行RACE-PCR扩增，引物分别为5′-AGGGCTACGAGCACAAGGAAAAGGGGG-3′和5′-GAC  CTCTACAAGGATGACAACCACAAGC-3′，RACE-PCR扩增程序为：94℃30sec，72℃3min，5个循 环；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min，2 0个循环；72℃10min。根据RACE测序结果采用TouchdownPCR技术和普通PCR技术进行海带P MI基因的CDS全长序列的扩增，扩增引物包括3组（5′-CGACCCGACCTCTACAAGGATGACAACC-3′和5′ -TCATTGGCAGCCATGAAGAACGACTCTC-3′；5′-CGAGACCGAGGAGGGCAAGATGTAC-3′和5′-CTCATTGGCAGC  CATGAAGAACGAC-3′；5′-GCCCTTCGTCACACACACGAC-3′和5′-CGGTGCAGGTTGAACACAATCT-3′）。PCR产 物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下切割含有目的条带的胶块，使用琼脂糖凝胶回 收试剂盒回收目的片段，于-20℃保存。回收的目的片段，于16℃金属浴过夜连接至克隆载体 pMD19-T，并转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli Top10中，涂布于含有100mg/mL Amp的LB固体 培养基上，37℃过夜培养，经过IPTG/X-gal蓝白斑筛选后，挑取4-10个阳性克隆进行测序。 将测序结果通过序列比对，分离到了一个海带PMI基因，命名为SjPMI4。SjPMI4CDS序列全 长为1020bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码339个氨基酸，以ATG为起始密码子，T  AA为终止密码子，之后为588bp的3'UTR序列。

实施例2：SjPMI4编码蛋白的制备及分析

海带SjPMI4PCR产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下切下目的条带，琼 脂糖凝胶回收，回收产物SjPMI4和pPICZαA质粒进行EcoRI和NotI双酶切，在37℃金属 浴3-4h后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收。将目的片段SjPMI4 和质粒pPICZαA进行连接，16℃过夜，构建好的重组质粒命名为pPICZαA-PMI4。

将重组质粒pPICZαA-PMI4使用内切酶DraI进行线性化处理，纯化后用灭菌的双蒸水溶 解，用电击转化巴斯德毕赤酵母X-33感受态细胞中。将孵化好的细胞培养物涂布于含有不同 浓度Zeocin^TM的YPD平板上，每50-200μL涂布一块平板；将平板置于28℃的培养箱中黑暗 培养2-4天，直至单个菌落出现。

用煮冻煮的方法制备巴斯德毕赤酵母PCR模板，利用引物（根据已经获得的测序结果， 设计带有酶切位点的正反向引物，含EcoRI酶切位点的正向引物 5′-CAGCGAATTCATGAGACGCCTGAATTGC-3′和含NotI酶切位点的反向引物5′- TATGCGGCCGCTATCAAACTCCAAATCC-3′）进行阳性克隆的筛选，PCR检测重组子。PCR产物于 1%琼脂糖凝胶电泳检测，自动凝胶图像分析仪成像，使用上述引物扩增PMI4CDS全长序列， 得到长度约为1000bp的PCR产物，与预期大小一致。挑取电泳检测插入条带正确的克隆测 序，检测有无突变，移码框是否改变。取测序正确的阳性克隆保存的菌液接种到50mL BMGY 培养基中，28℃，250rpm/min培养，24h向发酵液中添加甲醇至终浓度为0.5%。超声法破 碎菌液，收集破碎后的上清液，用0.45μm的滤膜过滤，Ni柱纯化后，收集的蛋白样品放 入透析袋中透析，以除去不需要的离子，获得重组PMI4蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO： 2所示，采用SDS-PAGE、Western-Blot检测重组蛋白的表达。

实施例3：SjPMI4编码蛋白的功能验证

PMI酶活测定：参照MarutaT等（2008）的两步偶联法，并稍作改造。反应体系如下：50 mM pH7.5的Tris-HCl的缓冲液中含有0.5mM的NADP+，5mM MgCl2，1U/mL PGI （Glucose-6-phosphate isomerase），1U/mL G6PDH（Glucose-6-phosphate dehydrogenase）， 1mM的M-6-P（Mannose-6-phosphate）和适量实施例3制备的重组PMI4蛋白，总的反应体系为 300μL，加入底物M-6-P起始反应。将上述除去底物的体系混合后在相应温度条件下孵育2min 后起始反应，以相应的缓冲液为空白对照，在340nm处分别测定反应0min、6min和12min吸光 值的变化，每个反应设置4个平行样。经检测，PMI4蛋白PMI酶活性较低，酶活为0.81U/mg， 最适反应温度为15℃，最适pH为8.5，该酶为低温酶，碱性蛋白。Zn²⁺、Cu²⁺和Mn²⁺对酶活性有 抑制作用；而Ca²⁺和Mg²⁺对酶活基本无影响；Co²⁺有促进酶活的作用。

MPG酶活性测定：1ml50mM pH7.6Tris-HCl的缓冲液，4mM葡萄糖，1mM ADP，1mMNADP， 10mM MnCl₂，1U己糖激酶，1U nucleoside-50-diphospho-kinase，1U葡萄糖-6-磷酸脱 氢酶和浓度范围为0.05到5mM的GDP-甘露糖。反应由加入实施例3制备的重组PMI4蛋白以及终 浓度为2mM的焦磷酸钠起始。将上述体系混合后在相应温度条件下孵育起始反应，以相应的 缓冲液为空白对照，在340nm处分别测定反应0min、3min和6min吸光值的变化，每个反应设 置4个平行样。酶活为3.28U/mg，Km值为32.44mM，最适反应温度为40℃，最适pH为7.0。该酶 为高温酶，中性蛋白；Mn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺和Mg²⁺可以促进酶活，Zn²⁺抑制其活性。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不 脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖 了所有这些在本发明范围内的变动。