一种5-氨基乙酰丙酸产生菌株及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种构建5-氨基乙酰丙酸生产菌株的方法，即增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中辅酶A合成途径关键酶和/或辅酶A前体合成途径关键酶的活性。本发明还公开了利用所述方法构建的5-氨基乙酰丙酸高产菌株和利用所述菌株制备5-氨基乙酰丙酸的方法。利用本发明的菌株可高效、低成本地产生5-氨基乙酰丙酸。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物发酵技术领域。具体地说，本发明涉及通过 增强5-氨基乙酰丙酸生产菌株中辅酶A的合成来提高5-氨基乙酰丙酸产量的方 法和应用，以及辅酶A合成途径关键酶活性增强的生产菌株。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-minolevulinic acid，ALA)是生物体内合成血红素、叶绿 素、维生素B12等四吡咯类化合物必需前体物质，在农业、医药和化工领域应 用广泛，是极具开发价值的高附加值生物基化学品。目前，通过产ALA的细菌 发酵生产ALA已经得到了产业化应用，并逐渐替代了传统的化学合成法，成为 研究和开发的重点。

目前用于生产ALA的微生物主要是通过诱变育种或基因工程改造获得，而 现有文献报道的基因工程改造方面的研究大多集中在强化ALA的合成途径上， 例如增强ALA合成途径关键酶的表达，而对ALA合成途径底物供给及微生物原 有代谢途径改造的研究较少。现有技术中，对ALA合成底物的胞内供应进行了 部分尝试，但总体效果不好，因此，目前为止对于ALA合成的底物供应普遍采 用的还是直接外源添加的方式。

辅酶A是一种含有泛酸的辅酶，在生物体内作为活化酰基载体参与多种生 物合成途径和能量代谢反应，并且还作为调节因子参与多种代谢反应的调控。 然而，由于辅酶A及其衍生物在生物体内参与多种代谢反应和调控作用，进而 影响整个代谢流的分配(例如引起乙酸和琥珀酸积累等)，其在生物体内合成的 增加或减少对后续其它产物合成的影响不确定。因此，目前通过提高辅酶A浓 度促进目的产物积累的研究和应用较少。更没有关于增加胞内辅酶A对ALA合 成影响的研究。

综上所述，本领域急需开发从不同途径改造ALA生产菌株以提高ALA产量 的方法，从而能利用所述生产菌株生产ALA。

发明内容

本发明的主旨是提供5-氨基乙酰丙酸高产菌株的构建方法以及5-氨基乙酰 丙酸的高产菌株。

在第一方面，本发明提供一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法，所述方 法包括：

增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中辅酶A合成途径关键酶和/或辅酶A前体 合成途径关键酶的活性。

在优选的实施方式中，所述辅酶A合成途径关键酶是泛酸激酶、磷酸泛酰巯 基乙胺腺苷酰基转移酶；优选地，所述辅酶A合成途径关键酶是泛酸激酶；所述 辅酶A前体合成途径关键酶是泛酸合成酶、天冬氨酸脱羧酶、3-甲基-2-氧化丁烷 酸羟甲基转移酶。

在另一实施方式中，所述辅酶A合成途径关键酶是泛酸激酶。

在优选的实施方式中，所述增强酶的活性可通过以下方法之一或组合来实 现：表达该酶的同源或异源的编码基因，和/或增加所述编码基因的拷贝数，和 /或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编 码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度。

在优选的实施方式中，所述方法还包括测定所得菌株的5-氨基乙酰丙酸产 量。

在优选的实施方式中，所述菌株本身具有5-氨基乙酰丙酸合成能力。

在优选的实施方式中，所述菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒 杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼 泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等。

在优选的实施方式中，所述菌株优选埃希氏菌属细菌，更优选大肠杆菌。

在第二方面，本发明提供一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株，所述菌株中辅酶A 合成途径关键酶和/或辅酶A前体合成途径关键酶的活性增强。

在优选的实施方式中，所述辅酶A合成途径关键酶是泛酸激酶、磷酸泛酰巯 基乙胺腺苷酰基转移酶；优选地，所述辅酶A合成途径关键酶是泛酸激酶；所述 辅酶A前体合成途径关键酶是泛酸合成酶、天冬氨酸脱羧酶、3-甲基-2-氧化丁烷 酸羟甲基转移酶。

在另一实施方式中，所述辅酶A合成途径关键酶是泛酸激酶。

在优选的实施方式中，所述菌株本身具有5-氨基乙酰丙酸合成能力。

在另一实施方式中，所述菌株选自大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒 杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、或 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。

在优选的实施方式中，所述菌株优选埃希氏菌属细菌，更优选大肠杆菌。

在优选的实施方式中，所述菌株产生5-氨基乙酰丙酸的产量高于4g/L。

在第三方面，本发明提供一种产生5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法包括：

1)培养本发明第二方面所述的5-氨基乙酰丙酸生产菌株；和/或，在本发明第 二方面所述的5-氨基乙酰丙酸生产菌株的培养过程中或在普通5-氨基乙酰丙酸生 产菌株的培养过程中添加外源性辅酶A合成前体，从而得到5-氨基乙酰丙酸；和

2)从1)的发酵培养体系中获得5-氨基乙酰丙酸。

在优选的实施方式中，所述辅酶A合成前体包括但不限于：泛酸、天冬氨酸、 β-丙氨酸、3-甲基-2-氧化丁烷酸、2-脱氢泛解酸、泛解酸；更优选地，所述辅酶A 合成前体是泛酸。

在另一实施方式中，所述辅酶A合成前体是泛酸。

在第四方面，本发明提供本发明第二方面所述的5-氨基乙酰丙酸生产菌株的 用途，所述菌株用于产生5-氨基乙酰丙酸和/或产生以5-氨基乙酰丙酸为前体的下 游产物。

在优选的实施方式中，所述以ALA为前体的下游产物是血红素或维生素 B12。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

根据本领域中现有的知识，发明人原先的分析预测显示增加胞内辅酶A/乙 酰辅酶A浓度可能引起乙酸和琥珀酸等副产物积累，从而导致合成ALA的碳硫 减少。然而，发明人通过对细菌代谢过程的长期研究和实践，出乎意料地发现 增强胞内辅酶A合成途径关键酶的活性和/或辅酶A前体合成途径关键酶的活性， 和/或外源性添加辅酶A的合成前体可以极大提高生产菌株的5-氨基乙酰丙酸产 量，在实践上可用于细菌发酵生产ALA。在此基础上完成了本发明。

术语定义

本文所用的术语“外源性”是指某体系中包含了原来不存在的物质。例如， 通过转化等方式在某菌株中引入该菌株中原本不存在的编码基因，则该基因对 于该菌株是“外源性”的。

本文所用的术语“增强”是指增加、提高、增大或升高某种蛋白，例如酶 的活性。鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员也不难理解本文所用 的“增强”还应包括通过表达酶的异源编码基因而增强其活性。在具体的实施 方式中，增强酶的活性可以通过表达酶的内源或异源性编码基因，和/或增加所 述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度， 和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区或稀有密码子以增强 翻译强度，和/或修改编码基因本身以增强mRNA稳定性、蛋白质稳定性、解除 蛋白质的反馈抑制等方法来实现。

辅酶A

辅酶A是一种含有泛酸的辅酶，在生物体内作为酰基载体参与多种生物合 成途径和能量代谢反应，并且还作为调节因子参与多种代谢反应的调控。微生 物中辅酶A及其衍生物乙酰辅酶A、琥珀酰辅酶A和丙二酰辅酶A参与多达600 种代谢反应，同时也是合成具有重要应用价值的精细化学品的前体。例如，乙 酰辅酶A是体内糖代谢的重要中间代谢产物并参与酯类和脂质等多种化合物的 生物合成，其缩合产物乙酰乙酰辅酶A参与合成聚-β-羟丁酸，而其羧化产物丙 二酰辅酶A参与萜类化合物的合成。辅酶A是以泛酸为底物通过5步酶促反应合 成，而催化泛酸磷酸化合成4-磷酸泛酸的泛酸激酶是其限速酶，受终产物辅酶 A的反馈调控。研究表明增强泛酸激酶的表达并在培养基中添加泛酸可以有效 提高胞内辅酶A/乙酰辅酶A的含量，并引起胞内代谢流的变化导致乙酸积累 (Vadali R,et al.Metabolic Engineering2004(6):133-139)。因此，通过调节胞内 辅酶A/乙酰辅酶A的浓度或比率可以调控碳代谢，促进胞内代谢流的重新分配。 Vadali等研究发现通过表达泛酸激酶可以提高胞内乙酰辅酶A的含量，促进乙酸 异戊酯的积累(Vadali R,et al.Metabolic Engineering2004(6):294-299)。Lin等 研究发现泛酸激酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶共表达可以进 一步提高琥珀酸的产量(Lin.H,et al.Biotechnol.Prog2004:1599-1604)。

然而，由于生物体内的代谢是一复杂的、动态平衡的网络，辅酶A及其衍 生物在生物体内参与多种代谢反应和调控作用，进而影响整个代谢流的分配 (例如引起乙酸和琥珀酸积累等)，其在生物体内合成的增加或减少对后续其它 产物合成的影响不确定。例如，其在生物体内合成增加对某种后续产物产生有 利的影响，但亦可能对其他产物的合成存在不利影响。因此，目前通过提高辅 酶A浓度促进目的产物积累的研究和应用较少。目前还没有关于增加胞内辅酶 A/乙酰辅酶A浓度对ALA合成影响的研究。

辅酶A合成途径关键酶

本文所述的“辅酶A合成途径关键酶”表示微生物中产生辅酶A的具体途 径中涉及的各种酶，包括但不限于：泛酸激酶、磷酸泛酰巯基乙胺腺苷酰基转移 酶。在优选的实施方式中，本文所述的辅酶A合成途径关键酶是泛酸激酶。类似 地，本文所用的术语“增强辅酶A合成途径关键酶的活性”是指增强涉及辅酶A 合成途径的相关酶，例如泛酸合成酶、天冬氨酸脱羧酶、3-甲基-2-氧化丁烷酸羟 甲基转移酶的活性。

辅酶A合成前体

本领域技术人员知道，“前体”表示在代谢途径中位于另一化合物之前的 一种化合物。在微生物的生物合成过程中，有些化合物能直接被微生物利用构 成产物分子结构的一部分，这些物质称为前体。前体必须通过产生菌的生物合 成途径，才能渗入到产物的分子结构中。因此，本文所述的“辅酶A合成前体” 表示在辅酶A的生物合成过程中，能直接用于构成辅酶A分子结构的一部分的化 合物。

在具体的实施方式中，所述辅酶A合成前体包括但不限于：泛酸、天冬氨酸、 β-丙氨酸、3-甲基-2-氧化丁烷酸、2-脱氢泛解酸、泛解酸；更优选地，所述辅酶A 合成前体是泛酸。

类似地，本文所述的“辅酶A前体合成途径关键酶”表示微生物中产生辅酶 A前体，例如泛酸、天冬氨酸、β-丙氨酸、3-甲基-2-氧化丁烷酸、2-脱氢泛解酸、 泛解酸的具体途径中涉及的各种酶，包括但不限于：所述泛酸合成酶、天冬氨酸 脱羧酶、3-甲基-2-氧化丁烷酸羟甲基转移酶。

本发明的5-氨基乙酰丙酸生产菌株

本发明提供一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株，所述菌株中辅酶A合成途径关键 酶和/或辅酶A前体合成途径关键酶的活性增强。

在具体的实施方式中，所述菌株本身可以具有一定5-氨基乙酰丙酸合成能 力。

本领域技术人员知道许多菌株可以用于产生5-氨基乙酰丙酸。这些菌株虽 然不同，但它们合成5-氨基乙酰丙酸的合成体系、途径却是类似的。因此，本 领域普通技术人员鉴于本发明的教导和现有技术可以明白，本发明的菌株可以 是任何可用于产生5-氨基乙酰丙酸的菌株，包括但不限于：大肠杆菌 (Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌 (Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等。 在具体的实施方式中，所述菌株优选埃希氏菌属细菌，更优选大肠杆菌。

本发明的菌株具有较高的5-氨基乙酰丙酸生产能力，例如，在具体的实施方 式中，所述菌株产生5-氨基乙酰丙酸的产量高于4g/L。

5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建

基于发明人出乎意料地发现增强胞内辅酶A合成途径关键酶的活性和/或外 源性添加辅酶A的合成前体可以极大提高生产菌株的5-氨基乙酰丙酸产量，本 发明进一步提供一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法，所述方法包括：增强 所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中辅酶A合成途径关键酶和/或辅酶A前体合成途径 关键酶的活性；或导入外源性的辅酶A合成途径关键酶和/或辅酶A前体合成途径 关键酶。

在具体的实施方式中，所述增强酶的活性可通过以下方法之一或组合来实 现：表达同源或异源的该酶的编码基因，和/或增加所述菌株中所述编码基因的 拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携 带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度。

在另一具体的实施方式中，所述方法还包括测定所得菌株的5-氨基乙酰丙 酸产量。

基于上文所述，本领域技术人员可以理解，本发明的5-氨基乙酰丙酸生产菌株 的构建方法适用于上述多种菌株。

鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员还应明白本发明是通过增强 起始菌株中辅酶A合成途径关键酶和/或辅酶A前体合成途径关键酶的活性，导入 外源性的辅酶A合成途径关键酶和/或辅酶A前体合成途径关键酶来提高所述菌 株产生5-氨基乙酰丙酸的能力。因此，只要通过以上手段来构建或改造菌株，进 而提高5-氨基乙酰丙酸产量的方法或由此得到的菌株均应落在本发明的保护范围 内，本发明的保护范围并不限于实施例中采用的具体方法和得到的菌株。

5-氨基乙酰丙酸的生产方法

在本发明人出乎意料的发现以及本发明构建菌株的方法和获得的菌株的 基础上，本发明进一步提供产生5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法包括：1)培养 本发明构建的菌株，从而得到5-氨基乙酰丙酸；和2)从1)的发酵培养体系中获得5- 氨基乙酰丙酸。

此外，发明人还发现可以通过外源性添加辅酶A的合成前体来提高生产菌株 的5-氨基乙酰丙酸产量。在具体的实施方式中，所述辅酶A合成前体包括但不限 于：泛酸、天冬氨酸、β-丙氨酸、3-甲基-2-氧化丁烷酸、2-脱氢泛解酸、泛解酸； 更优选地，所述辅酶A合成前体是泛酸。

因此，鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员还应知道通过外源性 添加辅酶A的合成前体来提高生产菌株的5-氨基乙酰丙酸产量的方法也适用于 普通菌株，即，其中辅酶A合成途径关键酶和/或辅酶A前体合成途径关键酶的活 性未得到增强；或未包含外源性的辅酶A合成途径关键酶和/或辅酶A前体合成途 径关键酶的5-氨基乙酰丙酸生产菌株。在更进一步的实施方式中，通过外源性添 加辅酶A的合成前体来提高生产菌株的5-氨基乙酰丙酸产量的方法还可与本发 明构建菌株的方法联用，即，在本发明构建的菌株的发酵生产过程中外源性添 加辅酶A的合成前体来进一步提高5-氨基乙酰丙酸的产量。

在优选的实施方式中，所述方法获得的5-氨基乙酰丙酸的产量高于4g/L。

本发明的5-氨基乙酰丙酸高产菌株的用途

本领域技术人员应明白，本发明的5-氨基乙酰丙酸高产菌株不仅可用于产 生5-氨基乙酰丙酸，还可用于产生以5-氨基乙酰丙酸为前体的衍生物，例如血 红素或VB12。

本发明的优点：

1.本发明菌株的5-氨基乙酰丙酸产量大大提高；

2.本发明发现增强胞内辅酶A合成途径关键酶的活性和/或辅酶A前体合成 途径关键酶的活性，和/或外源性添加辅酶A的合成前体可以极大提高生产菌株 的5-氨基乙酰丙酸产量，从而为工程改造5-氨基乙酰丙酸生产菌株或优化5-氨 基乙酰丙酸生产菌株的生产工艺提供了新的思路；

3.本发明构建5-氨基乙酰丙酸高产菌株的方法可与培养条件的优化结合 起来从而进一步提高5-氨基乙酰丙酸的产量。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技 术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和 材料来实施或检验本发明，但优选本文所述的方法和材料。

材料与方法

本发明实施例所用的DNA聚合酶购自北京全式金公司的Fastpfu；限制性内 切酶及DNA连接酶等均购自Fermentas公司；

酵母粉和蛋白胨购自英国Oxoid公司产品；甘氨酸和IPTG购自Promega公 司；ALA和对二甲氨基苯甲醛等购自Sigma公司；琼脂粉和抗生素购自北京索 来宝；葡萄糖、冰醋酸、高氯酸、三氯乙酸、乙酰丙酮、氯仿以及其他常用化 学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒均购自上海生工生物工程 股份有限公司，相关操作均严格按照说明书执行；

质粒构建测序验证由华大基因完成；

DH5α感受态细胞购自北京全式金公司。

LB培养基成分：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，固体培养基中 添加2%的琼脂粉。

抗生素浓度为：氨苄青霉素100μg/mL，氯霉素30μg/mL。

ALA的检测方法：200μL稀释的发酵液加入100μL pH4.6乙酸钠缓冲液， 然后加入5μL乙酰丙酮，100℃水浴温育15min，冷却至室温后加入等体积的 Ehrlish’s试剂(42mL冰醋酸，8mL70%高氯酸，1g二甲氨基苯甲醛)混匀，显 色10min后测553nm波长下的吸光度。

葡萄糖分析方法采用山东科学院生产的SBA-40D生物传感分析仪进行检 测。

实施例1.泛酸激酶表达载体构建

根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物coaA-F(引物序 列：GCTCTAGAttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagcAACTTTAAGAAGGAGATA TACATATGAGTATAAAAGAGCAAAC；SEQ ID NO:1)和coaA-R(引物序列： CGGAATTCAGAAAGGGGAGTATTCGCTC；SEQ ID NO:2)，并在上游引物添 加BioBrick中启动子BBa_J23100和XbaⅠ酶切位点，在下游引物添加EcoRⅠ酶 切位点。以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到带有组成型启动子的 coaA基因片段，PCR扩增参数为94℃2min；94℃20s，60℃20s，72℃1min， 循环30次；72℃延伸5min。coaA基因片段回收后用限制性内切酶EcoRⅠ和Xba Ⅰ处理，然后与同样处理的pZCA9载体连接，转化DH5α感受态细胞，涂布含有 氯霉素的LB平板，挑取阳性克隆提取质粒并进行酶切验证，测序正确的重组质 粒命名为pZPA10。

实施例2.MG1655/pZPA6菌株的构建

2.1磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc和ALA合成酶共表达质粒的构建

根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物ppc-F (CCGCAAGCTTTATCCGACCTACACCTTTGG；SEQ ID NO:3)和ppc-R (CCGCAAGCTTGGACTTCTGTGGAATGCATAGT；SEQ ID NO:4)，以大肠杆 菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到带有自身启动子的ppc基因片段，PCR扩 增参数为94℃2min；94℃20s，60℃20s，72℃1.5min，循环30次；72℃延 伸5min。ppc基因片段回收后用Hind III处理，同时将携带有ALA合成酶的质粒 pZGA24(pZGA24构建参见参考文献：郭小飞等，利用5-氨基乙酰丙酸脱水酶 缺失的重组大肠杆菌合成5-氨基乙酰丙酸，天津科技大学学报，2012,27(4)： 1-6)也用该酶处理，载体和片段回收后用T4连接酶连接，转化DH5α感受态细胞， 涂布含有Amp的LB平板，挑取阳性克隆提取质粒并进行酶切验证，测序正确的 重组质粒命名为pZPA6。

2.2.重组菌株MG1655/pZPA6的构建

将上述构建的重组质粒pZPA6转化野生型大肠杆菌MG1655，涂布Amp抗 性LB平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，获得重组菌株 MG1655/pZPA6。

实施例3.增强辅酶A供给对ALA合成的影响

为了验证表达泛酸激酶及增强辅酶A供给对ALA合成的影响，分别将 pZPA10及其对照空载体pZCA9转入MG1655/pZPA6菌株中，感受态细胞制备和 转化过程参考J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》。转化 产物涂布氨苄抗性和氯霉素抗性的LB平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒 验证，分别获得重组菌株MG1655/pZPA6/pZPA10和MG1655/pZPA6/pZCA9。

将上述重组菌单菌落分别接种5mL含有100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL 氯霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h。按照初始OD₆₀₀为0.05转接 装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶，37℃，220rpm培养2.5h后加入终浓度 为50μM的IPTG，诱导培养24h后收集发酵液，检测ALA的浓度。其中发酵培 养基为添加了少量酵母粉的M9培养基，主要成分为：Na₂HPO₄·12H₂O17.1g/L， KH₂PO₄3.0g/L，NaCl0.5g/L，NH₄Cl1.0g/L，MgSO₄2mM，CaCl₂0.1mM， 葡萄糖15g/L，酵母粉2g/L，甘氨酸4g/L，氨苄青霉素100μg/mL和氯霉素30 μg/mL。ALA的检测方法如“材料与方法”部分所述。同时，为了验证添加外源 添加泛酸对辅酶A及ALA合成的影响，上述重组菌同时转接含有5mM泛酸钙的 发酵培养基，相同处理后检测发酵液中ALA的浓度。

重组菌发酵结果见表1，在不添加泛酸的发酵培养基中，对照菌株 MG1655/pZPA6/pZCA9发酵24h后ALA的产量为2.59g/L，表达泛酸激酶后ALA 的产量达到3.04g/L，比对照菌株提高了17%。当在培养基中外源添加泛酸后， 上述重组菌ALA的产量分别达到3.67g/L和4.12g/L，分别比对照组提高了42% 和36%，而同时表达泛酸激酶并外源添加泛酸的条件下ALA产量比对照组提高 了59%，效果非常显著。上述结果表明通过表达泛酸激酶和/或外源添加泛酸的 方法增强辅酶A的合成有利于提高ALA的产量。

表1重组菌摇瓶发酵结果

注：“-”发酵培养基中不添加泛酸；“+”发酵培养基中添加5mM的泛酸钙。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。