一种猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJ01及应用

摘要

本发明涉及猪伪狂犬病毒技术领域，特别涉及一种猪伪狂犬病毒变异株

说明书

技术领域    

本发明涉及猪伪狂犬病毒技术领域，特别涉及一种猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01，还涉及猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01的应用。

背景技术   

伪狂犬病毒（PRV）属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科成员，可引起新生仔猪中枢神经系统紊乱，生长猪呼吸道症状，并能导致妊娠母猪流产、死胎与弱仔。美国与部分欧洲国家已宣布消灭和根除该病。我国广泛使用该病基因缺失弱毒疫苗有效控制并逐步净化。但是，自2011年底起，我国很多该病免疫猪场相继出现仔猪呕吐和神经症状、生长猪出现呼吸道症状，死亡率明显增高，妊娠母猪出现流产、死胎、弱仔等，造成严重经济损失，但对流行毒株的致病性和抗原性均不清楚。

发明内容   

为了解决以上现有技术中存在的疫情不能得到有效控制的问题，本发明提供了一种猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01。

本发明还提供了所述猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01在制备免疫疫苗的应用。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJ01，其保藏号为CGMCC No.8170。采用10^6.0TCID₅₀滴鼻感染85日龄健康猪，非免疫猪全部发病和死亡。

所述的猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJ01在制备疫苗中的应用。

优选所述疫苗为水溶性灭活疫苗。

疫苗的制备过程为：取PRV-ZJ01病毒液灭活，加入卡波姆佐剂混合均匀即得。病毒液中病毒含量为10^7.0TCID₅₀/mL。

疫苗中病毒抗原含量大于10^6.0TCID₅₀/mL。

本研究采集我国某发病猪群患病仔猪脑组织病料，无菌处理后接种BHK21细胞，盲传2代，培养2~3天出现明显细胞病变，病毒空斑纯化3次后连续传代15次，均出现相同病变，病毒TCID₅₀为10^-7.5/mL，PCR鉴定为PRV，命名为PRV-ZJ01毒株。病毒gE和gB基因序列测定结果显示其与其他已公布的毒株序列同源性分别为97.1%~99.6%和98.1%~99.5%，其gE基因推导的氨基酸序列在第54和448位发生D-I和V-I突变，第496位插入D。采用10头24日龄仔猪进行人工感染发病试验，结果显示，该分离株可引起PRV典型临床症状和病理变化，100%死亡。采用24头85日龄健康育肥猪滴鼻接种10^2 .0TCID₅₀ ~10^6.0 TCID₅₀ PRV-ZJ01株病毒液，结果为，攻毒组猪均出现发热，精神沉郁，呕吐，咳嗽，呼吸困难和神经症状等典型症状，10^6.0 TCID₅₀病毒感染组猪在攻毒后7天内全部死亡，病毒LD₅₀为10^3.13 TCID₅₀/mL。该毒株与50份Bartha-K61、Bucharest、HB-98疫苗毒株血清及其抗血清交叉中和试验，结果显示，该分离毒株抗原发生明显变异，变异系数R值为0.378~0.448，首次证明PRV-ZJ01毒株为PRV超强毒抗原变异毒株，属于血清2亚型超强毒株。

本发明的有益效果：采用PRV-ZJ01株病毒液（10^6.0TCID₅₀/mL）制成水包油型灭活疫苗，与Bartha-K61活疫苗进行猪体免疫保护试验，结果表明，ZJ01毒株灭活疫苗安全性较好，免疫保护效率明显高于Bartha-K61活疫苗免疫组，Bartha-K61活疫苗对ZJ01超强毒株不能提供完全保护。证明该病毒株具有较好免疫原性，可用于该病疫苗和诊断方法研究与开发。

菌株保藏信息

保藏时间：2013年9月18日，

保藏单位：中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），

保藏编号：CGMCC No.8170，

保藏单位地址：中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，

分类命名：猪伪狂犬病毒。

附图说明   

图1. PRV-ZJ01的分离与PCR鉴定，其中A为病毒感染BHK-21细胞形成的细胞病变；B为病毒感染BHK21细胞形成的空斑；C为分离病毒株PCR检测（1-4泳道为F1，F5，F10与F15代次病毒，第5泳道为细胞对照）。

图2. 24日龄仔猪攻毒后不同时间仔猪死亡统计结果；

图3上两行图片为24日龄仔猪攻毒后死亡猪肉眼病变观察结果，下两行为24日龄仔猪攻毒后死亡猪病理组织学观察结果，其中，a为肝脏；b为脑；c为肺脏；d为脾脏；e为肾脏；f为淋巴结；

图4为24日龄仔猪攻毒后2周不同组织中PRV核酸定量检测结果；

图5为 85日龄猪攻毒后不同时间猪死亡统计结果；

图6上两行为攻毒后死亡猪肉眼病变观察结果；下两行为攻毒后死亡猪病理组织学观察结果，其中a为肝脏；b为脑；c为肺脏；d为脾脏；e为肾脏；f为淋巴结；

图7为85日龄猪攻毒后2周不同组织中PRV核酸定量检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

1. 病毒分离与PCR鉴定

将采集的发病猪的脑组织剪碎混浆处理（组织与灭菌PBS重量体积比为1:10），12000rpm离心10 min取上清经0.22μm 滤器过滤用于病毒的分离。将1mL过滤的病料上清接种刚长满单层的BHK-21细胞，37℃孵育1h后弃去培养瓶中液体并加入2% DMEM于含5% CO₂的37℃细胞培养箱中培养，每天观察细胞是否出现病变。待70%细胞出现病变后，反复冻融3次，接种BHK21细胞。病毒空斑纯化3次，采用PRV PCR方法扩增gE基因，反应体系：1 U AccuPrime^TM pfx DNA Polymerase 与2.5μL 10×AccuPrime^TM pfx Mix (Invitrogen)，上下游引物各10 pmol，DNA模板100ng，灭菌双蒸水补足50μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性45s，62℃退火45s，68℃延伸3 min，上述3步骤进行35个循环；68℃后延伸7 min。PCR产物经1%琼脂糖电泳分析。

结果为：病料组织无菌处理后接种长满单层的BHK-21细胞，20h后出现特征性细胞病变，表现为细胞变圆，折光性变强，形成形态各异的合胞体（图1A），并可以形成空斑（图1B）。病毒经3次空斑纯化，连继传代15次，病毒TCID₅₀为10^7.5/mL，PCR检测F1，F5，F10与F15代细胞毒，均扩增出目的条带188bp（图1C），证明该分离株属于PRV，毒株命名为ZJ01。

株基因序列测定与分析

采用PCR方法扩增gE与gB基因，反应体系同上。PCR产物经1%琼脂糖电泳分析，回收目的片段，克隆至载体pEASY^TM-Blunt Zero (TransGen)，进行基因测序分析。结果为：新分离毒株的这两个基因与其他已公布的PRV毒株序列同源性分别为97.1%~99.6%和98.1%~99.5%。基因进化树分析图中，新分离株位于一个相对独立的分支中。gE基因推导的氨基酸序列比对发现，新分离株与大多数毒株相比，在54与448位发生了54位（D-I）与448（V-I）突变，在第496位插入D。

日龄仔猪致病性试验

选择PRV阴性的24日龄仔猪10头，随机分成两组，每组5头，第1组每头猪滴鼻接种10^6.0 TCID₅₀ PRV-ZJ01株病毒液（F5），对照组滴鼻接种等量细胞营养液作为对照。隔离饲养，自由采食。每天观察实验猪发病症状（如精神萎靡，食欲不振，发热，神经症状，呼吸道症状与死亡等），对死亡猪系统解剖后采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结与脑组织冷冻保存，并将上述组织于4%多聚甲醛固定，制备组织切片，进行组织病理学检查，同时用荧光定量PCR方法检测各组中PRV核酸含量。见图2-4。

结果为：（1）仔猪攻毒后2天即出现发热（＞41℃），精神沉郁、呕吐、咳嗽、呼吸困难和神经症状等临床表现，所有攻毒组仔猪在5天内全部死亡，而对照组全部健活，见图2。（2）肉眼病变为：脾脏与肝脏表面出现白色坏色点，脑组织水肿，肺脏纹理增强，肾脏表面有出血点，淋巴结肿大出血。（3）组织病变为：肝细胞变性坏死，脾细胞坏死，肺脏间质性肺炎、上皮细胞坏死，肾脏出血，淋巴结坏死、出血，非化脓性脑炎（“卫星现象”，“噬神经元现象”且在高倍镜下可见病毒包涵体）。见图3,。（4）PRV DNA 载量均在肺脏中最多，其次是脑组织，见图4。

日龄育肥猪致病性试验

选择PRV阴性的24头85日龄健康猪，随机分成6组，每组4头，其中第1-5组为攻毒组，每头猪分别滴鼻接种10^2 .0TCID₅₀ ～10^6.0 TCID₅₀ PRV-ZJ01株病毒液，第6组为对照组，滴鼻接种等量细胞营养液。自由采食，隔离饲养，观察2周，记录发病症状与死亡情况，按Reed-Muench法计算LD₅₀。同时，取死亡猪和试验结束时猪，进行剖检，观察肉眼病变，并取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结与脑组织冷冻保存，并将上述组织于4%多聚甲醛固定，制备组织切片，进行组织病理学检查。同时，用荧光定量PCR方法检测各组中PRV核酸含量。见图5-7.

结果为：攻毒组实验猪均出现发热（＞41℃），精神沉郁，咳嗽，呼吸困难，神经症状与死亡等临床表现，10^6.0 TCID₅₀病毒组在攻毒后7天内全部死亡，对照组全部健活。见图5。病毒对85日龄猪LD₅₀为10^3.13 TCID₅₀/mL。肉眼病变与24日龄攻毒仔猪相似，主要为：脾脏边缘出血，肝脏表面出现局灶性坏死，肾脏、淋巴结、肺脏与脑组织。组织病变为：肝细胞变性坏死，脾脏出血，肺脏间质性肺炎，肾脏出血，淋巴结坏死，非化脓性脑炎（“袖套现象”）。见图6.PRV DNA 载量均在肺脏中最多，其次是脑组织。见图7。

病毒血清交叉中和试验

选择PRV阴性的30日龄健康猪50头，随机分成5组，每组10头，第1组肌肉注射10^2 .0TCID₅₀ PRV-ZJ01株病毒液，第2-5组按说明书分别接种4种PRV疫苗，即Bartha-K61清伪灵（LT 1205476，辉瑞）、Bartha-K61 （LT 20120602，武汉中博）、Bucharest扑伪佳（LTA289184，辉瑞）、HB-98株（LT 121041，武汉科前）。免疫后4-5周采集血液，分离血清，抗血清56℃水浴30min灭活处理，用于病毒血清交叉中和试验。血清倍比稀释后分别与100 TCID₅₀ 原免疫病毒和ZJ01毒株混合，37℃孵育1h，每个血清稀释度设置4个重复。接种96孔板BHK-21细胞单层，100μL/孔，置5% CO₂细胞培养箱37℃培养4d，于显微镜下观察细胞病变CPE，记录病变孔数目。按照Reed-Muench法计算中和抗体效价。运用SPSS 16.0 软件进行统计分析。并采用以下公式计算R值。结果见表1,

R值=                                               

ZJ01毒株与Bartha-K61、Bucharest和HB-98株的R值分别为：0.378-0.448，证明PRV-ZJ01毒株为新的血清亚型，定义为血清2亚型。Bartha-K61、Bucharest和HB-98株疫苗免疫仔猪抗体不能有效中和ZJ01毒株感染。

表1  PRV不同毒株免疫猪血清交叉中和抗体效价

6. 灭活疫苗制备与免疫保护试验

采用PRV-ZJ01株病毒液（10^7.0TCID₅₀/mL），用0.02%甲醛灭活后加入20%卡波姆佐剂混合均匀，疫苗中灭活病毒的含量是10^6.0TCID₅₀/mL，制成水溶性灭活疫苗。选择PRV阴性的28-30日龄健康仔猪15头，随机分成3组，每组5头，第1组肌肉注射PRV-ZJ01株灭活疫苗，1mL/头，第2组按说明书接种Bartha-K61清伪灵（LT 1205476，辉瑞）。免疫后4周，采集血液分离血清，检测gE、gB-ELISA抗体，并用ZJ01毒株测定中和抗体效价。采血后所有猪采用滴鼻方法攻击PRV-ZJ01株病毒液（10^6.0TCID₅₀/mL），隔离饲养观察2周。每天观察实验猪发病症状（如精神萎靡，食欲不振，发热，神经症状，呼吸道症状与死亡等，并取发病死亡猪脑组织检测PRV核酸，计算免疫保护效率。

结果见表2，所有猪接种后精神和食欲正常。免疫后4周，ZJ01毒株灭活疫苗免疫组血清中和抗体效价平均值1:36.5，明显高于Bartha-K61、Bucharest和HB-98株活疫苗免疫组。免疫后采用ZJ01毒株攻击，ZJ01毒株灭活疫苗免疫组免疫保护效率达100%，Bartha-K61活疫苗免疫组均有4-5头发病，表现体温升高（>40.5℃）,精神沉郁，腹泻和呼吸困难，对照组攻毒后全部发病并死亡，脑组织PCR检测PRV阳性，表明ZJ01毒株灭活疫苗免疫保护效率明显高于Bartha-K61、Bucharest和HB-98株活疫苗免疫组。Bartha-K61、Bucharest和HB-98株活疫苗对ZJ01超强毒株不能提供完全保护。

表2  PRV-ZJ01毒株灭活疫苗免疫保护试验结果

*分母为该组猪总数，分子为检测阳性数；# 中和抗体效价的倒数；**分母为该组猪总数，分子为发病数或死亡数。

灭活疫苗对PRV不同强毒株的交叉免疫保护作用

取4头怀孕80~90天母猪（PRV gB和gE抗体阴性），分成2组，每组2头，第1组接种上述得到的PRV-ZJ01灭活疫苗，肌肉注射，2mL/头，间隔3周后相同方法加强免疫一次。第2组不免疫对照，隔离饲养，观察母猪健康和产仔情况。

取各组母猪后代21日龄健康仔猪10头，采血分离血清，采用IDEXX PRV gB-ELISA和gE-ELISA抗体检测试剂盒检测gB和gE抗体，并将各组仔猪10头再随机分为2组，共计4个组，即ZJ01灭活疫苗免疫组1-1和1-2、非免疫对照组3-1和3-2，每组5头，隔离饲养，第1-1和3-1组采用PRV-ZJ01细胞毒（10^6.0 TCID₅₀/mL）攻击，滴鼻1mL/头。第1-2和3-2组采用PRV传统株LA细胞毒（10^6.0 TCID₅₀/mL）攻击，滴鼻1mL/头。攻毒后观察临床表现，死亡猪和明显发病猪采集脑组织冷冻保存，用PCR方法检测PRV核酸，判定疫苗免疫保护效率。

结果为：母猪接种ZJ01灭活疫苗后，没有任何异常反应，产仔正常，健仔数与非免疫母猪组相似，分别为21/22和22/24（健仔数/总仔数）。ZJ01灭活疫苗免疫母猪后代21日龄时PRV gB和gE抗体均为阳性。PRV-ZJ01攻击后3-10天，对照组出现呕吐和神经症状等明显临床症状，并全部死亡，ZJ01灭活疫苗组无明显临床症状。PRV传统毒株LA攻击后4-14天，对照组均出现明显临床症状，死亡2头，ZJ01灭活疫苗免疫组仔猪均无明显异常。所有发病猪和病死猪脑组织用PCR方法检测PRV均为阳性（见表3），证明ZJ01灭活疫苗对PRV变异株和传统毒株均有较好免疫保护作用。

表3  ZJ01灭活疫苗对PRV传统毒株攻毒交叉保护试验结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。