一种促进牛骨骼肌卫星细胞体外增殖的方法

摘要

本发明涉及一种促进牛骨骼肌卫星细胞体外增殖的方法，包括步骤有：包含牛miR-133b基因序列的目的序列的获取：表达载体pEGFP-C1-miR133b的构建：pEGFP-C1-miR133b转染牛骨骼肌卫星细胞：一种促进牛骨骼肌卫星细胞体外增殖的方法的应用，通过牛骨骼肌卫星细胞过表达微小RNA miR-133b的获取，利用miR-133b的作用，提高牛骨骼肌卫星细胞的体外增殖能力，并有效抑制其分化。本发明利用pEGFP-C1构建miR-133b的过表达载体，利用微小RNA对牛肌卫星细胞的增殖和分化进行调控，得到高纯度的牛肌卫星细胞，为研究各调控因子在肌卫星细胞增殖与分化过程中的功能和影响提供良好的细胞模型。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域的细胞工程技术，具体涉及一种促进牛骨骼肌卫 星细胞体外增殖的方法。

背景技术

骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cell）是骨骼肌中具有分化增殖潜 能的肌源性干细胞，通常以静息状态存在于肌纤维肌膜与基底膜之间，在一定 的条件下可以被激活，发生增殖和分化，形成骨骼肌细胞，肌卫星细胞在动物 出生后肌肉的生长发育和再生过程中发挥着十分重要的作用。肌卫星细胞的激 活、增殖与分化过程受多种因素的调控，了解骨骼肌卫星细胞的发生调控模式， 可以增加人为控制肌细胞形成的可能性。目前骨骼肌卫星细胞的研究工作主要 集中于肌卫星细胞的分离培养、鉴定及影响其增殖和分化的机制等方面。在分 离肌卫星细胞时往往掺杂着其它细胞，而且骨骼肌卫星细胞在低血清浓度下会 自发地分化为骨骼肌细胞，使得要获得大量高纯度的肌卫星细胞具有很大的挑 战性，如何提高肌卫星细胞的体外增殖能力并抑制其分化成为高效并经济地获 取足量高纯度肌卫星细胞的关键。

骨骼肌增殖和分化过程涉及多基因的表达、信号途径及网络式调控，过程 极其复杂。已有研究表明微小RNA（microRNAs,miRNAs）在肌肉发育和肌细 胞增殖与分化中发挥了关键性的调控作用。miRNAs是一类广泛存在于真核细胞 当中由基因组编码的长度约22nt的高度保守的内源性非编码单链RNA，它们通 过与对应的靶mRNA的3’非翻译区（3’untranslated region,3’UTR）的非完全或 完全配对结合，阻止其翻译或破坏其稳定性，实现对基因表达的转录后调控。 可以利用表达载体将miRNAs转染导入细胞或动物体内，用于研究miRNAs的 功能，一般导入细胞或动物体内的miRNAs基因，应使用包含该miRNAs基因 前体的一段序列，研究发现所选择的片段至少应该在miRNAs基因前体两侧各 自延伸40nt，这样可以使转入基因更有效的被剪切加工成为成熟的miRNAs。 miRNAs作用的靶基因几乎覆盖细胞每一条信号通路，参与细胞生长、增殖、发 育、分化和细胞凋亡等多个生命活动环节。miR-133是肌肉组织特异性miRNAs， 它在心肌和骨骼肌均表达，它参与了肌细胞的增殖与分化、肌肉的生理病理学 等过程，具有重要功能。研究发现miR-133在小鼠C2C12成肌细胞分化过程中 迅速上调，进一步的功能研究证明miR-133促进成肌细胞的增殖并抑制其分化。 研究也证明miR-133能促进大鼠和人胚胎干细胞增殖并抑制其分化。过表达 miR-133也能抑制血管平滑肌细胞向成骨样细胞的分化。miRNAs不仅在结构上 保守而且在物种间具有高度的进化保守性，预示着某些miRNAs在牛肌肉发育 分化中可能具有非常重要的调控作用，因此，验证并确定利用牛miR-133来促 进牛肌卫星细胞的增殖并抑制其分化效果，建立牛肌卫星细胞高效的体外培养 和纯化方法就成了本领域技术人员亟待解决的课题。

发明内容

鉴于miR-133对肌细胞增殖和分化的影响，本发明的目的在于提供一种通 过过表达miR-133b来促进牛骨骼肌卫星细胞的体外增殖能力，并有效抑制其分 化的方法，借助此方法并对肌卫星细胞进行纯化可以得到高纯度的牛肌卫星细 胞，为研究各调控因子在肌卫星细胞增殖与分化过程中的功能和影响提供良好 的细胞模型。

本发明的技术方案如下：

一种促进牛骨骼肌卫星细胞体外增殖的方法，包括以下步骤：

第一步、包含牛miR-133b基因序列的目的序列的获取：

根据牛miR-133b基因序列设计一对PCR引物，在两个引物的5’端分别引 入XhoI酶切位点和BamHI酶切位点，利用该对引物从牛基因组中扩增出包含 miR-133b基因的全长为311bp的一段序列；

第二步、表达载体pEGFP-C1-miR133b的构建：

用XhoI和BamHI双酶切第一步中所得序列及pEGFP-C1载体，通过连接 酶连接，使所述序列插入质粒载体pEGFP-C1的XhoI和BamHI酶切位点，构 建出牛miR-133b基因的表达载体pEGFP-C1-miR133b；

第三步、pEGFP-C1-miR133b转染牛骨骼肌卫星细胞：

用得到的表达载体pEGFP-C1-miR133b，采用脂质体转染试剂转染牛骨骼肌 卫星细胞，使牛骨骼肌卫星细胞过表达微小RNA miR-133b。

而且，所述第一步中包含miR-133b基因的全长为311bp的一段序列进一步 包含牛mir-133b基因84bp，基因前序列95bp，基因后序列132bp，总共311bp。

而且，所述第三步采用脂质体转染试剂转染牛骨骼肌卫星细胞是在转染前 一天把牛骨骼肌卫星细胞培养到六孔板内，使第二天细胞能达到约70%～80%满， 在进行转染前，每孔更换成新鲜的无血清细胞培养液2ml。

一种促进牛骨骼肌卫星细胞体外增殖的方法的应用，通过牛骨骼肌卫星细 胞过表达微小RNA miR-133b的获取，利用miR-133b的作用，提高牛骨骼肌卫 星细胞的体外增殖能力，并有效抑制其分化。

本发明的优点及效果：

1、本发明利用pEGFP-C1构建miR-133b的过表达载体，可以利用EGFP 标签对转染效果进行监测。

2、本发明利用微小RNA对牛肌卫星细胞的增殖和分化进行调控，miR-133b 对细胞增殖和分化的微调作用对细胞的其它生物学特性影响较小。

3、利用本发明在牛骨骼肌卫星细胞过表达微小RNA miR-133b的方法得到 的牛骨骼肌卫星细胞的体外增殖能力强，可以得到高纯度的牛肌卫星细胞，为 研究各调控因子在肌卫星细胞增殖与分化过程中的功能和影响提供良好的细胞 模型。

附图说明

图1是本发明所用质粒载体pEGFP-C1的结构示意图；

图2是本发明构建出的表达载体pEGFP-C1-miR133b的结构示意图；

图3是转染miR-133b48h后牛骨骼肌卫星细胞中miR-133b表达水平与未转 染组的对比图片；

图4是转染miR-133b后牛骨骼肌卫星细胞在添加诱导分化培养基后第3天 图片；

图5是未转染牛骨骼肌卫星细胞在添加诱导分化培养基后第3天图片。

具体实施方式

下面结合具体实施方案对本发明进一步说明，其具体实施方案应该理解为 仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。

本发明的设计思路是：

根据牛miR-133b基因序列设计一对PCR引物，在两个引物的5’端分别引 入XhoI酶切位点和BamHI酶切位点，利用该对引物从牛基因组中扩增出包含 miR-133b基因的全长为311bp的一段序列，利用引入的酶切位点将该序列插入 载体pEGFP-C1，构建出牛miR-133b基因的表达载体pEGFP-C1-miR133b；然 后用得到的表达载体pEGFP-C1-miR133b转染牛骨骼肌卫星细胞，使牛骨骼肌 卫星细胞过表达微小RNA miR-133b，利用miR-133b的作用，提高牛骨骼肌卫 星细胞的体外增殖能力，并有效抑制其分化。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明：

一种促进牛骨骼肌卫星细胞体外增殖的方法，包括以下步骤：

第一步，包含miR-133b基因序列的目的序列的获取：

根据牛miR-133b基因序列（GeneID:100312996；miRBase:MI0009734）设 计一对PCR引物，在两个引物的5’端分别引入XhoI酶切位点和BamHI酶切 位点，利用该对引物从牛基因组中扩增出包含miR-133b基因的全长为311bp的 一段序列（Chromosome:23;AC_000180.1,24312235-24312545），其中包含牛 mir-133b前体基因序列84bp，基因前序列95bp，基因后序列132bp，总共311bp。 将该目的序列连入pUCm-T载体测序验证；

具体步骤是：

（1）牛全血基因组DNA的提取。冷冻血样室温解冻，取0.5mL血液，用 基因组DNA提取试剂盒提取DNA，琼脂糖凝胶电泳检测。

（2）PCR扩增。设计一对含有XhoI和BamHI酶切位点的特异性引物SEQ  ID No.1、SEQ ID No.2，SEQ ID No.1：5’- CCGCTCGAGAGCTCCTTCTGTGTTGCAGG-3’（下划线处碱基表示XhoI酶 切位点），SEQ ID No.2：5’-CGGGATCCGGGCTCCCTTTTTCTCCCTT-3’（下 划线处碱基表示BamHI酶切位点），以牛基因组为模板，按下列条件进行PCR 扩增。

反应体系：25μL反应体系，2x Es Taq MasterMix12.5μL，模板DNA2μL， 引物SEQ ID No.1（10μM）1μL，引物SEQ ID No.2（10μM）1μL，灭菌超 纯水8.5μL。

反应条件:94℃预变性2min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸45s， 循环35次；72℃延伸2min。

琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，得到包含miR-133b基因的全长为311bp的 一段序列SEQ ID No.3，并在其5’端引入了一个XhoI酶切位点，3’端引入了 一个BamHI酶切位点，SEQ ID No.,3： 5’-agctccttctgtgttgcaggcttgaaccagggatgctcgggacacaccaagaatcctcgccctagaggctgcagtc  acctcccccaggagctgccccctgctctggctggtcaaacggaaccaagtccgtcttcctgagaggtttggtccccttcaa  ccagctacagcagggctggcaaagcccagtccttggagaaacagaagagattcgccttctgtggctgaaagtacctacta  ccgtttctcttaagaaaatgactgattttgttatcacactctcatgctctcaggaagggagaaaaagggagccc-3’。

（3）胶回收。琼脂糖凝胶电泳扩增产物，在紫外光灯下切胶，按照胶回收 试剂盒操作说明进行回收。

（4）感受态细胞的制备：取1mL DH5a菌液用CaCl2处理，制成100μL感 受态细胞。

（5）连接与转化：采用10μL连接反应体系，无菌水2μL，纯化后的PCR 产物4μL，10×Ligation Buffer1μL，50%PEG1μL，pUCm-T载体1μL，T4DNA  Ligase1μL。上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于16℃ PCR温仪中保 温过夜（16h），然后将10μL连接产物转入100μL感受态细胞。将细菌涂布在氨 苄青霉素平板上，培养过夜。挑取克隆至含氨苄青霉素的液体培养基中过夜， 提取质粒测序，测序正确的质粒命名为pT-miR133b。

第二步，表达载体pEGFP-C1-miR133b的构建：

用XhoI和BamHI双酶切第一步中所得pT-miR133b及pEGFP-C1载体，通 过连接酶连接，使311bp的目标序列插入质粒载体pEGFP-C1的XhoI和BamHI 酶切位点，构建出牛miR-133b基因的表达载体pEGFP-C1-miR133b，如图1和 图2所示；

具体步骤是：

（1）XhoI和BamHI双酶切步骤1中所得pT-miR133b。

反应体系：20μL反应体系，超纯水11μL，10×Buffer2μL，pT-miR133b5μL， XhoI酶1μL，BamHI酶1μL。

反应条件：37℃1h，80℃5min；

胶回收酶切产物；

（2）XhoI和BamHI双酶切pEGFP-C1载体。

反应体系：20μL反应体系，超纯水11μL，10×Buffer2μL，质粒pEGFP-C1 5μL，XhoI酶1μL，BamHI酶1μL。

反应条件：37℃1h，80℃5min。

胶回收酶切产物。

（3）连接两种胶回收酶切产物。

反应体系：20μL反应体系，目的序列回收产物5μL，质粒pEGFP-C1回收 产物5μL，T4DNA Ligase1μL，T4连接酶缓冲液2μL，超纯水7μL。

反应条件：22℃4h。

转化大肠杆菌DH5α，酶切鉴定连接效果。

进一步经测序证实为正确连接，得到表达载体pEGFP-C1-miR133b（图2）。

第三步，pEGFP-C1-miR133b转染牛骨骼肌卫星细胞：

在转染前一天把牛骨骼肌卫星细胞（实验室自存）培养到六孔板内，使第 二天细胞能达到约70%～80%满，在进行转染前，每孔更换成新鲜的无血清细胞 培养液2ml；

用得到的表达载体pEGFP-C1-miR133b，采用脂质体转染试剂转染牛骨骼肌 卫星细胞，按照脂质体转染试剂说明书进行转染操作，使牛骨骼肌卫星细胞过 表达微小RNA miR-133b。

具体步骤为：

把Lipofectamine2000脂质体转染试剂轻轻混匀。在一洁净无菌离心管内加 入240μl无血清培养基，然后加入10μl Lipofectamine2000；在另一洁净无菌 离心管内加入245μl无血清培养基，然后加入5μl质粒（4μg）；两管液体温 育5min后混合，室温下静置20min；然后将混合液逐滴加入六孔板的一个孔内， 摇动培养板轻轻混匀，二氧化碳培养箱中培养6h；6h后更换为含血清培养基 培养。

第四步，转染效果检测：

（1）转染后miR-133b表达水平的qRT-PCR检测。

转染48h后检测转染水平，采用TRIzol法提取未转染肌卫星细胞和转染后 肌卫星细胞总RNA，按照GeneCopoeia miRNA qRT-PCR检测试剂盒说明进行操 作：

①miRNA First-Strand cDNA合成。

反应体系：25μL反应体系，提取的总RNA5μL，2.5u/μL Poly A Polymerase  1μL，RTase Mix1μL，5×PAP/RT Buffer5μL，超纯水13μL，总体积25μL。

反应条件：37℃1h，85℃5min。

②miR-133b qPCR检测。

反应体系：20μL反应体系，2×All-in-OneTM qPCR Mix10μL，miR-133b 上游引物（引物序列与成熟miR-133b序列相同，2μM）2μL，Universal Adaptor  PCR Primer（2μM）2μL，First-strand cDNA（按1:5用超纯水稀释）2μL，超 纯水4μL。

反应条件：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸15s， 40个循环；溶解曲线制作温度范围65℃～95℃,0.5℃/time，6s/time。

结果：转染后48h，转染后肌卫星细胞中miR-133b表达量比未转染肌卫星 细胞高出6.39倍，说明pEGFP-C1-miR133b转染成功并提高了目标基因的表达 量（图3）。

（2）转染后miR-133b促进肌卫星细胞增殖及抑制分化的效果。

转染48h后将未转染肌卫星细胞和转染后肌卫星细胞更换为含2%马血清 的分化培养基进行培养，观察肌卫星细胞的增殖和诱导分化效果。

分化培养基添加后第3天，未转染组肌卫星细胞分化明显，形成了粗大的 肌管（图4），而转染miR-133b组未见明显粗大肌管出现，仅见零星小肌管出现 （图5），说明了miR-133b过表达可以促进牛骨骼肌卫星细胞增殖，并有效抑制 其分化。