一种肉用模仿葡萄球菌L-RG18发酵培养基及其高密度培养方法

摘要

本发明公开了一株分离于法国干香肠且具有优良发酵特性的模仿葡萄球菌L-RG18(Staphylococcus simulans L-RG18)的高密度发酵技术，包括发酵培养基和发酵工艺条件优化控制，以及重复分批耦合细胞循环的高密度培养模式。通过本发明可以得到活菌数为3.72×10

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及肉用发酵剂模仿葡萄球菌L-RG18发酵培养基、培养条件以及高密度培养方法。 

背景技术

葡萄球菌是发酵肉制品生产中一类重要的微生物。在肉制品发酵过程中，它能产生硝酸盐和亚硝酸盐降解酶，从而使肉呈现鲜艳的玫瑰红色，一些葡萄球菌还能产生H₂O₂酶，不仅有利于发酵香肠护色，还能对抑制腐败起到重要作用。此外，它们能产生降解蛋白质和脂肪的酶，酶解产物在干发酵香肠特征风味形成中起了重要作用。筛选具有优良发酵特性的葡萄球菌，并通过将其制备成直投式发酵剂在生产中大规模应用是目前的研究重点。国外开发的商业肉品发酵剂仅有木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌（Cocolin et al.,Applied and environmental microbiology,2006,72(1):942-945;Corbiere et al.,Journal of applied microbiology,2007,102(1):238-244），而我国对葡萄球菌发酵剂研究还处于菌种的选择和筛选阶段，对其工业化生产技术即高效发酵剂制备技术研究还鲜见报道。国内孔保华等人研究了木糖葡萄球菌的发酵方法（201110258768.5，木糖葡萄球菌A2的高密度培养的培养基及培养方法），但仍然采用培养基成分优化基础上的分批培养方式，此法虽然简单，但所得的菌体密度不高，只有约10⁹CFU/mL。 

利用高密度培养得到高浓度细胞培养物是制备高效发酵剂的基础。常见的高密度培养方法有补料分批培养、固定化细胞培养等。近年来，随着膜技术的发展，越来越多的研究运用膜从培养基中分离微生物细胞。典型的膜生物反应器包括一个连续培养发酵罐和一个错流过滤膜组件，从而保证持续的细胞循环并排除代谢产物。在这样的循环系统中，细胞浓度能达到很高的水平。膜细胞循环发酵在一些微生物初级及次级代谢产物发酵中得到了有效应用，例如乳酸，木糖醇，乙醇的生产（Nishiwaki et al.,Biochemical Engineering Journal.1999,4:37-44;Oh et al.,Applied Biochemistry And Biotechnology.2003,107:603-613;Roca et al.,Applied Biochemistry And Biotechnology.2003,60:560-563）另外，重复分批发酵能节省发酵中因清洗、灭菌和接种而耗费的时间，在一些酵母菌代谢产物发酵中得到了有效应用(Koh et al.,Biotechnology Letters.2003,25:2103-2105;Rymowicz et al.,Applied Biochemistry And Biotechnology.2010,87:971-979)。利用膜细胞循环耦合重复分批发酵能结合两者发酵方式的 优点,提高发酵罐菌体密度、缩短生产周期、减轻下游细胞分离难度，从而提高生产效率，但利用此方法对模仿葡萄球菌进行高密度培养还未见报道。 

本发明针对一株从法国干香肠中分离得到且具有较强的硝酸还原酶能力、产过氧化氢酶能力、水解干酪素、脂肪和脱脂奶粉能力，耐NaNO₂、耐盐性能优良的模仿葡萄球菌L-RG18，通过优化液体发酵培养基及培养条件，并对其高密度培养方法进行研究，旨在提高发酵液中模仿葡萄球菌活菌密度，为进一步制备其直投式发酵剂奠定基础。 

发明内容

本发明的目的在于提供模仿葡萄球菌L-RG18优化发酵培养基配方。 

本发明的另一目的在于提供模仿葡萄球菌L-RG18优化发酵条件。 

本发明的另一目的在于提供模仿葡萄球菌L-RG18高密度培养方法。 

所述的模仿葡萄球菌L-RG18为本发明人从法国干香肠（Justin Bride）中分离并鉴定的菌种。经研究表明，它具有较强的硝酸还原酶能力、产过氧化氢酶能力、水解干酪素、脂肪和脱脂奶粉能力，耐NaNO₂、耐盐性能优良，是一株可以选作肉用发酵剂的优良菌株 

本发明的目的是通过如下技术方案实现： 

本发明提供一种模仿葡萄球菌L-RG18发酵培养基，其主要成分、含量及培养基配置条件如下：基础培养基，蜂蜜6-10g/L、番茄汁10-20g/L、，玉米浆5-7g/L，再使用中和剂调节pH值至7.0-7.6，121℃灭菌20分钟。其中,番茄汁、蜂蜜、玉米浆制备方法如下： 

蜂蜜制备工艺：取市售洋槐蜂蜜，无菌水稀释10倍后用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。 

番茄汁制备工艺：将番茄用清水洗净，将其放入90-95℃水中热烫3min，用番茄打浆机打浆，然后用8层纱布过滤，将滤液于100℃灭菌15min，冷却后4℃保存备用。 

玉米浆制备工艺：取市售玉米浆，无菌水稀释10倍后用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。 

根据本发明的一种优选方式，所述基础培养基为生长培养基，其配方为：酪蛋白胨10g/L，牛肉浸膏1g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾3g/L。 

根据本发明的一种优选方式，所述的蜂蜜、番茄汁、玉米浆添加量分别为8.75g/L、14.97g/L、5.96g/L。 

根据本发明的一种优选方式，所述中和剂调节pH值为7.4，中和剂为1mol/L NaOH。 

其次，本发明涉及一种模仿葡萄球菌L-RG18高密度培养方法，其主要步骤如下： 

（1）种子培养液的制备：将冷冻保存的模仿葡萄球菌L-RG18菌粉接种于发酵培养基试管中，28-34℃摇床培养18-20h，摇床转速为140-230rpm/min，以1%接种量在试管中连续活化三代，然后以1%接种量接种于三角瓶中，28-34℃，140-230rpm/min培养18-20h制得种子培养液。 

（2）细胞循环培养：将种子培养液以0.5-1%接种量接种于5L发酵罐中，发酵罐工作体积为3L，培养温度28-34℃，转速140-230rpm/min，微通空气。通过流加一定浓度中和剂维持发酵液pH为7.0-7.6。在发酵至菌株生长对数末期开始第一次细胞循环，即泵出一定体积发酵液，同时泵入同体积新鲜培养基以维持发酵液体积恒定，周期性循环若干次后继续培养至发酵液活菌数不再增加时停止发酵。 

根据本发明的一种优选方式，所述步骤（1）（2）中培养温度为30℃，转速为200rpm/min。 

所述步骤（1）中三角瓶体积为500mL，装液量为100-150mL。 

根据本发明的一种优选方式，所述步骤（2）中维持发酵液pH值为7.4，所使用的中和剂为4mol/L NaOH。 

所述步骤（2）中微通空气是以1.2-1.8NL/min流量通入无菌空气。 

所述步骤（2）中菌株生长对数末期为发酵第8h，即发酵至8h时开始第一次细胞循环。 

所述步骤（2）中泵出发酵液体积与泵入新鲜发酵液体积均为1.5L。 

所述步骤（2）中发酵罐中发酵液每隔4小时循环1次，连续循环4次。 

所述步骤（2）中细胞循环系统由2个蠕动泵和1个分子截流量为2000Da聚醚砜超滤膜组件构成，它们负责过滤发酵液并将细胞返回至发酵罐中。其中一个蠕动泵负责控制发酵罐和外膜的循环，另外一个蠕动泵负责调控外膜过滤液流量。发酵前连接各组件的管道在使用前需经高压蒸汽灭菌，而聚醚砜超滤膜在使用前首先在5mg/mL H₂O₂溶液中浸泡2h，然后用无菌水冲洗反复冲洗3次。 

本发明具有如下有益效果: 

1、模仿葡萄球菌L-RG18在最适培养条件及发酵培养基中相对于基础生长培养基活菌数提高了23倍以上，活菌数由1.52×10⁸CFU/mL增加到3.57×10⁹CFU/mL。 

2、模仿葡萄球菌L-RG18在5L发酵罐中采用重复分批发酵耦合细胞循环方式进行高密度培养，其活菌数（3.72×10¹¹CFU/mL）显著高于5L发酵罐分批培养（3.75×10⁹CFU/mL）及补料分批培养（4.0×10¹⁰CFU/mL），实现了模仿葡萄球菌的高密度发酵。同时减少了下游 生物量分离难度，避免发酵罐重复清洗、灭菌及接种，提高了生产效率。 

附图说明

图1为菌株L-RG18在不同基础培养基中生长情况 

图2为菌株L-RG18在不同浓度蜂蜜条件下的生长情况 

图3为菌株L-RG18在不同浓度番茄汁条件下的生长情况 

图4为菌株L-RG18在不同浓度玉米浆条件下的生长情况 

图5为Y=f(A,B)响应面立体分析图及等高高线图 

图6为Y=f(A,C)响应面立体分析图及等高高线图 

图7为Y=f(B,C)响应面立体分析图及等高高线图 

图8为菌株L-RG18在不同pH条件下的生长情况 

图9为菌株L-RG18在不同培养温度条件下的生长情况 

图10为菌株L-RG18在不同转速条件下的生长情况 

图11为菌株L-RG18在5L发酵罐中分批培养 

图12为菌株L-RG18在5L发酵罐中补料分批培养 

图13为菌株L-RG18在5L发酵罐中重复分批耦合膜过滤培养 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 

若未特别指明，本发明实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得，若未具体指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。 

酪蛋白胨、牛肉浸膏、葡萄糖、氯化钠、磷酸氢二钾等试剂购于北京蓝弋化工产品有限责任公司； 

洋槐蜂蜜购于北京御蜂堂蜂业专业合作社，玉米浆购于华北制药康欣有限公司； 

5L发酵罐（上海保兴生物设备工程有限公司，BIOTECH-2002）过滤模具(北京金峡过滤磨具有限公司，截留分子量1000Da)； 

模仿葡萄球菌L-RG18分离于法国干香肠（Justin Bridou），现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年9月25日，保藏编号为CGMCC No.8227，分类命名为Staphylococcus simulans。 

实施例1 模仿葡萄球菌L-RG18发酵培养基优化 

菌株活化:将冷冻保存的模仿葡萄球菌L-RG18菌粉接种于MSA培养基试管中，30℃摇床培养18h，摇床转速为140rpm/min，以1%接种量在试管中连续活化三代，使得活菌数达到10⁷-10⁸CFU/mL即得活化菌株。 

1、基础培养基的筛选 

研究了5种不同的液体基础培养基：TSB，MSA、营养肉汤、M17、生长培养基。其中生长培养基配方为：酪蛋白胨10g/L，牛肉浸膏1g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾3g/L，配置时调节pH值为7.4。分别将活化好的模仿葡萄球菌L-RG18以1%接种量接种于5种培养基中，摇床转速为140rpm/min，培养温度为30℃，培养18h后测定发酵液活菌数，观察不同培养基对菌株L-RG18的增殖效果。根据图1结果表明模仿葡萄球菌L-RG18在5种培养基中均能生长，但在生长培养基中生长效果显著优于其它4种培养基（P<0.05），故选择生长培养基为模仿葡萄球菌L-RG18的基础培养基。 

2、发酵培养基配方确定 

（1）营养因子添加的单因素试验 

以生长培养基为基础，在其中分别添加不同浓度的蜂蜜、番茄汁、玉米浆（试验设计见表1），摇床转速为140rpm/min，30℃培养24h后测定发酵液活菌数。试验结果如图2-4所示，在蜂蜜添加量为8g/L、番茄汁添加量为15g/L、玉米浆添加量为5g/L时发酵液活菌数最大。蜂蜜、番茄汁、玉米浆中均含有多种的矿物质或维生素、氨基酸等生长因子，适宜的浓度对菌株的生长具有一定的促进作用，但过高的浓度也会抑制菌株生长。因此，选择蜂蜜、番茄汁、玉米浆浓度分别为8g/L、15g/L、5g/L作为后续响应面试验的中心水平。 

表1 营养因子单因素试验设计 

（2）营养因子添加的响应面优化 

在单因素试验的基础上，根据Box-wilson的中心组合实验设计，设计了包括零水平、上下水平、上下星号臂的三因素5水平的响应面实验（RSM）(见表2)，以活菌对数为响应值，考察不同营养因子组合对菌株生长的影响，从而优化模仿葡萄球菌L-RG18的最佳发酵培养基。利用Design-Expert软件对表3中数据进行回归分析，得到二次回归方程：活菌数 (lgCFU/mL)=9.34-0.017*A+0.15*B+0.20*C-0.16*A*B+0.10*A*C+0.035*B*C-0.088*A2-0.24*B2-0.28*C2。二次多项式回归分析结果显示（见表4），模型对试验拟合良好，蜂蜜、玉米浆对菌株生长影响显著，番茄汁与蜂蜜、番茄汁与玉米浆的交互作用对菌株生长影响显著。图5-7是根据多元回归分析所作的响应面曲面图，通过响应面数据分析得蜂蜜、番茄汁、玉米浆最适添加量分别为8.75g/L，14.97g/L，5.96g/L，最大相应值为9.47，在该条件下进行三次验证，得到平均响应值9.42，与理论值接近，表明所建立的回归模型合理。此条件下菌株L-RG18活菌数达到了2.63×10⁹CFU/mL，相对于基础培养基（1.52×10⁸CFU/mL）提高了17倍以上。 

表2 中心组合实验因素水平表 

表3 中心组合实验设计及结果 

表4 中心组合模型的方差分析 

实施例2 模仿葡萄球菌L-RG18发酵条件优化 

1、最适pH的确定 

将活化好的模仿葡萄球菌L-RG18以1%接种量分别接种到pH值为7.0、7.2、7.4、7.6的优化发酵培养基中，30℃，140r/min振荡培养18h，测定不同条件下发酵液活菌数。试验结果如图8所示，培养基初始pH值对菌株生长影响较大，培养基初始pH值为7.4时增菌效果明显高于其它组（P<0.05）。过高或过低pH值对菌株生长都有一定的抑制作用，因此选择模仿葡萄球菌L-RG18培养基初始pH值为7.4。 

2、最适温度的确定 

将活化好的模仿葡萄球菌L-RG18以1%接种量接种到优化的发酵培养基中，分别在28℃、30℃、32℃、34℃温度下，140r/min振荡培养18h，测定不同条件下发酵液活菌数。试验结果如图9所示，菌株在30℃生长效果明显好于其它三个温度（P<0.05），当外界温度高于最适生长温度，细菌可能被杀死；当低于最低生长温度时，细菌代谢活动受到抑制，则表现抑菌作用，因此选择30℃为模仿葡萄球菌L-RG18的最适培养温度。 

3、最适转速的确定 

将活化好的模仿葡萄球菌L-RG18以1%接种量接种到优化的发酵培养基中，分别在140r/min、170r/min、200r/min，230r/min转速下，30℃振荡培养18h，测定不同条件下发酵液活菌数。试验结果如图10所示，转速越高，活菌数随之增加，转速在170～230r/min时转速对菌株生长影响不显著（P>0.05），从节能和生物量的角度综合考虑选择200r/min作为模仿葡萄球菌L-RG18培养的转速条件。此条件下菌株L-RG18活菌数达到了3.57×10⁹CFU/mL，相对于基础培养基（1.52×10⁸CFU/mL）提高了23倍以上。 

实施例3 模仿葡萄球菌L-RG18的高密度培养 

1、种子培养液的制备：将冷冻保存的模仿葡萄球菌L-RG18菌粉接种于发酵培养基试管中，30℃，200r/min培养18h，以1%接种量在试管中连续活化三代，然后以1%接种量接种于装有150mL发酵培养基的三角瓶（500mL）中，30℃，200r/min培养18h制得种子培养液。 

2、高密度培养方式确定 

（1）5L发酵罐分批培养 

将种子培养液以1%接种量接种于5L发酵罐中，装液量为3L，培养温度为30℃，搅拌转速为200r/min，无菌空气通入流量为1.7NL/min。发酵时间为24h，发酵期间每隔一定时间取样测定发酵液活菌数和残糖质量浓度。试验结果如图11所示，模仿葡萄球菌L-RG18在5L发酵罐中生长无明显延滞期，8h即进入稳定期，最高点活菌数为3.75×10⁹CFU/mL。 

（2）5L发酵罐补料分批培养 

将种子培养液以1%接种量接种于5L发酵罐中，装液量为3L，培养温度为30℃，搅拌转速为200r/min，无菌空气通入流量为1.7NL/min。发酵到8h时以0.4g/h（以葡萄糖计）流加新鲜发酵液，流加20h，同时通过流加4mol/L NaOH维持发酵液pH值恒定在7.4。发酵34h，发酵期间每隔一定时间取样测定发酵液活菌数。试验结果如图12所示，同分批培养相比，菌株生长对数期延长，在培养20h后进入稳定期，最大活菌数达到4.0×10¹⁰CFU/mL。 

（3）5L发酵罐重复分批耦合细胞循环培养 

将种子培养液以1%接种量接种于5L发酵罐中，装液量为3L，培养温度为30℃，搅拌转速为200r/min，无菌空气通入流量为1.7NL/min。同时通过流加4mol/L NaOH维持发酵液pH值恒定在7.4。在发酵至8h开始第一次细胞循环，泵出1.5L发酵液，同时泵入同体积新鲜培养基以维持发酵液体积恒定，每4小时一个循环，连续循环4次，继续培养至细胞浓度不再增加时停止发酵，发酵期间每隔一定时间取样测定发酵液活菌数。试验结果如图13所 示，同补料分批发酵相比，菌株生长对数期进一步延长，经4次细胞循环活菌数最大值达到3.72×10¹¹CFU/mL，比分批发酵相比活菌数提高了2个数量级，比补料分批培养相比活菌数提高了1个数量级。因此，本试验所述的重复分批耦合细胞循环培养方法是模仿葡萄球菌L-RG18优选的高密度培养方法。 

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。