在重组FVIII的生产中提高真核细胞生产率的方法

摘要

本发明涉及一种增加重组凝血因子VIII(rFVIII)的生产率的方法，所述生产率特别是细胞特异性生产率，所述重组凝血因子VIII是在真核细胞悬浮液在培养基中的培养期间在所述真核细胞悬浮液中产生的，所述培养基含有不超过500μMCaCl

说明书

技术领域

本发明涉及在细胞培养期间提高重组人凝血因子VIII(rFVIII)的产率的方法。

背景技术

本发明提供提高通过培养细胞（特别是哺乳动物细胞）进行的蛋白质生产中的产率的方法。具体而言，本发明涉及制备蛋白质产物的方法，例如糖蛋白产物，其中蛋白质产物特性通过操作细胞培养环境以增加施加至细胞的应力而被控制。

大部分生物技术产物，无论是可商购的或正在研发中的，都是蛋白治疗剂。对于哺乳动物细胞培养物中的蛋白质生产以及这种生产相关的改进的方法的需求很大并逐渐增加。特别是当以细胞表达水平生产大糖蛋白时，更需要这种改进的方法。一种这样的蛋白质，FVIII，其表达水平比在哺乳动物细胞中生产的其他重组蛋白质低至少两至三倍。大规模治疗性蛋白质生产的晚期研发中遇到的一个普遍的问题是由于较大的临床试验而导致需求量逐渐增加以及细胞培养物生产设备中污染导致产能降低。为满足增加的需求量，可通过几种方式提高总生产水平。但是，大多数方式（例如找到更好的细胞克隆或改进培养介质）都非常耗时，因此通常并非是足够快速的选择。增加生产率的其他方式是增加生产规模或在补料分批模式或灌注模式培养中增加细胞密度。而且，这些过程变化伴随大的投资成本，并且对于高密度培养的情况，培养槽中的氧限制通常给可用于生产的最大细胞密度设定了一个限值。因此，本领域中需要新的增加生产率的方法。

Keane J.T.等在Effect of shear stress on expression of a recombinant proetine by chinese hamster ovary cells; Biotechnology and Bioengineering, 81:211-220, 2003中使附着CHO细胞经受剪切力32 h并监控重组人生长激素生产以及葡萄糖代谢。他们观察到，当剪切力从0.005 N/m² (0.02 W/m³)增加至0.80 N/m² (6.4 x 10² W/m³)时，重组蛋白质生产速率降低51 %，葡萄糖吸收速率增加42 %，并且乳酸生产降低50 %。

Godoy-Silva R 等在 Physiological responses of CHO cells to repetitive hydrodynamic stress; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, No. 6, August 15, 2009中检验了重复的水动力应力对CHO细胞的影响，并得出结论：最高至6.4 x 10⁶ W/m³的能量耗散率不会影响细胞生长、死亡和生产率。

J.A. Frangos等在Shear stress induced stimulation of mammalian cell metabolism; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 32, Pp. 1053-1060(1988)中公开了一种流动仪，用于研究贴壁依赖性细胞在控制良好的情况下对各种稳定的和脉冲式的剪切应力的代谢响应。数据证实，稳定剪切应力的生理水平以及剪切力的开始急剧刺激培养的人内皮细胞中的前列腺环素的产生。

Giard和他的同事们观察到，当维持在旋转烧瓶中的微载体上时，与在滚瓶中的细胞相比，人成纤维细胞分泌的干扰素的量增加最多30倍(D.J. Giard, D. H. Loeb, W. G. Thilly, D. 1. C. Wang, and D.W. Levine, Biotechnol. Bioeng., 21, 433(1979))。因为旋转烧瓶中细胞被施加的剪切应力比滚瓶中的细胞大得多，产量的增加可归因于干扰素合成的剪切诱导刺激。

Timm Tanzeglock等, Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 104, No. 2, October 1, 2009公开了细胞所经受的剪切流类型是否会影响细胞死亡的启动。实际上，哺乳动物细胞区分离散类型的流并做出不同响应。该文献中使用了两种流装置，以施加精确的流体动力学流场：均一且稳定的简单剪切流和振动拉伸流(oscillating extensional flow)。为区分坏死性细胞死亡和凋亡性细胞死亡，使用了荧光激活细胞分选和培养物上清液DNA释放。结果显示，在振动拉伸流中，当受到低水平流体动力学应力(约2Pa)时，中国仓鼠卵巢细胞和人胚肾细胞将进入凋亡路径。相反，当细胞在简单剪切流中，受到流体动力学应力为约1Pa时，或在拉伸流中，应力约500Pa时，主要是坏死性死亡。当培养细胞用于重组蛋白生产时，细胞进入各死亡路径的这些阈值应当避免，以增强培养时间和生产率。

WO 2006/103258A1公开了一种增加蛋白质产率的方法，包括培养真核细胞和在收集蛋白质之前将离子物质添加至培养基。合适的离子物质是霍夫迈斯特序的盐以及氨基酸。

WO 2008/006494A1公开了一种在反应器的细胞培养基中悬浮培养细胞的方法，所述细胞优选是E1-永生HER细胞，更优选是PER.C6细胞，其中细胞产生生物学物质，优选是抗体，其中至少一种细胞培养基成分被添加至细胞培养物，并且其中包含细胞、生物学物质和细胞培养基的细胞培养物经分离系统被循环，其中分离系统将生物学物质与具有比生物学物质分子量低的物质分离，其中生物学物质被保留在或输送回至反应器。优选地，一部分所述较低分子量的物质被连续地从细胞培养物中移除。

Zhang, Hu等在Current Pharmaceutical Biotechnology, Volume 11, Number 1, January 2010, pp. 103-112(10)中报道称，哺乳动物细胞培养在最近十几年在生产蛋白质治疗剂方面起到重要作用。哺乳动物细胞培养的工艺开发中考虑了许多工程学参数以实现工艺优化，但该文章中仅特别研究了剪切和混合。该文章认为，之前高估了由搅拌引起的剪切应力对细胞损伤的作用，但剪切可导致非致死性的生理反应。在气泡形成、破裂并聚集的区域，没有出现细胞损伤，但剪切应力在气泡升起之后变得显著，并且在泡沫破裂区域对细胞造成很大损伤。混合不足以在大规模生物反应器中提供均质溶解的氧张力、pH、CO2和营养物质，这会为细胞生长、产物形成和工艺控制带来严重的问题。缩减反应器(scale-down reactors)已被开发出来以解决并行操作的混合问题和剪切问题。常规的和最近开发的缩减生物反应器的工程特征已作简要介绍。文中还展望了以高细胞密度进行工业细胞系培养的工艺困难以及用于再生医疗、组织工程和基因治疗的干细胞培养和其他人细胞培养的工艺困难。重要的技术正在开发以解决这些困难，例如单细胞分析的微米级操作和纳米级操作(光镊子)，用于剪切和混合特征化的计算机流体动力学(CFD)以及微型生物反应器。

Timothy A. Barrett等在Biotechnology and Bioengineering, Vol. 105, No. 2, pages 260-275报道了有关震荡微板式的实验，为细胞培养条件的快速评价和优化提供了潜在的平台技术。该文章描述了微孔系统中液体混合和气液传质的详细工程特性以及它们对悬浮细胞培养的影响。

如果细胞生长和抗体生产动力学与目前使用的摇瓶系统中的相当，那么该微孔方法为更加便宜地且以降低的材料要求获得早期工艺设计数据提供了可能性。该工作描述了微孔系统中液体混合和气液传质的详细工程特性以及它们对悬浮细胞培养的影响。对于生产IgGl的小鼠杂交瘤细胞的生长，查明了24孔平板在能量耗散(P/V)(通过计算机流体动力学，CFD)、流体流动、混合以及氧传输速率方面与震荡频率和液体填充提及的关系。预测的k_La值为1.3至29h^-1；液相混合时间(经碘退色实验定量)为1.7 s至3.5 h；而预测的P/V为5至35 W m^-3。CFD模拟剪切速率预测的流体动力学力不会对细胞有害。但对于杂交瘤培养物，高震荡速度(>250 rpm)对细胞生长有负面影响，而低震荡速度与高孔填充体积的结合(120 rpm; 2,000μL)导致出现氧有限情况。基于这些发现，在匹配的平均能量耗散率下，进行微孔和摇瓶形式中细胞培养动力学的第一工程学比较。细胞生长动力学和抗体滴度在24孔微量滴定板和250 mL摇瓶中类似。整体上，该工作证实了在震荡微孔板中进行的细胞培养能够提供可在目前使用的摇瓶系统中重复并且与其相当的数据，同时操作规模和材料要求降低了至少30倍。结合自动化，该方案为实现在实际的悬浮培养条件下稳健的细胞系的高通量评价提供了途径。

William G. Whitford和John S. Cadwell在BioProcess International 2009, Vol. 7, No. 9, pages 54-64报道了人们对中空纤维灌注生物反应器的兴趣渐增。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增加重组凝血因子VIII(rFVIII)的生产率的方法，特别是其细胞特异性生产率，所述重组凝血因子VIII特别是在真核细胞悬浮液在培养基中的培养期间在所述真核细胞悬浮液中产生的人rFVIII，所述培养基含有不超过500 μM CaCl₂、至少一种非离子清洁剂以及细胞生长和rFVIII产生所需的其他营养成分，其特征在于，所述细胞悬浮液是在通过机械装置诱导剪切应力施加至真核细胞悬浮液的条件下培养的。该剪切应力通过向细胞悬浮液中添加高于3 W/m³的功率密度输入而实现的。诱导剪切应力的条件是包括诱导细胞悬浮液的机械运动或诱导悬浮液中细胞的机械运动在内的事件。通常，剪切应力被直接施加至培养的细胞。机械装置特别是那些能够搅拌细胞培养悬浮液的装置。

虽然本发明的效果已通过HEK293研究，这些细胞是典型的人细胞，本领域技术人员可以预期到，HEK293细胞所获得的结果也可由其他人细胞系的细胞获得。

机械装置所引入的功率输入(功率密度，能量耗散率的等效术语，ε)是根据下式计算出来的：ε =Np · n³ · di⁵)/V，其中Np是叶轮的紊流功率数(turbulent power number)，n是搅拌速率(叶轮转数/秒)，di是叶轮直径(米)，V是培养基体积(立方米)。添加至细胞悬浮液以引入剪切应力的功率不应超过细胞被破坏时的值，通常不应超过2000 W/m3的最大值。特别地，添加至细胞悬浮液以引入剪切应力的功率密度为3W/m3至2000 W/m3，优选为15 W/m3至1500 W/m3，更优选为30 W/m3至1250 W/m3，更优选为50 W/m3至1000 W/m3。

在本发明的一个实施方式中，该功率是通过细胞悬浮液的机械运动被引入的。在本发明的另一个实施方式中，细胞悬浮液的机械运动是通过将细胞悬浮液泵送通过切向过滤膜(例如中空纤维膜)而进行的，或者细胞悬浮液的机械运动是通过转动元件(例如搅拌器、螺旋桨或叶轮)来进行的。

特别地，rFVIII是B结构域缺失的rFVIII，特别是人B结构域缺失的FVIII。

在本发明的另一个实施方式中，所述真核细胞是HEK293细胞。rFVIII分子特别是在HEK293细胞的表面产生并累积。为分离rFVIII，使用将rFVIII从细胞表面分离的条件将是有利的，例如通过增加细胞周围介质的离子强度或弱化rFVIII与HEK293细胞表面的吸引力的其他手段。

在本发明的另一个实施方式中，所述非离子清洁剂选自Pluronic-F68、Tween 20和Tween 80。通常，非离子清洁剂的浓度为0.00001wt%至1wt%，特别是0.0001wt%至0.1wt%，最合适地为0.001wt%至0.01wt%。

在本发明的方法的另一个实施方式中，培养基中的低CaCl₂浓度被调节，以用于控制细胞聚集，例如使细胞聚集最小化。

根据本发明，功率可通过细胞悬浮液的机械运动而被引入至细胞培养中。细胞悬浮液的机械运动可通过例如搅拌器或机械类似物(如震荡装置)来进行。

在本发明的一个特别的实施方式中，由于例如细胞悬浮液的机械起始运动导致的功率密度输入是通过装配有叶轮的培养容器启动的，或者是通过例如无叶轮或类似装置的一次性wave?培养袋的培养容器启动的，取而代之的是以地球引力移动培养袋(具有例如摇摆机)，从而诱导所述细胞悬浮容器中的剪切应力，或者细胞悬浮容器中的剪切应力通过将细胞悬浮液泵送通过静态混合物或过滤装置来诱导。

附图说明

图1是活细胞密度曲线。

图2是累积的FVIII:C曲线。

图3是细胞特异性增长速率。

图4是不同搅拌速率下连续培养操作中细胞特异性生产率。

图5是连续培养中连续离心与ATF中空纤维装置相比较的细胞特异性生产率。

具体实施方式

在本发明的方法中，与常规方法相比，通过引入较高功率获得的较高机械能被施加至含有真核细胞悬浮液的培养容器中，该真核细胞培养液产生rFVIII。功率的量可依据能力耗散来确定，但其他参数也可与功率输入相关联。本发明是基于当细胞在摇瓶或搅拌罐生物反应器中以高搅拌速率被搅拌时得到异常高的FVIII生产率而完成的。

根据本发明，可使用任何真核细胞或细胞系，特别地，该真核细胞是HEK293细胞。如例如WO-A-2001/070968和WO-A -2007/003582所公开的，该基因改造的细胞生产rFVIII，特别是B结构域缺失的rFVIII。

在HEK293细胞中制造rRVIII分子是本发明的方法的一个特别的实施方式，并将下文的实施例中进一步解释。

在本发明的方法中，已显示出，HEK293细胞中产生的rFVIII分子与细胞相连并在产生在细胞内部后附着至细胞表面，这在以下文献中作了进一步描述：WO-A-2006/103258, Kohlind 2010 (Kohlind et.al., The B-domain of Factor VIII reduces cell membrane attachment to host cells under serum free conditions. Journal of Biotechnology, 147 (2010), 198-204.)和Kohlind 2011 (Kohlind et.al., Optimisation of the Factor VIII yield in mammalian cell cultures by reducing the membrane bound fraction. Journal of Biotechnology, 151 (2011), 357-362.)。

在本发明的方法中，用于细胞生长和rFVIII生产的培养基含有非离子清洁剂。通常，单月桂酸山梨醇酐酯的聚氧乙烯衍生物，例如Tween^?，它是一个包含许多产品的家族，通过聚氧乙烯链长和脂肪酸酯部分区分。另一种有用的非离子清洁剂是Poloxamer，它们是非离子三嵌段共聚物，由聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中央疏水链以及两侧的聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两个亲水链构成。Poloxamer也被称为商品名Pluronics^?。非离子清洁剂可选自Pluronic-F68、Tween 20和Tween 80，特别地，浓度为0.00001wt%至1wt%，或0.0001wt%至0.1wt%，或0.001wt%至0.01wt%。

以下更详细地描述本发明的方法。在125 mL的带挡板的E-瓶(E-bottle)中，以不同震荡频率培养细胞。虽然细胞生长曲线与在低速搅拌和高速搅拌培养中类似(图1)，但在3天的分批培养后，高速搅拌培养物中的累积生产率惊人地高出83%(图2)。

本发明的另一个实施方式以分批模式培养在平行的受控搅拌槽生物反应器中进行。经受较高机械应力的培养物相比于低速搅拌培养物而言显示出较高的生产率。这显示出，虽然其他培养参数(例如pH、DOT(溶解氧张力)和温度)保持恒定，但较高速的搅拌导致生产率增加。

在另一个实施方式中，在一个2L的搅拌槽生物反应器中，以灌注模式培养实验性地检验本发明。该培养以稳定状态灌注模式运行，指数生长的细胞被保持在期望的细胞密度，这通过将细胞从反应器中排出而实现，排出的速率使得保持反应器中的细胞密度恒定。虽然其他培养参数保持恒定，但较高搅拌速率增加了细胞特异性生产率。

在另一个实施方式中，在一个100L的生产规模生物反应器中实验性地检验本发明，该反应器以灌注模式运行以实现较高的细胞密度。该实验证实，通过增加剪切力以及有增加的搅拌引起的能量输入，在大规模培养中也可实现生产率增加。

在另一个实施方式中，在一个2L的搅拌槽生物反应器中实验性地检验本发明，该生物反应器以灌注模式运行，并且具有连续离心单元或以交替式切向流(ATF)运行的中空纤维单元。令人惊讶的是，通过ATF单元添加至培养物的增加的剪切也使得FVIII产率增加。

实施例

实施例1

将生产BDDrFVIII的指数生长的HEK293F细胞离心，其后将细胞团块重悬于无血清细胞培养基中至活细胞密度为0.5x10⁶个细胞/mL。其后，将细胞在125 mL的带挡板的锥形瓶中培养，锥形瓶置于震荡培养箱中，100 rpm或200 rpm，5%/95% CO₂/空气覆盖，37℃。通过台盼蓝排除法和Cedex (Innovatis)自动细胞计数器每天测定所有培养物中的细胞密度。通过将细胞悬液中的离子浓度增至1 M NaCl + 30 mM CaCl₂而将累积的FVIII从细胞释放。离心去除细胞，发色底物法(Coatest^? SP FVIII)测定FVIII。生长曲线类似(图1)，但高速搅拌培养物在3天的分配培养后显示出高出83%的累积FVIII:C浓度(图2)。

实施例2

在具有6个0.4L的生物反应器的设备(Multifors, Infors)中，在不同搅拌速率下，以分批模式并行培养产生BDDrFVIII的HEK293细胞。目的在于检验搅拌速率如何在其他细胞培养参数保持恒定的受控环境下影响生产率。为了能够检验高搅拌速率(>300 rpm)，生物反应器的搅拌电机(通常用于细胞培养应用)被换成更强力的搅拌电机(通常用于细菌培养应用，可运行至1200 rpm)。溶解氧张力(DOT)设定点被设置成90%，并且通过细胞悬浮液中的鼓泡石(sparger stone)添加空气来调节。使用Cedex (Innovatis)细胞计数器测定活细胞密度、存活率和聚集速率。通过将细胞悬浮液中的离子强度增至1 M NaCl + 30 mM CaCl₂来从细胞释放累积的FVIII。离心去除细胞，发色底物法(Coatest^? SP FVIII)测定FVIII。表1中显示了所检验的搅拌速率、能量耗散率(本文所述功率密度的等效术语)(ε)和细胞特异性生产率(gp)。200至950 rpm的增加的搅拌速率增加了细胞特异性生产率。1200 rpm处qp相比于950rpm处降低，显示高于950rpm导致生产率下降。

表1

实施例3

在一个2L搅拌槽生物反应器中，以连续稳定状态灌注培养模式培养生产BDDrFVIII的HEK293细胞。该生物反应器使用90 mm的斜叶片叶轮以实现搅拌。使用中空纤维过滤器实现培养基更换，该过滤器也对细胞悬浮液造成剪切。在实验期间，除搅拌速率外，所有细胞培养参数都被保持恒定。使用Cedex (Innovatis)细胞计数器测定活细胞密度、存活率和聚集速率。通过将细胞悬浮液中的离子强度增至1 M NaCl + 30 mM CaCl₂来从细胞释放累积的FVIII。离心去除细胞，发色底物法(Coatest^? SP FVIII)测定FVIII。所检验的搅拌速率为185; 255和325 rpm，分别向培养物施加113, 210和610 W/m³的功率。搅拌速率不影响细胞特异性增长速率(图3)。但是，增加的搅拌速率增加了细胞特异性生产率(图4)。

实施例4

在15个不同批的100L生产规模的搅拌槽生物反应器中培养生产BDDrFVIII的HEK293F细胞，其中两个使用低能量耗散率(6 W/m³)作为对照，其余13个使用高能量耗散率(29 W/m³)以研究增加的剪切力的作用。细胞密度的平均值在两个低能量批次中为29.2 10⁶个细胞/ml，在13个高能量批次中为27.6 10⁶个细胞/ml。该生物反应器使用255 mm的斜叶片叶轮以实现搅拌。使用连续离心实现培养基更换。使用Cedex (Innovatis)细胞计数器测定活细胞密度、存活率和聚集速率。通过将细胞悬浮液中的离子强度增至0.3 M NaCl + 30 mM CaCl₂来从细胞释放累积的FVIII。离心去除细胞，发色底物法(Coatest^? SP FVIII)测定FVIII。所检验的搅拌速率为45和75 rpm，分别向培养物添加6和29 W/m³的能量。实验显示，通过增加搅拌速率增加向培养物的能量输入(能量耗散率，ε)，增加了生产率(表2)。总之，通过增加剪切力，也可以在大规模生产培养中以与小规模培养中所见的相同方式实现生产率的增加。

表2

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实施例5

在一个2L的搅拌槽生物反应器中以灌注模式培养生产BDDrFVIII的HEK293F细胞，该生物反应器使用90 mm、45°斜叶片叶轮以185 rpm恒速搅拌。该生物反应器的正常操作模式是使用连续离心以实现通过灌注方式的培养基更换。作为对比，使用中空纤维单元来实现灌注方式的培养基更换。该中空纤维单元以交替式切向流运行，这意味着细胞被泵入并泵出过滤膜，向细胞培养物连续地施加剪切力。其他细胞培养参数，例如搅拌速率、pH、溶解氧张力和温度在两个培养物中保持在相同的值。令人惊讶的是，如果通过增加向培养物的能量输入而增加剪切力(通过使用中空纤维膜而获得剪切力)，那么细胞特异性FVIII生产速率会显著增加(图5)。通过将细胞悬浮液中的离子强度增至1 M NaCl + 30 mM CaCl₂来从细胞释放累积的FVIII。离心去除细胞，发色底物法(Coatest^? SP FVIII)测定FVIII。