猪圆环病毒缺失突变体的构建及Cap蛋白的真核细胞重组表达

摘要

猪圆环病毒2(PCV2)不仅引发猪圆环病毒相关疾病，还能与多种病原协同感染。PCV2感染相关的疾病有猪繁殖与呼吸道疾病综合症(PRRSV)、皮炎与肾病综合症(PDNS)、小肠炎、肺炎、仔猪先天性震颤等(CT)，对养猪业造成了严重的经济损失。最近，PCV2感染猪群率不断上升，为了弄清病毒基因功能和特性，研制开发有效的基因工程疫苗或亚单位疫苗，本实验对PCV2的ORF2基因进行点缺失突变研究，并在杆状病毒表达系统中表达重组Cap蛋白。
　　 以PCV2-HZ0201毒株为模板，采用DpnⅠ定点突变技术缺失，构建一系列ORF2基因编码区的单核苷酸突变体转染PK-15细胞，拯救病毒，结果表明，1057位点缺失的病毒拯救成功，拯救病毒毒价为10-5.32/0.1 mL，几乎和HZ0201毒株相等。而1375-1381、1503及1525位点的单核苷酸缺失突变体不能拯救出病毒，这些结果表明以上位点的核苷酸是PCV2复制必须的，而1057位点的核苷酸是PCV2复制非必须的。
　　 通过PCR扩增PCV2的ORF2基因，插入转移载体pFastBac HTB，然后在Tn7转座子的作用下发生转座，通过蓝白斑筛选、质粒鉴定，构建出重组杆状病毒载体Bacmid-ORF2。重组质粒转染Sf9细胞，经IFA和Western blotting检测表明，Sf9细胞表达的Cap蛋白能与抗PCV2 Cap单克隆抗体发生特异性反应，表达产物的分子量约为30KD。电镜下观察显示，Sf9细胞表达的Cap蛋白可形成病毒样颗粒。这些数据表明，PCV2 Cap蛋白基因在Sf9细胞获得表达。

目录

声明

论文说明

摘要

第一部分 文献综述

第一章 猪圆环病毒2型的研究进展

1 病毒的分类

2 病毒的形态学和理化特性

3 PCV2的分子生物学特征

4 病毒的复制与转录

5 PCV2的进化和变异

6 PCV2相关疾病

第二章 昆虫杆状病毒表达系统的研究进展

1 杆状病毒的生物学特性

2 昆虫杆状病毒表达系统

3 影响蛋白表达的因素

4 多领域的应用

5 不足和展望

参考文献

第二部分 研究内容

第一章 PCV2/ORF2基因点缺失的构建及拯救分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二章 Bac-To-Bac杆状病毒表达系统表达PCV2/ORF2蛋白

1 材料

2 方法

3 结果

参考文献

全文总结

附录1 常用试剂及缓冲液配方

附录2 缩略词

附录3 攻读硕士期间科研成果

致谢