一种绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶突变体及其应用

摘要

本发明涉及一种麦芽糖α-淀粉酶突变体及其应用，所述麦芽糖α-淀粉酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。该突变体是通过对来自绿色糖单孢菌(Saccharomonospora viridis)的麦芽糖α-淀粉酶进行蛋白质工程的改造和筛选得到，这种突变体酶在水解淀粉中的应用，使其在水解淀粉产物中的麦芽糖含量得到提高，更有利于生产麦芽糖浆。它单独水解淀粉得到麦芽糖含量在72％以上的糖浆，并具有很好降低生产成本的潜力。

说明书

技术领域

本发明涉及酶工程和基因工程领域，具体是一种绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶的突变 体及其应用。

背景技术

麦芽糖浆是利用精制淀粉为原料，用酶制剂液化、糖化后，经精制、浓缩而成的一种淀 粉糖浆，其成分主要为麦芽二糖(≥50%)、葡萄糖、麦芽三糖、麦芽四糖及四糖以上等。麦 芽糖浆中麦芽糖含量的界限规定并不严格，通常饴糖中麦芽糖的含量为40～50%，有的还高 达60%，高麦芽糖浆中麦芽糖的含量为50～70%，超高麦芽糖浆中麦芽糖含量大于70%，目 前工业上生产糖浆产量较大，且比较普遍的是高麦芽糖浆。

在麦芽糖生产发展历史过程中主要经历的产品有三种：一是普通麦芽糖浆，麦芽糖含量 在40～50％之间；二是高麦芽糖浆，麦芽糖含量在50～70％之间；三是超高麦芽糖浆，麦 芽糖含量在70％以上。麦芽糖浆中葡萄糖很容易炭化变色影响到麦芽糖浆的品质和外观质 量，随着人们对麦芽糖的质量，特别是麦芽糖的含量的要求越来越高，以及现代酶工业的发 展和应用更使得超高麦芽糖浆成为目前主要的麦芽糖产品。国际上高质量的超高麦芽糖桨的 要求是麦芽糖含量高，葡萄含量要低，特别是用于特殊行业的麦芽糖浆，如用于医药产品和 麦芽糖醇的深加工对麦芽糖的含量和葡萄糖的含量的要求更高。

目前超高麦芽糖浆的生产工艺一般是先利用普通的α-淀粉酶将淀粉控制性不完全水解 生成一定DE值的糊精，再利用一种或两种脱支酶与α-淀粉酶共同作用减少寡糖的含量来获 得超高麦芽糖浆，其实质上就是利用多酶进一步水解来最大限度减少葡萄糖和和寡糖的生成 以最大限度提高麦芽糖的含量，但是在现实生产对设备的要求高，对生产工艺需要进行精确 的控制。在实际生产中需要对生产的反应条件进行紧密的控制，既要保证淀粉充分水解成极 限糊精又要避免过度水解生成过多的葡萄糖才能获得较高的麦芽糖产量，这种紧密的生产工 艺要求是制约麦芽糖生产质量和成本的关键技术，也是国内很多一般企业很难达到的。超纯 高麦芽糖生产的关键有几点：①控制液化液的DE值；②多种酶协同作用；③糖化后迅速灭 酶，目的是使得一次糖化麦芽糖含量达到80％，为后续生产结晶或注射麦芽糖奠定良好基础。 由于使用α-淀粉酶在产生麦芽糖的同时也会伴随较多的葡萄糖，影响到后续的工艺。目前最 常用的真菌α-淀粉酶使用单独使用只能生产40～50%的麦芽糖浆，而要生产80％以上超纯 麦芽糖浆以及生产结晶麦芽糖用糖浆，需要使用β-淀粉酶，并且以普鲁兰酶为辅助脱支以增 加β-淀粉酶的效率才能获得80％以上的麦芽糖。目前工业用β-淀粉酶主要从大麦中提取， 成本高、价格昂贵且活力较低，制约了麦芽糖行业的快速发展。因此目前麦芽糖生产中寻找 更简单的生产工艺，提高生产工艺的可控性，提高麦芽糖的含量，是降低麦芽糖生产成本的 关键。

关于用于生产麦芽糖的α-淀粉酶的相关专利和研究报道，美国两项专利U.S Patent 4604355和U.S Patent:6274355是关于麦芽糖淀粉酶（maltogenic amylase enzyme）的制备方 法和使用的专利，这种酶已经由诺维信公司商品化，这种酶转化淀粉的直接产物不是麦芽糖 而是麦芽三糖以上的高麦芽糖寡糖，比真菌α-淀粉酶容易控制而且生成的葡萄糖少，所以可 以进一步结合用其它脱支酶的共同作用就可以将淀粉转化成高麦芽糖糖浆。Petrícek M也报 道了从Thermomonospora curvata克隆到的一个新的芽糖α-淀粉酶基因，可以水解淀粉生成 50％以上的麦芽糖和少量的葡萄糖（Petrícek M,P,Kuncová M.Characterization of the  alpha-amylase-encoding gene from Thermomonospora curvata.Gene.1992,112(1):77-83）；Yang  CH也报道了从Thermobifida fusca克隆到一个新的芽糖α-淀粉酶基因，可以水解淀粉生成50 ％以上的麦芽糖和少量的葡萄糖，其同源性和前面Petrícek M报道的有98％的同源性（Yang  CH,Liu WH.Cloning and characterization of a maltotriose-producing alpha-amylase gene from  Thermobifida fusca.J Ind Microbiol Biotechnol.Epub,2007,34(4):325-330）；2002年Ammar YB 报道从Streptomyces sp菌属分离纯化到一种新型的麦芽糖α-淀粉酶（Maltose-forming α-Amylase），这种酶在转化淀粉时在4小时内就可以将淀粉转化成58％的麦芽糖，27.5％的 麦芽三糖，14.5％的麦芽四糖和五糖，而且不会产生葡萄糖（Ammar Y B,Matsubara T,Ito K, Iizuka M,Limpaseni T,Pongsawasdi P,Minamiura N.New action pattern of a maltose-forming  alpha-amylase from Streptomyces sp.and its possible application in bakery.J Biochem Mol Biol. 2002,35(6):568-575），它的水解淀粉的特性似乎是一种很有应用前景的麦芽糖α-淀粉酶，可 惜其没有相关基因克隆的报道。国内关于麦芽糖α-淀粉酶基因的报道只有訾楠等报道从地衣 芽孢杆菌克隆到生麦芽糖α-淀粉酶的基因，其水解淀粉的产物主要是麦芽糖和葡萄糖（訾楠， 沈微，石贵阳，王正祥.地衣芽孢杆菌生麦芽糖α-淀粉酶的基因克隆与鉴定.应用与环境生 物学报.2009，15(1):130～133）。本人也从嗜热链霉菌（Streptomyces thermoviolaceus）菌属 中克隆到一个麦芽糖α-淀粉酶基因，可以水解淀粉生成麦芽糖的含量达到50％的糖浆（中国 专利申请号：201010045645.9）。

越来越多的新酶应用到生产麦芽糖浆中，但是寻找能单独水解淀粉生成麦芽糖含量高的 麦芽糖浆的α-淀粉酶，使麦芽糖浆的生产工艺更简单、提高淀粉的利用率和生产成本更低是 本领域目前的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶突变体的基因及其应用。

本发明人在克隆鉴定了绿色糖单孢菌的一个α-淀粉酶的基础上，利用同源建模推测该淀 粉酶的底物结合位点的氨基酸残基，然后利用定点饱和突变技术对该位点进行饱和突变，再 进一步筛选获得一个高产麦芽糖的突变酶。本发明的绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶突变体， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。基因所编码的α-淀粉酶蛋白质，其氨基酸序列如序列表 SEQ ID NO.2所示，其中193位组氨酸被替换成谷氨酰胺，273位点的天冬氨酸被替换成谷 氨酸。

基因所编码的α-淀粉酶蛋白质在水解淀粉中的应用，单独水解淀粉得到的产物为麦芽糖 和麦芽三糖以及少量葡萄糖组成的糖浆，其中麦芽糖含量达到72.1％，比原始酶的59.5％提 高了约12％，该突变酶有利于提高麦芽糖浆的麦芽糖含量，在水解淀粉生产麦芽糖中发挥极 大的作用。

不同来源的α-淀粉酶即使存在一定的同源性，但其分子量大小不同，最适反应温度， 最适反应pH以及水解淀粉所得到产物组成等酶学特性上都会有很大差异，因而在用途上也 有所不同。本发明通过基因克隆，外源基因表达，表达产物的酶学研究等多种复杂的实验步 骤，证实这一基因编码是α-淀粉酶，并通过对该酶的底物结合位点的氨基酸残基进行推测， 然后进行定点饱和突变、筛选，获得对淀粉水解产物组成差异等特性的差异的突变子，其最 大的特点麦芽糖含量提高了。

本发明与现有技术相比，具有实质性特点和显著的优势：

1.与目前使用最多的商品化真菌α-淀粉酶相比，真菌α-淀粉水解淀粉的产物主要是麦 芽糖和一些低聚糖及少量的葡萄糖，真菌α-淀粉酶的最适作用温度为55℃左右，超过60℃ 开始失活，最适反应pH为4.8～5.4，真菌α-淀粉酶水解淀粉产物只能得到50％左右的麦芽 糖，而本发明的α-淀粉酶具有更高适于反应温度55～65℃，因而更适于工业化水解淀粉对酶 耐较高反应温度的要求，最适反应pH在5.5～7.5，更接近中性反应条件，在生产中不需要 添加酸来调节pH值，本发明的α-淀粉酶水解产物也更简单，主要产物麦芽糖和麦芽三糖及 少量的葡萄糖，没有低聚糖，水解淀粉产物中麦芽糖能达到72％左右，在水解淀粉制备麦芽 糖浆上具有一定优势，能提高淀粉的利用率。

2.和原始酶相比，酶学的热稳定性没有明显改变，但其水解淀粉的麦芽糖浆中麦芽糖的 含量提高了12％。

附图说明

图1是温度对酶水解淀粉活力的影响的曲线图。

图2是pH对酶水解淀粉活力的影响的曲线图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例

1.突变酶的构建

根据GenBank上绿色糖单孢菌基因组DNA序列中的一个假定为淀粉酶的ORF （GI:256583961）的氨基酸序列，通过同源建模分析推测V188、K192、H193、I2683和D27 位点的氨基酸残基为酶的底物结合位点，然后根据GI:256583961的DNA序列设计并合成共 100个突变酶基因的DNA序列。基因的DNA序列合成采用合成引物后应用PCR技术合成， 本实施方案中未作详细说明的分子生物学实验方法均为分子生物学专业人员熟悉的常规实 验方法。

2.突变酶基因的表达及粗酶制备

将合成的突变酶的DN序列经测序验证后，连接到表达载体pSEe380上构建突变酶基因 的表达质粒，然后把表达质粒导入大肠杆菌中进行诱导表达。将导入了表达质粒的大肠杆菌 在37℃摇床中培养，当OD600达到0.8左右时，加入IPTG使其终浓度达到1mmol/L在37℃ 继续培养20h进行诱导表达。诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利用破胞缓冲液洗涤 菌体一次，再利用破胞缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下利用超声波进行破胞，破胞至菌液澄 清，用1200r/min离心15分钟离心收集上清，所收集的上清液即为粗酶液，可用于下一步的 水解淀粉产物试验，筛选出麦芽糖含量高的突变子。对水解淀粉产物中麦芽糖含量高的位点 再进行多位点的组合突变，再进一步筛选得到水解淀粉麦芽糖含量为72％的突变酶。突变酶 的氨基酸序列中193位组氨酸（H）被替换成谷氨酰胺（Q），273位点的天冬氨酸（D）被替 换成谷氨酸（E），突变酶的DNA序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2，然后 再对该突变酶进行酶学性质的详细分析。

3.突变酶和原始酶水解淀粉最适的反应温度分析

取50μL的酶液与450μL pH为7.0的1%可溶性淀粉溶液混合，分别在30℃、35℃、40℃、 45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下反应10min后测定淀粉酶活力，结果表明酶的最适 温度为60℃，在50℃到65℃之间该酶有80%以上的活性，65℃以后酶活性急剧下降，结果 如图1所示，表明突变酶和原始酶没有明显的差异。

4.突变酶和原始酶水解淀粉最适的反应pH分析

分别用pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0的 缓冲液配制1％的可溶性淀粉溶液，然后分别450μL加入50μL的酶液，在65℃的条件下反 应10min后测定淀粉酶活力，结果表明酶的最适反应pH为pH6.5，在pH5.5到pH8.0之间 该酶有80%以上的活性，pH8以后酶活性急剧下降，结果如图2所示，结果表明表明突变酶 和原始酶没有明显的差异。

5.突变酶水解淀粉产物成分的比较分析

以市场售卖的商品真菌α-淀粉酶和原始酶为对照，比较分析突变酶水解淀粉产物的组成

在1mL含有2w/v％可溶性淀粉底物的pH7.0磷酸钠缓冲液中加入相同蛋白含量的酶， 50℃水浴反应，反应不同时间取样，把所取的样在沸水中煮沸10分钟终止其反应，12000 rpm/min离心30分钟，取上清稀释10倍后用HPLC检测野生型及突变型淀粉酶反应产物， 其水解淀粉的产物百分比见表1，结果表明突变酶水解淀粉得到的麦芽糖糖浆中麦芽糖含量 比野生酶提高了12％，也高于目前常用的商品真菌α-淀粉酶。

表1.突变酶和原始酶及真菌α-淀粉酶水解淀粉不同时间的产物组成

同样以市场售卖的商品真菌α-淀粉酶和原始酶为对照，比较分析突变酶在添加普鲁兰酶 共同水解淀粉产物的组成，在1mL含有20w/v％可溶性淀粉底物的pH7.0磷酸钠缓冲液中加 入过量的酶，并添加普鲁兰酶反应24小时，然后在沸水中煮沸10分钟终止其反应，12000 rpm/min离心30分钟，取上清稀释100倍后用HPLC检测野生型及突变型淀粉酶反应产物， 其水解淀粉的产物百分比见表2。结果表明在过量酶的条件下，突变酶水解20％的淀粉能获 得麦芽糖含量为75％的麦芽糖糖浆，添加普鲁兰酶后麦芽糖含量提高到78％，还原糖得率 从78提高到93％，这有利于提高淀粉的利用率。同时也说明说明突变酶在不添加普鲁兰酶 和添加普鲁兰酶的两种条件下，麦芽糖的产量度高于野生酶和商品真菌α-淀粉酶，这说明了 突变酶在生产超高麦芽糖浆上具有很好的潜力。

表2突变酶和原始酶及真菌α-淀粉酶加普鲁兰酶水解淀粉不同时间的产物组成