胸腺肽制剂用于制备逆转肿瘤相关基因突变的试剂中的应用

摘要

本发明公开了胸腺肽制剂用于制备逆转肿瘤相关基因突变的试剂中的应用，拓宽了胸腺肽制剂的应用范围，肿瘤患者干预胸腺肽制剂后能够使肿瘤相关基因突变逆转，降低肿瘤相关基因的突变量，增生或息肉缩小，延长肿瘤患者的生存周期，为肿瘤的靶向治疗提供新的思路，具有重要的临床意义。

说明书

技术领域

本发明属于化学领域，特别涉及胸腺肽制剂用于制备逆转肿瘤相关基因突变的试剂中的 应用。

背景技术

癌症是基因突变累积的结果。换句话说，所有癌症的发生，都源自脱氧核糖核酸（DNA） 序列的异常。国际癌症基因组联合计划参与单位之一、英国剑桥大学桑格研究所首席科学家 斯特拉顿教授指出，癌变的形成要经过8-10年甚至更长，而这漫长的时间其实就是一个多基 因突变并累积的过程。肿瘤相关基因可分为原癌基因和抑癌基因，其中起主要作用的突变属 于驱动型突变（driver mutation）。当抑癌基因突变失去抑制癌症作用，或原癌基因突变激活， 就会诱发癌症。在正常细胞在向癌细胞转化的过程中，发生多种不同原癌基因和抑癌基因突 变。相比临床检测中常规使用的肿瘤蛋白血清标志物，突变无疑是更特异的肿瘤标记。2009 年12月，桑格研究所在《自然》杂志上刊文宣布，他们率先在世界上破译肺癌、皮肤癌和乳 腺癌等5种肿瘤全部基因密码，绘制出相应的肿瘤基因突变图谱。

以往的一些研究表明在肿瘤组织、外周血（血浆/血清）、肿瘤累及器官相关的体液（如 唾液、痰等）中均可以发现肿瘤相关的突变DNA癌变细胞可以释放DNA到外周血或者体液 中，因而可以检测到肿瘤相关基因的突变。

肺癌相关基因有EGFR、KRAS等，检测EGFR、KRAS基因突变可发现肺癌超早期信号、 了解肺癌的发展预后，评估放化疗效果等；乳腺癌相关突变基因BRCA1、BRCA2、RAD51C 等；肠癌相关突变基因APC、KRAS、PTEN、TP53、BRAF等。EGFR外显子19为肺癌常 见突变，文献报道突变比例为30-40%；APC基因外显子15为肠癌常见突变位点，文献报道 突变比例为70-80%；BRCA2为乳腺癌常见突变位点，文献报道突变比例40-50%。另外，分 子靶向药物是根据肿瘤细胞与正常细胞分子生物学特征差异而研发的，如易瑞沙（Iressa）、 阿瓦斯汀（Avastin）等，为阻断肿瘤细胞信号转导途径的新型抗癌药物，但它们仅对部分有 特殊基因突变或肿瘤标志物表达的患者有较好的疗效。

到目前为止人类还没有攻破肿瘤治疗的难关，虽然化疗药物和放疗对肿瘤细胞的杀伤作 用是肯定的，但是其对正常细胞的破坏作用也是不容忽视的。随着科学研究的发展和进步， 免疫调节剂也得到了很好的开发和应用。在肿瘤的治疗过程中，使用免疫调节剂可以增强机 体的免疫能力，保护化疗和放疗过程中受损的骨髓细胞和免疫细胞。胸腺肽制剂是一种在肿 瘤临床治疗中应用广泛的免疫调节剂，其主要作用是促进T细胞分化、成熟，能诱导前T细 胞转化为T细胞，并进一步分化为Th、Ts、Tc等T细胞亚群；能增强成熟T细胞对抗原或 其他刺激的反应，如增强PHA或ConA诱导的淋巴细胞增殖反应，促进白介素-2生成，增强 免疫排异和移植物抗宿主反应，提高NK细胞的活性，并能增强血清中超氧化物歧化酶的活 性。动物实验表明，它能使去胸腺小鼠部分或接近全部地恢复，能使萎缩的淋巴组织复生， 淋巴细胞增殖，是幼淋巴细胞成熟，变为有免疫功能的淋巴细胞。胸腺肽制剂在肿瘤治疗中 的应用主要有胸腺肽、胸腺肽α1、胸腺五肽三类。

胸腺肽是一种从新生小牛胸腺组织中提取的多肽类制剂，主要化学成分为TF5，具有调 节和增强人体细胞免疫功能的作用，能促使T淋巴细胞成熟。邓琴等报道66例肺癌患者， 随机分组分析血常规及免疫功能，结果胸腺肽组各项指标均比治疗前有显著改善。成瑞玲报 道胃癌根治术后患者62例分两组观察，胸腺肽治疗结果有显著差异。黄凌等回顾性探讨63 例小剂量使用胸腺肽对老年肿瘤患者化疗毒副作用和生活质量的影响，也得到了肯定的疗效。 综上所述，胸腺肽具有促进体内细胞因子分泌及淋巴细胞功能的作用，能增强机体的免疫功 能，在肿瘤治疗中起着重要的辅助作用。

胸腺肽α1能够刺激外周血淋巴细胞丝裂原，从而促进T淋巴细胞的成熟，增加抗原或 丝裂原激活后T细胞分泌的干扰素α、干扰素γ以及白介素-2、白介素-3等淋巴因子水平， 同时增加T细胞表面淋巴因子受体水平。它还可通过对CD4细胞的激活，增强异体和自体的 混合淋巴细胞反应。扬帆等对80例术后NSCLC患者随机分组，观察NSCLC术后患者化疗 联合胸腺肽α1的近期反应，结果各项免疫指标及白细胞计数显著提高。李艳丽通过回顾原发 性肝癌37例随机分组观察，发现胸腺肽α1可明显改善免疫功能。徐然等通过对14例经胸腺 肽α1治疗的胰腺癌患者免疫指标进行检测，并与同期未使用胸腺肽α1治疗的患者进行比较， 也得到同样的结果。多篇报道显示胸腺肽α1是一种生物反应调节因子，它可以促使T细胞 及自然杀伤细胞（NK）的分化与成熟，对肿瘤患者免疫功能的改变作用肯定。

胸腺五肽为免疫双向调节剂，具有诱导和促进T淋巴细胞及其亚群分化、成熟和活化的 功能，调节T淋巴细胞的比例，使CD4/CD8趋于正常；调节和增强人体细胞免疫功能的作 用，能促使有丝分裂原激活后外周血中的T淋巴细胞成熟，增加T细胞在各种抗原或致有丝 分裂原激活后各种淋巴因子的分泌，增加T细胞上淋巴因子受体水平；它同时通过对T辅助 细胞的激活作用来增强淋巴细胞反应，同时还可增强NK细胞毒性。林芳将NSCLC患者200 例随机分组进行对照研究，评价胸腺五肽在NSCLC中的作用，发现胸腺五肽治疗组患者免 疫指标和白细胞计数明显提高。胸腺五肽（TP-5）是胸腺生成素Ⅱ的有效成分，由精氨酸、 赖氨酸、天门冬氨酸、缬氨酸、酪氨酸5种氨基酸组成，与胸腺肽有着相同的生理功能和药 效，其特点是药物纯度高、含量稳定（为激活T-淋巴细胞的最佳剂量）、安全可靠，且不含 有大分子蛋白质，其有效成分为动物胸腺提取物84-102倍，TP-5具有使血液中超氧化物歧 化酶（SOD）含量升高，朝氧负离子自由基含量显著下降的功能。

上述研究表明胸腺肽制剂作为一种免疫调节剂，在肿瘤治疗中的作用是肯定的，但胸腺 肽制剂逆转肿瘤超早期突变、改善肿瘤术后预后差的患者生存、肿瘤治疗效果、肿瘤复发监 控方面的作用未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供胸腺肽制剂用于制备逆转肿瘤相关基因突变的试剂中 的应用。

为实现上述发明目的，提供如下技术方案：

胸腺肽制剂用于制备逆转肿瘤相关基因突变的试剂中的应用。

优选的，所述突变为早期突变、疗效指示突变、预后指示突变或复发监控突变。

优选的，所述肿瘤相关基因为原癌基因或抑癌基因。

更优选的，所述原癌基因为EGFR，KRAS，C-KIT或PIK3CA。

更优选的，所述抑癌基因为P53、APC、BRCA1、BRCA2、PTEN或NOEY2。

最优选的，所述胸腺肽制剂为胸腺肽、胸腺肽α1或胸腺五肽。

本发明的有益效果在于：本发明公开了胸腺肽制剂在制备逆转肿瘤相关基因突变的试剂 中的应用，将患者用胸腺肽制剂干预后能够逆转肿瘤相关基因早期突变，降低疗效指示突变 基因的突变量，预后指示突变的突变量和复发监控相关基因的突变量，并对肿瘤患者具有疗 效，减轻患者症状，延长患者的生存周期，为临床治疗肿瘤提供了新的靶向药物。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为007号样本胸腺肽干预前后EGFR基因外显子19缺失突变检测图。

图2为033号样本胸腺肽干预前后APC基因外显子15点突变检测图。

图3为085号样本胸腺肽干预前后BRCA2基因外显子11缺失突变检测图。

图4为093号样本胸腺肽干预前后EGFR基因外显子21突变检测图。

图5为149号样本胸腺肽干预前后KRAS基因外显子2突变检测图。

图6为165号样本胸腺肽干预前后KRAS基因外显子3突变检测图。

图7为207号样本胸腺肽干预前后C-KIT外显子9突变检测图。

图8为243号样本胸腺肽干预前后BRCA15382位点突变检测图。

图9为297号样本胸腺肽干预前后PTEN外显子6突变位点检测图。

图10为350号样本胸腺肽干预前后PIK3CA外显子9突变位点检测图。

图11为411号样本胸腺肽干预前后NOEY26141位点检测图。

图12为600号样本胸腺肽干预前后EGFR外显子19突变检测图。

图13为633号样本胸腺肽干预前后BRCA2外显子11突变检测图。

图14为749号样本胸腺肽干预前后EGFR外显子21突变检测图。

图15为801号样本胸腺肽干预前后KRAS外显子2突变检测图。

图16为936号样本胸腺肽干预前后KRAS外显子3突变检测图。

图17为胸腺肽干预前后β-tubulin突变检测图。

图18为胸腺肽干预前后GAPDH突变检测图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的 实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1胸腺肽制剂在逆转肿瘤超早期突变方面的应用

入组无临床症状人员1000名，其中男性500名，女性500名，分别抽取5mL静脉血， 用肝素抗凝血，提取血浆游离DNA，DNA提取使用QIAGEN公司试剂盒，货号为51183， 提取方法按试剂盒说明书操作。

检测提取DNA中原癌基因和抑癌基因的突变情况，检测的原癌基因有EGFR，KRAS， C-KIT和PIK3CA，检测的抑癌基因有P53、APC、BRCA1、BRCA2、PTEN和NOEY2，同 时以非癌相关基因β-tubulin和GAPDH为对照，检测位点和检测引物如表1所示：

表1.检测原癌基因和抑癌基因突变的引物序列

检测体系如表2所示：

表2.检测体系

反应体系组成 加入体积(μL) 10×PCR Buffer(含MgCl₂)(Roche) 2.0

MgCl₂(Roche) 0.4 dNTP(Roche) 0.5 Eva-green（Roche） 1.0 10μmol primers(英潍捷基上海合成) 1.0 Template（血浆提取DNA或阳控） 1.0 Taq酶(Roche,HS TAQ) 0.2 H₂O 13.9

检测条件为如表3所示，检测在Roche480仪上进行。

表3.检测条件

然后以血浆DNA为模板，表1中提供的序列为引物，按表2中的反应体系和表3中的 反应条件对1000份样本检测，并分别以经检测EGFR、KRAS、C-KIT、PIK3CA、P53、APC、 BRCA1、BRCA2、PTEN、NOEY2、β-tubulin和GAPDH未突变的基因组DNA为对照模板。 检测结果显示，1000份样本中有16份样本检测出基因突变，其中男性10名，女性6名，具 体如表4所示。

表4.1000份样本检测结果

样本编号 突变位点 后续临床检测 医生诊断 007 EGFR外显子19 PET-CT 肺腺癌 033 APC基因外显子15 PET-CT 腺瘤性结肠息肉 085 BRCA2外显子11 钼靶 囊性增生 093 EGFR外显子21 PET-CT 肺腺癌 149 KRAS外显子2 PET-CT 腺瘤性结肠息肉 165 KRAS外显子3 PET-CT 腺瘤性结肠息肉 207 C-KIT外显子9 胃镜 胃重度不典型增生

243 BRCA15382位点 钼靶 乳腺结节 297 PTEN外显子6 PET-CT 腺瘤性结肠息肉 350 PIK3CA外显子9 胃镜 胃腺癌 411 NOEY26141位点 胃镜 胃腺癌 600 EGFR外显子19 PET-CT 肺腺癌 633 BRCA2外显子11 钼靶 囊性增生 749 EGFR外显子21 PET-CT 肺腺癌 801 KRAS外显子2 PET-CT 肺腺癌 936 KRAS外显子3 PET-CT 腺瘤性结肠息肉

由表4可以看出，编号007的样本，EGFR外显子19缺失突变（图1a）；编号033的样 本APC基因外显子15点突变（图2a）；编号085的样本BRCA2外显子11缺失突变（图3a）； 编号093号的样本EGFR基因外显子21发生L858R突变（图4a）；编号149号的样本KRAS 基因外显子2发生G12R突变（图5a）；编号165号的样本KRAS基因外显子3发生O61H 突变（图6a）；编号207号的样本C-KIT外显子9Ala502-Tyr503区段的6碱基重复突变（图 7a）；编号243号的样本BRCA1基因5382位点插入C（图8a）；编号297号的样本PTEN基 因外显子6发生突变（编码子179-180缺失4bp）（图9a）；编号350号的样本PIK3CA基因 外显子9E542K由GAA突变为AAA（图10a）；编号411号的样本NOEY2基因6141G>A （图11a）；编号600号的样本EGFR外显子19A755D突变，由丙氨酸突变为天冬氨酸（图 12a）；编号633号的样本BRCA2基因外显子11的6174位缺失（图13a）；编号749号的样 本EGFR基因外显子21第2576位由T突变为G（图14a）；编号801号的样本KRAS基因 外显子2发生突变（G12V（GGT→GTT））（图15a）；编号936号的样本KRAS基因外显子 3发生突变（O61L（CAA---CTA））（图16a）。同时检测非癌相关基因β-tubulin和GAPDH， 结果显示非癌相关基因β-tubulin和GAPDH为未发生突变（图17a和图18a）。

得到上述检测结果后，对检测突变的样本进一步作临床检测，检测方法和检测结果如表 4所示。对007号样本检测显示，在肺部上叶尖端有小结节4mm，进一步穿刺活检后经病理 验证为肺腺癌，肌肉注射胸腺五肽（海南中和药业有限公司，国药准字H10970237）每次1mg， 每周一次，3个月为一个疗程，持续3个疗程结束后检测EGFR外显子19，结果显示EGFR 外显子19突变消失（图1b）；033号样本PET-CT检测发现有黄豆大小息肉，穿刺活检后病 理诊断为腺瘤性结肠息肉，然后用胸腺五肽进行干预，干预方法同007号样本，半年后复检 APC基因外显子15，结果显示APC基因外显子15突变消失；085号样本钼靶检测后穿刺活 检，病理诊断为囊性增生，然后用胸腺五肽进行干预，干预方法同007号样本，半年后复检 BRCA2外显子11，结果显示BRCA2外显子11突变消失（图3b），同时增生消失；093号样 本PET-CT检测有网状阴影，进一步穿刺活检后经病理验证为肺腺癌，然后用胸腺五肽进行 干预，干预方法同007号样本，半年后复检EGFR外显子21，结果显示EGFR外显子21突 变消失（图4b）；149号样本PET-CT检测有直径1cm阴影，进一步穿刺活检后经病理验证为 腺瘤性结肠息肉，然后用胸腺五肽进行干预，干预方法同007号样本，半年后复检KRAS外 显子2，结果显示KRAS外显子2突变消失（图5b）；165号样本临床诊断为腺瘤性结肠息 肉，然后用胸腺五肽进行干预，干预方法同007号样本，半年后复检KRAS外显子3，结果 显示KRAS外显子3突变消失（图6b）；207号样本临床诊断为胃重度不典型增生，用胸腺 五肽进行干预，干预方法同007号样本，半年后复检C-KIT外显子9，结果显示C-KIT外显 子9突变消失（图7b）；243号样本临床诊断为乳腺结节，用胸腺五肽进行干预，干预方法同 007号样本，半年后复检BRCA15382位，结果显示BRCA15382位突变消失（图8b）；297 号样本临床诊断为腺瘤性结肠息肉，用胸腺五肽进行干预，干预方法同007号样本，半年后 复检PTEN外显子6，结果显示PTEN外显子6突变消失（图9b）；350号样本临床诊断为 胃腺癌，用胸腺五肽进行干预，干预方法同007号样本，半年后复检PIK3CA外显子9，结 果显示PIK3CA外显子9突变消失（图10b）；411号样本临床诊断为胃腺癌，用胸腺五肽进 行干预，干预方法同007号样本，半年后复检NOEY2基因第6141位，结果显示NOEY2基 因第6141位突变消失（图11b）；600号样本临床诊断为肺腺癌，用胸腺五肽进行干预，干预 方法同007号样本，半年后复检EGFR外显子19，结果显示EGFR外显子19突变消失（图 12b）；633号样本临床诊断为囊性增生，用胸腺五肽进行干预，干预方法同007号样本，半 年后复检BRCA2外显子11，结果显示BRCA2外显子11突变消失（图13b）；749号样本临 床诊断为肺腺癌，用胸腺五肽进行干预，干预方法同007号样本，半年后复检EGFR外显子 21，结果显示EGFR外显子21突变消失（图14b）；801号样本临床诊断为肺腺癌，用胸腺 五肽进行干预，干预方法同007号样本，半年后复检KRAS外显子2，结果显示KRAS外 显子2突变消失（图15b）；936号样本临床诊断为腺瘤性结肠息肉，用胸腺五肽进行干预， 干预方法同007号样本，半年后复检KRAS外显子3，结果显示KRAS外显子3突变消失 （图16b）。上述样本胸腺五肽干扰后检测非癌相关基因β-tubulin和GAPDH，结果显示非癌 相关基因β-tubulin和GAPDH为未发生突变（图17b和图18b）。

从上述检测结果可以得到，在癌前病变阶段给予免疫调节剂胸腺肽，可有效逆转肿瘤相 关基因突变，甚至能逆转早期的组织学病变，但对非癌相关基因无影响。

实施例2胸腺肽制剂在逆转肿瘤疗效指示相关突变方面的应用

入组肿瘤患者10例，随机分组，两两配对，其中肺癌4例，肠癌4例，乳腺癌2例。入 组患者手术后切下的肿瘤组织，提取组织DNA，提取方法按试剂盒说明书进行，DNA提取 试剂盒购自QIAGEN公司，货号为51304。然后以提取的DNA为模板，利用表1中的引物、 表5中的反应体系和下述反应条件筛选到10例患者特异的突变位点，并检测其突变丰度（方 法引自公开号为CN103397102A的中国专利）。

反应条件如下：

第一阶段：酶激活阶段，温度设置为95℃进行5min；

第二阶段：PCR扩增阶段，温度设置为95℃进行10s，温度设置为60℃进行15s，温度 设置为72℃进行25s，并循环50次；

第三阶段：熔解过程，温度设置为95℃进行1min，温度设置为40℃进行1min，温度设 置为65℃进行1s，温度设置为95℃每秒检测荧光40次；

第四阶段：冷却过程，温度设置为40℃进行10s。

表5.反应体系

其筛选结果如表6所示：

表6.10例患者突变筛选结果、治疗方案及治疗效果

筛选后对10例患者进行治疗，治疗方案如表6所示，用法和用量：胸腺五肽为肌肉注射 （海南中和药业有限公司，国药准字H10970237）每次1mg，每周一次，3个月为一个疗程， 持续3个疗程。易瑞沙（阿斯利康），空腹或与食物同服，250mg（1片），1日1次，3个月 为一个疗程持续3个疗程。特罗凯（罗氏制药），150mg/日，至少在进食前1小时或进食后2 小时口服，3个月为一个疗程持续3个疗程。爱必妥（德国默克雪兰诺公司），滴注，起始剂 量为400mg/m²，滴注时间120分钟，滴速应控制在5mL/min以内。维持剂量为一周250mg/m²， 滴注时间不少于60分钟，每周一次，3个月为一个疗程，持续3个疗程。5-氟尿嘧啶（安柯 瑞），500～600mg，每周1次，3个月为一个疗程，持续3个疗程。赫赛汀（罗氏制药），静 脉输入，初次负荷量为4mg/kg，90分钟内静脉输入，每周用量为2mg/kg，每周一次，3个 月为一个疗程，持续3个疗程；安慰剂为生理盐水。治疗后再检测相应基因突变的丰度，并 统计突变量的变化情况，结果如表6所示。由表6可知，1号患者EGFR外显子21点突变 下降50%，而与之对照的5号患者EGFR外显子21点突变仅下降20%；3号患者EGFR外 显子19缺失突变下降60%，而与之对照的7号患者EGFR外显子19缺失下降30%；2号患 者TP53外显子5点突变下降45%，而与之对照的10号患者TP53外显子5点突变仅下降18%； 4号患者PTEN外显子6缺失突变下降53%，而与之对照的6号患者PTEN外显子6突变下 降50%；8号患者BRCA2外显子11缺失突变下降80%，而与之对照的9号患者BRCA2外 显子11缺失突变仅下降50%。并且对实验患者走访5年，结果显示，胸腺肽干预后的患者 生存期较未进行胸腺肽干预的患者。

上述结果表明，胸腺肽干预可逆转肿瘤疗效指示相关癌变基因的突变，通过逆转相关突 变位点对疗效有一定的指示作用。

实施例3胸腺肽制剂在逆转肿瘤预后指示相关突变方面的应用

入组TNM分期，M期乳腺癌患者6名，均有不同程度的淋巴结转移，均有BRCA2、 NOEY2突变及HER2基因扩增。随机分成2组，每组3人。一组序贯治疗的同时注射生理盐 水（安慰剂），另一组序贯治疗的同时注射胸腺五肽（购自海南中和药业有限公司，国药准字 H10970237），每次1mg，每周一次，3个月为一个疗程，持续3个疗程，疗程结束后，跟踪 随访1年。并在治疗前和治疗后分别抽取患者2mL全血肝素抗凝，提取血浆游离DNA，DNA 提取按说明书进行，试剂盒购自QIAGEN公司，货号为51183，然后表1中的引物、表5中 的反应体系和实施例2中的反应条件检测血浆中BRCA2和NOEY2突变量变化情况。结果显 示，注射胸腺五肽的干预组突变量平均下降38%，而对照组突变量平均下降5%，干预组生 存率100%，而对照组生存率33.3%。结果表明，胸腺肽能够逆转转移癌细胞相关癌变基因的 突变率，并提高患者生存率。

实施例4胸腺肽制剂在逆转肿瘤复发监控相关突变方面的应用

入组达到治疗终点后1年无任何临床症状、影像学检测亦无异常的胃癌患者60名，手术 后提取石蜡组织DNA，DNA提取按说明书进行，试剂盒购自QIAGEN公司，货号为51183。 然后利用公开号为CN103397102A的中国专利筛选出含TP53突变患者2名，PIK3CA突变 患者2名，CDH1突变患者2名，然后取患者全血肝素抗凝，表1中的引物、表2中的反应 体系和实施例3中的检测条件检测各患者相应基因突变量。检测后将同种突变类型中一位患 者注射胸腺五肽（购自海南中和药业有限公司，国药准字H10970237），每次1mg，每周一 次，3个月为一个疗程，另一位患者注射等量的生理盐水作为安慰剂。于3个月后，利用相 同的方法检测各个患者对应突变基因的突变含量变化情况。结果发现，试验组突变量下降均 高于对照组。且TP53突变患者的对照组患者经影像学证实已复发。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和 细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。