一种具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌微生物制剂

摘要

本发明涉及一种具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌，其保藏编号为CCTCC M 2013240。本发明还提供这种短小芽孢杆菌的应用以及以这种短小芽孢杆菌或其发酵液为活性成分的微生物制剂。本发明优点在于：本发明以紫色杆菌为筛选模型，利用“T”型划线法和滤纸片法筛选出一株能够抑制紫色杆菌紫色色素产生的菌株F3-1，试验结果表明菌株F3-1能够抑制紫色杆菌的QS信号分子，具有抑制细菌群体感应的作用，可用于制备防治水产细菌性病害的微生物制剂，为进一步从干扰细菌群体感应系统的角度研究防治水产细菌性病害的新方法奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地说，是一种具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌微生物制剂。

背景技术

细菌性疾病一直是困扰水产养殖业发展的重要原因之一。近年来，高密度集约化的生产模式在促进水产业提高产量的同时，也使得细菌疾病发生的机会增大、频率增加、危害加大；此外，抗生素使用导致的耐药性、药物残留以及对生态环境的破坏也成为社会关注的焦点。因此，寻找抗生素的替代药物、探索新的防治方式已经成为水产病害防治研究重要方向之一。群体感应( Quorum sensing，简称QS)是指细菌能自发产生并释放一些特定的信号分子，感知自身浓度的变化，进而调控相关基因的表达。目前，调节细菌群体感应的信号分子主要有三种，（a）N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)，是广泛存在于革兰氏阴性细菌中的群体感应的信号分子；（b）自体诱导肽( Autoinducing peptides， AIP)，AIP是一类短肽分子，是革兰氏阳性细菌中常见的信号分子；（c）自体诱导物Ⅱ类分子(Auto inducingⅡ， AI2)，是以费氏弧菌(Vibrio fischeri)为代表的由luxS酶催化的AI 2系统的信号分子。研究表明，在革兰氏阴性细菌中，如铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等，其生物被膜形成、有害毒素产生、致病因子释放等行为均受到AHLs类信号分子的调节。Dong（2000）等人在蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）中发现了aiiA基因，能够合成AHLs信号分子降解酶，阻断QS信号分子在细菌间的传递；尹守亮等（2009）从胶州湾海域筛选出一株能够降解AHLs信号分子的真菌，表明海洋微生物也可以作为QS抑制剂的潜在研究对象；Bhavanath等（2013）发现紫杉状海门冬（Asparagopsis taxiformis）的粗提物能够降解AHLs信号分子，并且对铜绿假单胞菌生物膜有一定的抑制作用。Defoirdt等（2011）首次从南美白对虾和海水鲈鱼等水产动物的肠道中分离出了能够抑制哈氏弧菌(Vibrio harveyi)QS信号分子传递的芽孢杆菌，Natrah等（2011）分离出一株能够抑制AHLs信号分子的微藻，该微藻能够阻断哈氏弧菌QS系统，降低其致病力。这些研究为探讨从群体感应角度防控水产细菌性疾病提供了理论依据和科学数据的支撑。芽孢杆菌(Bcaillus sp)具有易生产、便运输、耐储藏等特点，在水产养殖上可以起到净化水质、防治疾病和促进生长等作用，是常用的益生微生物菌株。因此，筛选能够抑制AHLs信号分子的芽孢杆菌，并应用于水产养殖业上，必将有着广阔的前景。

紫色杆菌（Chromobacteria violaceum）是一种革兰氏阴性菌，其色素的表达受群体感应AHLs信号分子严格调控，一旦信号分子被抑制，紫色便会褪去。因此，紫色杆菌常用作群体信号分子降解物质筛选的指示菌株。但是关于一种具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌微生物制剂目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌。

本发明的第二个目的是，提供一种具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌的应用。

本发明的第三个目的是，提供一种具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌微生物制剂。

本发明的第四个目的是，提供一种具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌微生物制剂。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌，所述的具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC M 2013240。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌在防治水产细菌性病害中的应用。

所述的具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌用于制备防治水产细菌性病害的微生物制剂。

所述的具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌抑制细菌群体感应。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌微生物制剂，所述的微生物制剂以所述的具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌为活性成分。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：一种具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌微生物制剂，所述的微生物制剂以权利要求1所述的具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌的发酵液为活性成分。

本发明优点在于：

本发明以紫色杆菌为筛选模型，利用“T”型划线法和滤纸片法筛选出一株能够抑制紫色杆菌紫色色素产生的菌株F3-1，试验结果表明菌株F3-1能够抑制紫色杆菌的QS信号分子，具有抑制细菌群体感应的作用，可用于制备防治水产细菌性病害的微生物制剂，为进一步从干扰细菌群体感应系统的角度研究防治水产细菌性病害的新方法奠定了基础。

附图说明

图 1. “T ”型划线培养；注： 1(X93)；2(F3-1)；3(X77)；4(F6-5)，5(X 3914)；6(F6-4)；7(F3-2)。

图2. 滤纸片扩散法；注： 1(F3-1)； 2(X77)； 3(X3914)； 4(F6-4)； 5(F6-5)； 6(F3-2)； 7(x93)。

图3. 菌株F3-1蛋白粗提液对紫色色素产生的抑制；注：1（蛋白酶K）；2（青霉素）；3（蒸馏水）；4（粗提蛋白）。

图4. 菌株F3-1粗提物对紫色色素的抑制作用。

图5. 不同浓度的菌株F3-1粗提物对紫色色素作用的OD₅₈₅值。

图6. 菌株F3-1的16S rDNA电泳图。

图7. F3-1 16Sr DNA序列的系统发育树。

图8. 菌株F3-1扫描电镜图片 4000倍。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例

1. 材料与方法

1.1材料

1.1.1 菌种与活化

紫色杆菌( Chromobacteriμm violaceum)购买自美国ATCC；芽孢杆菌菌株X77、X93、X3914为本实验室保存。

将冻干粉保藏的紫色杆菌转接于5ml的LB液体培养基中，26℃培养24h；再取1mL菌液转移到5mL LB液体培养基中26℃培养24h;用接种环占取菌液在LB平板中划线分离，挑取单个紫色菌落在LB斜面上划线保存以备用。

1.1.2 培养基与试剂

营养琼脂培养基（购买自上海鼎国），LB培养基（购买于上海生工）；细菌基因组抽提试剂盒（购买于上海生工）；PCR试剂：Master Mix 2x，通用引物1492r、27f，(上海美吉生物技术公司)，D2000 marker（购买于北京天根）。

1.1.3 主要仪器设备

超净工作台（SW-CJ-IF型，苏州净化设备有限公司）；高压灭菌（YXQ-LS-18SI，上海博讯实业有限公司）；生化培养箱（SPX-100B-Z型，上海博讯实业有限公司）；离心机（TDL80-2B型，上海安亭科学仪器有限公司）；电泳仪（DYY-6C型，北京市六一仪器厂），电泳槽（DYCP-32B，北京市六一仪器厂）；凝胶成像仪（GEL DOC XR型，Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 芽孢杆菌分离纯化

参照Olsson等的方法（详见：Olsson C，Westerdahl A，Conway P L．Intestinal colonization potential of turbot (Scophthalmus maximus L.)and dab (limanda) associated bacteria with inhibition effects against Vibrio anguillarum [J]．Appl. Environ. Micro，1992，58(2)：551-556．）。鲫鱼首先用75%的酒精进行体表消毒；解剖，取出肠道，75%酒精棉球擦拭肠管外壁，无菌生理盐水冲洗。称重后按1∶10 ( w/v) 的比例加入灭菌生理盐水混合，用灭菌匀浆器充分研磨均匀，研磨的样品设为10^-1，再用灭菌生理盐水对10^-1样品进行梯度稀释至10^-6，各稀释度样品均置于漩涡混合仪上振荡均匀并置于水浴锅中，80℃水浴10 min，分别取各稀释度菌液0.1mL涂布于营养琼脂培养基平板，28℃培养24~48h。挑出单菌落，分离纯化，经革兰氏染色挑选革兰氏阳性菌。

1.2.2 筛选群体感应抑制活性芽孢杆菌

1.2.2.1“T”型划线法

参照Chu等方法（详见：Chu W，Lu F，Zhu W and Kang C. Isolation and characterization of new potential probiotic bacteria based on quorum-sensing system. J Appl Microbiol [J].2011，110 (1): 202-208.）用无菌棉签挑取少量紫色杆菌（Chromobacteria violaceum）菌液在LB平板上连续涂抹，旋转90度后继续用无菌棉签占取一定量的待测芽孢杆菌菌液在平板上涂抹，两菌株划线垂直成“T”型。若靠近芽孢杆菌附近的紫色杆菌的紫色褪去，则表明待测菌株具有抑制AHLs信号分子的作用。

1.2.2.2 滤纸片法

参照单文荣等方法（详见：单文荣，李俊霞，刘花粉. 滤纸片法筛选不同活性物对棉花黄萎病菌抑制效果研究.中国农学通报， 2010，26(19): 285? 289.）将待测菌株置于营养肉汤液体培养基28℃培养24h后，测定菌液浓度为4.2×10⁸cfu/mL，取15mL 10 000r/min离心15min，并取上清液通过0.22μm滤膜，保留滤液；取0.1mL培养24h的紫色杆菌（Chromobacteria violaceum）菌液（菌液浓度为3.1×10⁸ cfu/mL），涂布LB平板上；吸取10 uL待测菌株滤液滴到滤纸片上，吹干后反扣在涂有紫色杆菌菌液的平板上，将培养皿于26 ℃恒温培养箱中倒置培养48h，每个样品做3组平行。如果滤纸片周围出现不透明的白色浑浊圈，则表明筛选样品中含有QS抑制物。

1.3 芽孢杆菌菌株F3-1的粗提物对紫色菌素产量的影响

1.3.1芽孢杆菌菌株F3-1的粗提物的制备

将分离纯化好的芽孢杆菌分别接种到含有15mL发酵培养基的50mL螺口管中，28 ℃、120r/min振荡培养6~10h。将菌体及上清发酵液超声破碎，加入15mL 乙酸乙酯萃取，充分振荡后，静置萃取过夜，8 000 r/min 离心，取上层有机相，用旋转蒸发仪40℃浓缩至干，干燥物用甲醇溶解至100g/L。

1.3.2紫色杆菌紫（Chromobacteria violaceum）紫色菌素的提取

将过夜培养的紫色杆菌用新鲜的LB培养基稀释到OD600≈0.05，分别分装到5组试管中，每管2mL，每组3个平行，每组分别加入终浓度0、50、100、200、300 mg/L 的粗提物，30℃、120 r/min振荡培养24h。然后提取紫色菌素。

紫色菌素提取方法：吸取1mL上述培养好的菌液于1.5mL离心管中，12 000 r/min 离心10 min，使紫色菌素和菌体充分沉淀。弃上清液，加1mL二甲基亚砜 (DMSO) 于1.5mL离心管中，涡旋，充分振荡使紫色菌素溶解于DMSO中。12 000 r/min再次离心10 min ，沉淀菌体及碎屑，测定上清585nm处的光吸收值。

1.4 硫酸铵沉淀法分离蛋白

参考宋福平的方法（详见：宋福平，刘邮洲. 枯草芽孢杆菌 Bs-916 的抑菌活性及其抑菌物质初探. 农药学学报 2007，9(1): 92-95.），过夜培养的芽孢杆菌菌液50mL，离心机4℃，10 000r/min离心15min，取上清液，然后分别通过0.22μm滤膜，然后向其中加入固体硫酸铵至80%饱和度，用磁力搅拌器搅匀，静置过夜(4℃)后，10 000r/min离心20min，弃上清液，收集沉淀，沉淀分别用5mL(PH值7.4)的PBS溶解后，置于分子量8000至10 000道尔顿的透析袋4℃过夜透析，产物即为分离蛋白的粗提产物。

1.5 粗提蛋白QS抑制效果试验

吸取10μL粗提蛋白溶液滴到滤纸片上，置于涂有紫色杆菌（Chromobacteria violaceum）菌液的平板上，将培养皿置于26℃恒温培养箱中倒置培养48h，每个样品做3组平行，并做蒸馏水、青霉素（0.1 mg/L）蛋白酶K（20 mg/mL）抑制试验。如果滤纸片周围将出现不透明的白色浑浊圈，则表明筛选样品中含有AHLs信号分子抑制因子。 

1.6 菌种鉴定

1.6.1 16Sr DNA 鉴定

16Sr DNA扩增用通用引物，正向引物为27f，反向引物为1492r。引物的序列为：27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′（SEQ ID NO.1）；1492r：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′（SEQ ID NO.2）。50μL的PCR反应体系：Master Mix 25μL，引物27f 1μL，引物1492r 1μL，模板DNA 1μL，ddH₂O 22μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1.5min，30个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物用1.7%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用DNA Marker（D2000，购买自上海生工）作为参照。

1.6.2序列分析与系统发育进化树的构建

所测序列在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）的BLAST程序在线比对测序结果。根据比对的结果，从数据库选取与所分析的细菌基因序列同源性较高的已知相关序列，利用软件Clustalx和Mega4.0进行多重比较后通过最大简约法构建系统发育树。

1.6.3电镜样品制备

挑取单菌落置于营养肉汤液体培养基中过夜24h，取1mL于1.5ml离心管中，8，000r/min离心1min，使菌体贴壁，然后用超纯水润洗两次后，4℃下置于2.5%的戊二醛中过夜固定后，用5%、25%、50%、80%、95%酒精脱水，每次间隔15至20min、干燥，喷金后用扫描电镜观察。

2 结果与分析

2.1筛选结果

从鲫鱼肠道中分离出10株在80℃水浴中仍能存活的细菌，结果见表1。其中菌株F3-1、F3-2、F6-4、F6-5革兰氏染色为阳性，其余六株细菌染色为阴性。

表1 鲫鱼肠道芽孢杆菌分离结果

    2.2 群体感应抑制筛选结果

2.2.1“ T”型划线结果

利用“T”型划线法对七株芽孢杆菌的筛选结果如图1所示，中间紫色为紫色杆菌（Chromobacteriμm violaceum），两边与紫色杆菌的成T型靠近的为待测菌株，其中只有2号与紫色杆菌接近的地方有明显的褪色现象。

2.2.2 滤纸片法结果

利用滤纸片扩散法，对7株待测芽孢杆菌的胞外产物进行试验，结果如图2，其中紫色是涂布的紫色杆菌（Chromobacteriμm violaceum）。7株待测菌中只有1号菌株F3-1周围有明显的褪色圈。

2.3 菌株F3-1粗提蛋白对群体感应抑制效果

菌株F3-1蛋白粗提液试验结果如图3所示，青霉素（2）周围形成明显的透明的抑菌圈，抑制了紫色杆菌的正常生长，周围没有任何菌落。粗提的蛋白液（4）周围则是明显的褪色圈，紫色杆菌生长正常。蛋白酶K（1）和蒸馏水（3）周围紫色杆菌的生长有变化。 

2.4 菌株F3-1粗提物对紫色菌素产量的影响

从图4和图5可以看出菌株F3-1粗提物对于紫色杆菌产紫色色素的影响，在终浓度0~300 mg/L范围内对紫色菌素的生成产生明显的抑制作用，当粗提物浓度为0时，菌液成明显的紫色，随着浓度的提高OD₅₈₅的光密度值颜色逐渐减低，当浓度提高到50mg/L时，菌液紫色减弱，OD₅₈₅显著低于空白(P<0.05)。200mg/L和300mg/L时紫色杆菌几乎不产生任何紫色菌素，菌液呈乳白色，彼此差异不显著（P>0.05）。

2.5 菌株鉴定结果

2.5.1 16Sr DNA 鉴定结果

1.7％琼脂糖凝胶电泳分析表明：16S r DNA的PCR扩增产物约为1.5 kb，将所测16S r DNA序列与Gen Bank中已发表的16S rDNA序列进行同源比对，结果显示具有QS抑制活性的菌株F3-1与短小芽孢杆菌(Baillus pumilus )有较高的同源性，同源性99％。16S rDNA序列如SEQ ID NO.3所示。该芽孢杆菌的分类命名：短小芽孢杆菌(Baillus pumilus)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉大学生命科学院保藏中心，保藏日期2012年6月2日，保藏编号为CCTCC M 2013240。

2.5.2电镜图片

见图8。

3.讨论

自1945年，磺胺类药在美国成功的用于治疗鳟鱼疥疮病，之后各种抗菌药物相继在水产养殖中使用，抗生素成为防治细菌性鱼病的重要手段。据报道，2002-2009年我国水产养殖细菌性病害达57.63％，其控制手段仍然以药物防治为主，药物滥用现象严重。其结果直接导致水产动物的病原菌耐药性越来越强，而且多重耐药现象日渐增多；同时，抗菌药物随之进入周围环境水体，由此引发的环境细菌耐药性明显增加，并可能危害人类健康。因此，探索新的防治细菌性疾病的手段势在必行。大多数的革兰氏阴性菌致病菌都存在以AHLs为主要信号分子的群体感应系统，许多致病因子的产生都受到其直接或间接的调控。而针对细菌QS系统的研究发现，QS信号分子抑制剂的作用靶点与传统的抗生素类药物的完全不同，只抑制细菌QS调控的致病行为，不影响细菌的生长，从而避免了耐药突变株的出现。所以，通过抑制细菌的QS系统，降低致病微生物的致病能力，可以作为研究新的防治细菌病途径的切入点。

本发明以紫色杆菌（Chromobacteria violaceum）为筛选模型，利用“T”型划线法和滤纸片法筛选出一株能够抑制紫色杆菌紫色色素产生的菌株F3-1，试验结果表明菌株F3-1能够抑制紫色杆菌（Chromobacteria violaceum）的QS信号分子。其胞外蛋白粗提液抑制紫色色素产生的试验表明，抑制其色素产生的物质是一种胞外蛋白。目前，大量的研究表明，芽孢杆菌中含有抑制细菌群体感应的降解酶，如Dong等人的研究表明（2000年）年发现蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）能够分泌抑制AHLs信号分子的胞外酶，Lee等在2002发现在不同来源苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）中发现了具有降解AHLs信号分子能力菌株，丁贤等在2010年从海水中筛选出一株能够抑制AHLs信号分子的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），本发明研究的结果也进一步证实了短小芽孢杆菌中也同样含有抑制AHLs信号分子的蛋白物质，与前人的研究结果相符。经分子生物学鉴定为短小芽孢杆菌。这也是首次发现短小芽孢杆菌具有抑制细菌群体感应的作用，丰富芽孢杆菌对群体感应抑制研究的资料。

需要说明的是，本发明的具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌可以用于制备防治水产细菌性病害的微生物制剂，所述的微生物制剂以这种短小芽孢杆菌或其发酵液为活性成分。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>  上海海洋大学

<120>  一种具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌微生物制剂

<130>  /

<160>  3    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

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<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

tacggctacc ttgttacgac tt                                              22

<210>  3

<211>  1464

<212>  DNA

<213>  短小芽孢杆菌(Baillus pumilus)

<400>  3

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