酵母CUP1基因在动物饲养领域的用途

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及酵母

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及酵母CUP1基因在动物饲养领域的用途，并进一步提供相关CUP1基因的表达载体及其制备方法。

背景技术

规模化、集约化的养猪产业对生态环境的污染越来越严重，而在猪排泄中的铜是重要的因素之一。铜作为一种高效、廉价、方便的促生长添加剂在养猪业中被广泛应用。畜禽的日粮中铜的添加量大大超出其适宜需要量时，被吸收利用的铜很少，绝大多数铜会随粪便排出体外。土壤中高浓度的铜对微生物产生毒害作用，使得微生物的种类和数量大大降低，土壤出现了结板盐碱化，对土壤的呼吸有很大的抑制作用。高铜会造成动物中毒，在动物的内脏和肌肉中的残留量增加，铜可以通过食物链进行富集，对整个生态链的安全带来潜在的危害，甚至会危及到人类的健康。

课题组已经通过文献挖掘和生物信息学方法确定了酵母CUP1作为我们研究的基因。通过生物信息学的预测，发现酵母CUP1与哺乳动物的MT基因是同源基因，基因的序列及表达的蛋白氨基酸上相差很远，只是含有相同的结合金属离子的保守氨基酸序列，所以该基因的转入不会对转基因动物自身的代谢造成影响。而随着转基因技术的发展，培育有效利用饲料中的添加铜、减少铜排放的转基因猪成为可能，这可以从根本上缓解养猪业对环境的污染问题。而酵母CUP1基因编码的蛋白属于金属硫蛋白，酵母对铜的鳌合是由CUP1蛋白来控制的。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供酵母CUP1基因（登录号：NM_001179185或NM_001179183）在哺乳动物饲养领域的用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供酵母CUP1基因在动物饲养领域的用途。

所述动物饲养领域具体指促进动物对于饲料中铜的吸收率，促进动物的体重增加，并减少动物的铜排放，由此降低铜排放对土壤、水体等生态环境的污染。

所述动物优选为哺乳动物。

本发明第二方面提供一种酵母CUP1基因的构建体，所述表达载体由酵母CUP1基因的编码序列插入到表达载体的多克隆位点构建而成。

所述构建体能够表达酵母CUP1基因。

优选的，所述的表达载体为真核的表达载体pEGFP-N1。

本发明第三方面提供所述酵母CUP1基因的构建体所表述的CUP1基因在制备转基因动物领域的用途。

所述动物优选为哺乳动物。

本发明第四方面提供一种酵母CUP1基因的表达系统，由所述酵母CUP1基因的构建体转染到宿主细胞构建而成。

本发明发明人对酵母中的CUP1基因进行载体的构建，在建立的转CUP1基因的小鼠模型中，发明人发现转CUP1基因促进了小鼠的体重增加，并在促进了小鼠对饲料中铜的吸收率的同时，也减少了铜的排放，减少了铜排放对土壤、水体等生态环境的污染。以培育环境友好型动物新品种的角度为出发点，为转基因猪的制备奠定基础，以期从转基因全新的角度降低在畜牧养殖业中的微量元素铜的排放，从根本上解决了养猪业中的环境污染问题。

附图说明

图1.酵母CUP1基因PCR扩增的结果，其中1、2：CUP1基因；M：DNA分子量Marker,DL2000。

图2.重组质粒pEGFP-CUP1的菌液鉴定，M：DNA分子量Marker,DL2000；1-10：PCR扩增重组质粒pEGFP-CUP1的菌液；11：用水做模板进行扩增的结果（空白对照）。

图3.重组质粒pEGFP-CUP1的酶切及PCR验证，M：DNA分子量Marker,DL2000；1：质粒酶切图，2：没有酶切的质粒；3：PCR扩增质粒。

图4.流式细胞仪分选的阳性克隆细胞，图为在蓝色光的激发下的绿色荧光，a:携带空载体的细胞（对照组细胞），b：携带CUP1基因的细胞（实验组细胞）。

图5.阳性克隆细胞CUP1的PCR扩增，M：DNA分子量Marker,DL2000；1：空白对照，2：阴性对照，3：以实验组细胞的DNA为模板进行的扩增。

图6.阳性克隆细胞CUP1的PCR扩增，M：DNA分子量Marker,DL2000；1：空白对照，2：阴性对照，3：以实验组细胞的cDNA为模板进行的扩增。

图7.CUP1真核表达产物的Western blot验证，HeLa:为空白对照，control:对照组细胞的Western blot结果，test:实验组细胞的Western blot结果。

图8.对照组及实验组细胞经铜（100μM）孵育不同的时间（6,24,48,96h）后，酵母CUP1（yeast CUP1）及细胞本底MT基因（human MT）mRNA表达量的检测。

图9.对照组及实验组细胞经不同浓度的铜（200,400,600,800,1000μM）孵育不同时间（6，24，48，72，96h）后，用MTT法检测细胞的增殖速率的结果。Control：对照组细胞，Test实验组细胞。

图10.对照组及实验组细胞经铜（100μM）诱导不同的时间（4,8,16,24h）后，细胞周期的G1期、S期随时间变化的检测。Control：对照组细胞，Test实验组细胞。

图11.重组质粒pPSP-CUP1的菌液鉴定，M：DNA分子量Marker,DL2000；1-10：PCR扩增重组质粒pPSP-CUP1的菌液；11：空白对照。CUP1：鉴定CUP1在菌液中表达，neo：鉴定neo基因在菌液中的表达。

图12.重组质粒pPSP-CUP1的PCR鉴定，M：DNA分子量Marker,DL2000；1：空质粒的凝胶电泳，2：CUP1特异扩增的结果，3，neo特异扩增的结果。

图13.重组质粒pPSP-CUP1双酶切（Xho I和Not I）的结果，M：DNA分子量Marker,DL10000；1：没有酶切的空质粒，2-7：质粒经双酶切的结果。

图14.重组质粒pPSP-CUP1酶切（Bgl II）的结果，M：DNA分子量Marker,DL10000；1：质粒经酶切的结果。

图15.Southern blot探针特异性的PCR检测，M：DNA分子量Marker,DL2000；1-2：扩增的特异探针。

图16.Southern blot中DNA的凝胶电泳检测，M：DNA分子量Marker,DL10000；1-6：DNA的凝胶电泳结果。

图17.DNA酶切（Bgl II）后的凝胶电泳检测，M：DNA分子量Marker,DL10000；1-7：DNA酶切后的凝胶电泳结果。

图18.转CUP1基因小鼠的Southern blot的结果，1：以质粒pPSP-CUP1杂交的阳性对照，2：阴性对照；3-4：阳性小鼠杂交的结果，3为两个拷贝，4为一个拷贝。

图19.CUP1基因在转基因小鼠不同组织中的表达检测，1-9分别为心、肝、脾、胃、肾、肠、脑、腮腺、颌下腺；10：阳性对照；11：空白对照。

图20.CUP1基因在野生型小鼠不同组织中的表达检测，1-9分别为心、肝、脾、胃、肾、肠、脑、腮腺、颌下腺；10：阳性对照；11：空白对照。

图21.CUP1基因在转基因小鼠腮腺及颌下腺中表达的Western blot检测，PG1-4：转基因阳性小鼠的腮腺组织；SG1-4：转基因阳性小鼠的颌下腺组织。

图22.小鼠第一周和前两周的体重增加的检测，control为对照组小鼠的体重增加；test为转基因的阳性小鼠体重的增加。

图23.小鼠第一周和第二周粪便中铜含量的检测，control为对照组小鼠的粪便中铜的含量；test为转基因的阳性小鼠的粪便中铜的含量。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

本发明实施例中所用生物材料来源如下：

pMD18-T vector、DH5α感受态细胞、Xho I等限制性内切酶均购自Takara公司。

真核表达载体pEGFP-N1购自广州英伟创津公司。

实验所用的FVB和ICR品种的小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

实施例1

1.载体的构建：

含有酵母CUP1序列由Invitrogen合成，并克隆到pMD18-T上，合成的序列如下：

TTGGCGCGCCATGTTTCAACTTTGGAAACTTGTTTTCTTGTGCGGTCTGCTCATTGGGACCTCAGCGTCTTTCAGCGAATTAATTAACTTCCAAAATGAAGGTCATGAGTGCCAATGCCAATGTGGTAGCTGCAAAAATAATGAACAATGCCAAAAATCATGTAGCTGCCCAACGGGGTGTAACAGCGACGACAAATGCCCCTGCGGTAACAAGTCTGAAGAAACCAAGAAGTCATGCTGCTCTGGGAAATGAGGCGCGCCGA（Seq ID No.1；Asc I,划线部分；大小263bp）设计含有HindⅢ和SacⅡ粘性末端序列的引物P1，序列如下：

CUP-CF1:5’CCCAAGCTTATGTTCAGCGAATTAATTAACTTCC3’

（Seq ID No.2；HindⅢ,划线部分）

CUP-CR1:5’TCCCCGCGGTTTCCCAGAGCAGCATGACTTCTTG3’

（Seq ID No.3；SacⅡ,划线部分）

用引物P1扩增的PCR产物（见图1）纯化后，连接到pMD18-T的载体上（酶切位点HindⅢ和SacⅡ）。再经转化（DH5α感受态细胞）、菌落的筛选、PCR的鉴定后，经酶切和测序的鉴定等获得阳性的克隆菌液，再抽质粒。经HindⅢ和SacⅡ双酶切后回收纯化。把携带空载体pEGFP-N1和基因CUP1的纯化产物用T4DNase进行连接。按照上面的步骤获得阳性克隆的菌液，经阳性克隆菌液的鉴定（见图2），再进行菌液的扩大培养，经无内毒素抽提后，获得高质量的转染质粒。质粒经双酶切（HindⅢ和SacⅡ）、测序及PCR的验证（见图3），在相应的位置出现正确的条带，测序及PCR验证正确，证明构建的表达载体是正确的。

2.阳性细胞系的筛选及CUP1表达的验证

阳性细胞的筛选采用分级分选的方法，首先用300μg/mL G418进行初步的筛选，获得一定纯度的阳性克隆细胞，再基于细胞所携带的绿色荧光蛋白用MoFlo XDP流式细胞仪（Beckman Coulter公司，美国）的分选系统对细胞进行分选，获得纯的阳性克隆细胞系（见图4，a：携带空载体的细胞（对照组细胞），b：携带CUP1基因的细胞（实验组细胞））。

酵母CUP1表达的验证：抽提HeLa细胞（空白对照）、对照组细胞及实验组细胞的DNA和RNA，并将RNA反转录成cDNA。分别以DNA及cDNA作为模板，用P2引物在60℃时进行扩增。P2引物为：

F:5′TAACTTCCAAAATGAAGGTCATGAG3′（Seq ID No.4），

R:5′TTCCCAGAGCAGCATGACTT3′（Seq ID No.5）。

在实验组细胞中，以DNA及cDNA做模板都能扩增出单一的条带，而在空白对照、对照组的细胞中都没有扩增出条带（见图5、6）。对空白对照、对照组及实验组细胞进行蛋白的抽提，以小鼠的β-actin蛋白作为内参，通过CUP1特异性的抗体（Santa Cruz Biotechnology，美国）检测CUP1在细胞中的表达情况。Western blot结果表明，在实验组细胞中有CUP1的表达，而在空白对照、对照组的细胞中都没有检测到CUP1的表达（见图7）。综上结果表明，CUP1在实验组细胞中在mRNA、蛋白水平上成功表达。

3.细胞铜吸收的ICP-MS检测

把对照组和实验组细胞以2×10⁵个/瓶接种T25细胞培养瓶中，培养24h后，用含有终浓度为10μmol/L和100μmol/L的His-Cu细胞培养液分别对对两种细胞进行孵育培养48h。每个实验做3个重复，孵育培养完后立即去除细胞培养液，并用PBS洗去残留的培养液。再做检测前的预处理，定容到5mL，用ICP-MS进行细胞中铜含量的检测。结果表明（见表1），实验组细胞铜的吸收显著的高于对照组细胞铜的吸收，铜浓度提高的情况下，这种差异增大。铜浓度为100umol/L的时候，细胞的铜吸收实验组是对照组的2倍以上。

表1.对照组及实验组细胞在含铜为10μM和100μM的细胞培养液中孵育48h进行铜含量检测的结果，Control为对照组细胞铜的含量，Test为实验组细胞铜的含量

4.CUP1在细胞中的表达

把实验组细胞以2×10⁵个/瓶接种到T25细胞培养瓶中，培养24h后，把实验组细胞用100μmol/L的His-Cu的培养液分别孵育0，6，24，48，96h，然后对CUP1及细胞的本底基因MT用实时荧光定量PCR进行其表达量的检测。结果表明（见图8），CUP1的表达量在0-96h几乎没有发生改变，而MT基因的表达随着时间表达量在增大，在第48h时达到最大。因而，CUP1的表达量相对于MT的倍数由21倍降到7倍，前者的表达量总是显著的高于MT的表达量。

5.细胞的增殖速率的检测

把对照组及实验组细胞以1×10⁴个/孔接种到96孔细胞培养板中，培养24h后，用含200，400，600，800，1000μmol/L的His-Cu培养液分别对两种细胞进行孵育。分别培养6,24,48,72,96h后，进行后期的处理，使用酶标仪进行检测，检测使用的波长为490nm。检测结果发现（见图9），在铜浓度为200，400，600μmol/L时，实验组细胞的增殖速率显著的高于对照组的细胞（P<0.05）；而在铜浓度为800，1000μmol/L时，实验组细胞的增殖速率极显著的高于对照组的细胞（P<0.01）。

6.细胞周期的检测

细胞先进行饥饿处理96h，使细胞处于G0期。再用含100umo/L的His-Cu的细胞培养液对细胞进行诱导培养4，8，16，24h，进行预处理后，用流式细胞仪对细胞的周期进行检测。结果表明（见图10），实验组细胞处于G1期的细胞数量比例要小于比对照组的细胞，而处于S期的细胞比例要大于对照组。而缩短的G1期与延长的S期与细胞的增殖速率成正相关。

实施例2转CUP1基因小鼠的制备

1.F0代小鼠的制备及F1小鼠的繁殖

将CUP1的编码序列插入到转基因载体的多克隆位点构建转基因表达的载体，进行转基因小鼠的显微注射（上海南方模式生物研究中心参与完成）。在小鼠的制备中，共注射了424枚受精卵，存活的数量为289枚，移植到9只代孕鼠中，出生的F0代小鼠数量为29只。获得F0代的CUP1阳性小鼠为8只，其中2只死亡。存活的阳性小鼠4只为雄性，2只为雌性。

F0代小鼠与野生型的小鼠进行交配，获得F1代小鼠共77只，经过特异性的鉴定后，得到阳性小鼠的数量为50只。

2.转基因小鼠的Southern blot鉴定

F1代转基因的阳性小鼠进行Southern blot的进一步验证，确定目的基因CUP1已经整合到了小鼠的基因组中。根据载体的序列及插入CUP1序列的位置，筛选了进行Southern blot的限制性内切酶，首先对质粒进行酶切的验证（BglⅡ），观察酶切的结果与软件分析的结果是否完全相同，酶切的结果与分析一致（见图14）。同时设计了进行Southern blot的探针引物，其序列为：

F:5′TGGGGAATCAGTAGGAAGTCTTGGC3′（Seq ID No.6），

R:5′CCCCAGAATAGAATGACACCTACTC3′（Seq ID No.7），

退火的温度为60℃，探针的片段大小为832bp。

后进行引物特异性扩增的检测，探针的扩增条带单一、清晰，说明探针的特异性好（见图15）。根据Southern blot实验对DNA的要求，用DNA大提的试剂盒对鼠尾进行了DNA的抽提，获得含量高、质量高的DNA（见图16）。用选定的限制性内切酶（BglⅡ）对DNA进行酶切，进行凝胶电泳的检测（图17），然后进行杂交的实验，证实CUP1的序列确实已经整合到了小鼠的基因组中，而且存在不同的拷贝（见图18）。

3.检测CUP1在转基因小鼠组织中的表达

分别采取转基因阳性和野生型小鼠的心、肝、脾、胃、肾、肠、脑、腮腺、颌下腺共10个组织，用试剂盒提取各个组织的RNA，进行RNA的凝胶电泳、浓度等的检测后，进行反转录成cDNA。再进行特异引物的PCR检测，其引物序列为：

F:5′TGCTCATTGGGACCTCAG3′（Seq ID No.8），

R:5′TTTCTTCAGACTTGTTACCG3′（Seq ID No.9），

退火的温度为60℃，扩增片段的大小为177bp。

结果表明（见图19-20），在转基因的阳性小鼠中，在腮腺、颌下腺中特异表达，而在其它的组织中没有表达。在野生型的小鼠中，在所有的组织中都没有观察到酵母CUP1基因的表达。

4.CUP1在转基因小鼠组织中表达的Western blot检测

分别采取小鼠的腮腺及颌下腺组织进行Western blot，结果表明（见图21），CUP1蛋白在转基因的阳性小鼠中的腮腺及颌下腺组织中均有表达。一抗为CUP1（y-61），购自Santa CruzBiotechnology，美国；二抗为β-actin，购自Sigma，美国。

5.转基因小鼠的体重变化的检测及粪便中铜含量的量化分析

按照在正常饲养笼中垫纱布的方式进行小鼠体重的变化及小鼠粪便中铜含量的量化分析。体重及身体状况的观察：从F1代小鼠一出生开始就进行体重的称量及身体状况的观察。每周对小鼠进行体重的称量及进行身体状况的观察，并做好记录。一旦小鼠的身体状况出现了不正常，如不进食、拉肚子等要及时做相应的处理。小鼠断奶后，即4周龄即开始小鼠的饲喂实验，饲喂配制的特定饲料（饲料由上海斯莱克生物科技有限公司配制，饲料中为低铜，铜的含量为10ppm）。一周后，即第5周（即饲喂配制饲料一周后）开始进行小鼠粪便采集的实验。每个笼子中放置一只小鼠，采集的数据为每天每只小鼠的粪便，粪便采集的时间为2周。

根据实验的要求，选取出生的体重比较接近的小鼠进行体重的变化及小鼠粪便中铜含量的量化分析实验。在77只小鼠中选取了44只小鼠作为实验的对象，其中阳性小鼠的数量为28只，阴性小鼠的数量为16只。对小鼠的体重变化分析结果表明（见图22），第1周小鼠体重的增加，阳性小鼠显著的高于阴性小鼠（P=0.025＜0.05）；前二周的体重增加，阳性小鼠显著的高于阴性小鼠（P=0.036＜0.05）。

将每只小鼠第1周的和第2周的全部粪便分别作为一个样本，进行系列的处理后再进行粪便中铜含量的检测，结果表明（见图23），阳性小鼠和阴性小鼠第1周粪便中铜含量的差异显著（P=0.0022＜0.05）；第二周粪便中铜含量的差异显著（P=0.0003＜0.05）。阳性小鼠第1周粪便中铜的含量减少了18.41％，第2周粪便中铜的含量减少了21.61％。

总之，酵母CUP1基因在HeLa细胞中的高表达提高了细胞的增殖速率，增加了细胞对铜的吸收，为酵母CUP1基因转基因动物的制备提供了依据。而在我们建立的转CUP1基因的小鼠模型中，转CUP1基因促进了小鼠的体重增加，更加重要的是，促进了小鼠对饲料中铜的吸收率，既节省了铜资源，也减少了铜的排放及对土壤、水体等生态环境的污染。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。