9-甲基反式链霉戊二酰亚胺及其制备方法

摘要

本发明公开了一种制备9-甲基反式链霉戊二酰亚胺的方法，包括以下步骤：Ⅰ培养：采用补料分批培养方式培养具有产生戊二酰亚胺类抗生素的链霉菌属的微生物，获得发酵液；Ⅱ分离：将发酵液过滤心，然后以石油醚和丙酮的混合物为洗脱液层析滤液，得到9-甲基反式链霉戊二酰亚胺粗品；Ⅲ精制：将9-甲基反式链霉戊二酰亚胺粗品通过工业反向色谱柱，以甲醇溶液展开，得到洗脱液，洗脱液通过HPLC法检测提纯，得到9-甲基反式链霉戊二酰亚胺精品。本发明的方法采用两步层析法，可使发酵液中的S632A

说明书

技术领域

本发明涉及通过培养具有产生戊二酰亚胺类抗生素的链霉菌属 的微生物提纯制备9-甲基反式链霉戊二酰亚胺的方法以及由此方法 得到的9-甲基反式链霉戊二酰亚胺。

背景技术

现在已知微生物产物可产生具有广泛结构特征和具有抗炎等药 理活性的多种物质。戊二酰亚胺类抗生素（S632A）是由链霉菌产生 的一类具有多种生物学活性的酰亚胺类化合物，现已报道分离到的大 约20多种该类抗生素中，结构差别主要在戊二酰亚胺六元环连接的 侧链不同，侧链的另一端多以环状结构结束。9-甲基反式链霉戊二酰 亚胺（S632A₃）是由链霉菌S632（Streptomyces hygroscopicus S632） 产生的一种具有多种生物学活性的戊二酰亚胺类化合物。研究表明， 抗生素S632A₃具有抗真菌、抗病毒、抗肿瘤以及抗炎等多种药理活 性。

通常采用对链霉菌S632的发酵液分离提纯的方法获得S632A₃， S632发酵液中的S632A是具有S632A₂（9-甲基反霉戊二酰亚胺）和 S632A₃两中同分异构体的混合体，现有的分离纯化方法一般为一次 层析法很难将S632A₂和S632A₃完全分开，获得的主要组分为 S632A₂，致使S632A₃的收率很低。因此有必要提供一种具有较高收 率的制备S632A₃的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种工艺周期短、收率高的制备9-甲基反式 链霉戊二酰亚胺的方法以及由此方法得到的9-甲基反式链霉戊二酰 亚胺。

根据本发明的一个方面，提供了一种制备9-甲基反式链霉戊二酰 亚胺的方法，该方法包括以下步骤：Ⅰ培养：采用补料分批培养方式 培养具有产生戊二酰亚胺类抗生素的链霉菌属的微生物，获得发酵 液；Ⅱ分离：将发酵液过滤，然后以石油醚和丙酮的混合物为洗脱液 层析滤液，得到9-甲基反式链霉戊二酰亚胺粗品；Ⅲ精制：将9-甲 基反式链霉戊二酰亚胺粗品利用工业反向色谱柱，以甲醇溶液展开， 得到洗脱液，洗脱液通过HPLC法（High Performance Liquid  Chromatography高效液相色谱法）检测提纯，得到9-甲基反式链霉 戊二酰亚胺精品。由此，步骤Ⅲ中采用工业反相色谱柱、HPLC法检 测提纯，两次层析提纯可使发酵液中的S632A₂和S632A₃完全分开， 提高了S632A₃的收率，步骤Ⅰ中采用补料分批培养方式培养微生物， 可使发酵液中的产物浓度较高，并可提高培养基中营养物质的利用 率，且补料分批培养方式操作工艺简单。

在一些实施方式中，在步骤Ⅰ中，补料分批培养的培养基的pH 值为6.8，培养温度为30～℃，培养时间为4～6天，在培养的第3天 向培养基中添加补料培养基。由此，培养基pH值为6.8、培养温度 为30℃便于微生物大量产生代谢物，在培养的第3天补料有益于维 持微生物产生代谢物，并可提高培养基的利用率。

在一些实施方式中，补料培养基包括以重量百分比计的甘油 6.0%、葡萄糖5%、蛋白胨5%，余量为水。由此，补料培养基可补 充原培养基中消耗量大的营养物质，并可促进微生物代谢。

在一些实施方式中，在步骤Ⅰ中，补料分批培养的培养基包括以 重量百分比计的甘油3.0%，葡萄糖0.8%，土豆淀粉0.2%，黄豆饼粉 2.0%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，CaCO₃0.2%，余量为水。由此，培养 基中的营养成分便于微生物大量繁殖，其中NaCl可维持培养基渗透 压，CaCO₃可调节培养基pH。

在一些实施方式中，在步骤Ⅰ中，在补料分批培养前还包括种子 培养，种子培养基包括以重量百分比计的甘油4.0%，葡萄糖1%，土 豆淀粉0.5%，黄豆饼粉2.0%，干酵母0.5%，NaCl0.5%，余量为水， 种子培养基的pH值为6.8。由此，种子培养可使微生物由适应期进 入对数期，便于在补料分批培养时快速繁殖。

在一些实施方式中，在步骤Ⅱ中，滤液层析前还包括下述步骤： 采用溶媒提取法、大孔树脂吸附法或层析法将滤液提纯。由此，滤液 层析前的提纯可提高层析的效率。

在一些实施方式中，在步骤Ⅲ中，HPLC条件为：液相流速为 4ml/min、液相温度为18～22℃、检测波长为560nm。由此，高效液 相色谱法中利用检测波可对S632A₃进行有效的分析，液相流速为 4ml/min可提高提纯的效率。

在一些实施方式中，在步骤Ⅲ中，工业反向色谱柱的固相为粒度 50μm的十八烷基硅烷键合硅胶，甲醇溶液为35%（体积百分比）甲 醇溶液。由此，工业反相色谱柱可对9-甲基反式链霉戊二酰亚胺粗品 进一步提纯。

相应地，本发明还提供了一种根据上述方法得到的9-甲基反式链 霉戊二酰亚胺，其化学结构式为：

本发明的有益效果为：本发明的制备S632A₃的方法采用两步层 析法，可使发酵液中的S632A₂和S632A₃完全分开，提高了S632A₃的 收率，步骤Ⅰ中采用补料分批培养方式培养微生物，可使发酵液中的 产物浓度较高，并可提高培养基中营养物质的利用率，且补料分批培 养方式具有操作工艺简单、产物浓度高及营养物质利用率高的优点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

本发明提供了一种制备9-甲基反式链霉戊二酰亚胺的方法，该方 法包括培养、分离和精制三个步骤，以下为这三个步骤的详细描述。

步骤Ⅰ：培养

种子培养：种子培养基包括以重量百分比计的甘油4.0%、葡萄 糖1%、土豆淀粉0.5%、黄豆饼粉2.0%、干酵母0.5%、NaCl0.5%， 余量为水，pH=6.8，将种子培养基330ml加入500ml的三角瓶中，121 ℃灭菌25分钟后，接种一白金耳量的吸水链霉菌S632，在30℃旋转 震荡培养3天，旋转频率为220次/分，振幅为7cm。其中，本发明 采用的吸水链霉菌S632（Streptomyces hygroscopicus S632）保存于中 国微生物菌种保藏管理委员会抗菌素菌种中心，编号为B-155。

补料分批培养：补料分批培养的培养基包括以重量百分比计的甘 油3.0%、葡萄糖0.8%、土豆淀粉0.2%、黄豆饼粉2.0%、蛋白胨1%、 NaCl0.5%，CaCO₃0.2%，余量为水，pH=6.8，取发酵培养基5L装 入7.5L的发酵罐（型号：NBS Bioflow115）中，121℃灭菌30分钟 后，按发酵培养基6%（体积百分比）比例加入种子培养基，30℃发 酵培养4～6天得到发酵液。其中，发酵培养基的溶氧控制为15mg/L， pH控制为6.8，发酵罐中的搅拌转速与培养基的溶氧量进行关联，即 通过控制搅拌转速调整培养基溶氧量，在培养第3天补料1次，每次 500ml，补料培养基包括以重量百分比计的甘油6.0%、葡萄糖5%、 蛋白胨5%，余量为水，pH=6.8。

步骤Ⅱ：S632A₃的分离

吸水链霉菌S632经发酵后，向发酵液中加入助滤剂进行抽滤， 滤液经大孔吸附树脂（5%，V/V，厂家：Amberlite型号：XAD-2） 吸附后，吸附有S632A₃大孔吸附树脂用去离子水洗涤，然后以60% 正丁醇洗脱，洗脱过程中各阶段的洗脱液分别经生物检测 （Saccharomyces cerevisiae清酒酵母作为检定菌）后，将具有活性的 洗脱液合并，之后将洗脱液进行减压蒸馏，除去正丁醇，然后用乙酸 乙酯萃取2次，按8%(g//ml，即每毫升加入0.08克)加无水硫酸钠脱 水，过滤，滤液在40℃下减压蒸馏得到淡黄色油状物质。该物质用 硅胶进行柱层析，以石油醚-丙酮(4:1体积比)为洗脱液，得到的活性 组分减压浓缩得到淡黄色油状物质，即为S2632A₃粗品。其中，大孔 树脂吸附法还可以由溶酶体取法或层析法代替。

上述生物检测的方法为：采用纸片法测定洗脱液的活性，纸片直 径为10mm，由于S632发酵液抗酵母活性较强，故采用清酒酵母作 为检定菌，37℃培养24小时后观察有无抑菌圈和抑菌圈的大小，存 在抑菌圈则说明洗脱液具有活性，抑菌圈越大则洗脱液的活性越大。

步骤Ⅲ：S632A₃的精制

S632A₃粗品利用工业反向色谱柱，35%甲醇展开，洗脱过程中各 阶段的洗脱液分别经生物检测后，收集活性洗脱液，活性洗脱液经 HPLC法检测提纯（岛津LC-6A高效液相色谱仪），可得到具有单一 S632A₃物质的洗脱液，合并含有单一S632A₃物质的洗脱液，减压除 去有机溶媒后，水溶液以乙酸乙酯提取2次，减压除去乙酸乙酯，加 入石油醚使S632A₃析出，得到呈浅黄色油状物的S632A₃精品。其中， 本步骤的生物检测方法与步骤Ⅱ的生物检测方法相同。工业反向色谱 柱固相填充树脂：十八烷基硅烷键合硅胶，粒度为50μm，树脂的量 为200mL。

以下为S632A₃精制具体条件和方法：

1）工业反向色谱柱树脂活化：以甲醇0.6L洗涤，流速为4ml/min， 然后以纯化水7.2L洗涤，流速为4ml/min。

2）将0.5～1g S632A3粗品溶于10ml甲醇后以1ml/min进入工业 反向色谱柱；

3）工业反向色谱柱用0.4L纯化水洗涤，流速为4ml/min；

4）工业反向色谱柱用2L15%的甲醇洗涤，流速为4ml/min；

5）工业反向色谱柱用8L35%甲醇洗脱，流速为4ml/min，洗 脱过程中各阶段的洗脱液分别进行生物检测，收集到多份活性洗脱 液，活性洗脱液经HPLC法检测提纯，可得到具有单一S632A3物质 的洗脱液，合并含有单一S632A3物质的洗脱液，HPLC法检测提纯 的条件为：流速为4ml/min，液体温度为18～22℃，紫外线检测波长 560nm；

6）上一步骤得到的洗脱液用超过3倍体积的纯化水稀释至甲醇 浓度小于10%；

7）上一步骤得到的甲醇洗脱液用乙酸乙酯萃取至水相不含 S632A3，低于50℃下减压浓缩除去乙酸乙酯，加入适量甲醇尽可能 多去除乙酸乙酯，加入石油醚使S632A3析出，得到浅黄色油状物；

8）将上一步骤得到的浅黄色油状物在小于50度真空干燥，得到 S632A3精品。

表1为本发明步骤Ⅰ～ⅢS632A3的收率与现有技术中S632A3的 收率，需要说明的是，现有技术中培养发酵的培养基成分包括甘油、 葡萄糖、土豆淀粉、黄豆饼粉、蛋白胨、NaCl0.5%，CaCO3和水与 本发明相同，根据表1，采用本发明的方法S632A3的收率明显高于 现有技术，其中，S632A3的收率的计算方法为：S632A3的总收量与 发酵液总量的比值。

表1

项目 微生物培养方法 S632A₃精制方法 S632A₃的收率 现有技术 连续培养 一次层析 0.7g/L发酵液 本发明 补料分批培养 两次层析 4.2g/L发酵液

所得到的S632A₃物质的化学结构式为：

所得到的S632A₃物质的理化性质如下：

a)性状：浅黄色油状物；

b)分子式：C₁₇H₂₅NO₄；

c)分子量：308；

d)溶解性：易溶于甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮、氯仿及二甲基亚 砜，难溶于水；

e)S632A₃悬溶液（0.001%二甲基亚砜）的稳定pH范围是7～9， 酸性条件下不稳定；

f)对苯二胺反应呈阳性；

g)比旋光度：在25℃时为+58.7°(c0.15，氯仿)；

h)最大紫外吸收峰为233nm，红外吸收峰分别为3420，3210， 1730，1670，1260和750cm^-1。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形 和改进，这些都属于本发明的保护范围。