一种新的产N-乙酰神经氨酸大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种新的产N-乙酰神经氨酸大肠杆菌工程菌及构建方法和应用，该工程菌是通过将编码6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因、N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因和N-乙酰神经氨酸合成酶基因导入大肠杆菌表达，把大肠杆菌自身的6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因加强表达，并敲除大肠杆菌中的N-乙酰神经氨酸分解利用代谢途径酶的基因构建而成的重组大肠杆菌。本发明得到的工程菌株可用于利用葡萄糖或甘油为底物进行发酵培养合成N-乙酰神经氨酸。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的产N-乙酰神经氨酸大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用，属 生物工程技术领域。

背景技术

唾液酸是指一系列含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，系统命名为 5-氨基-3，5-二脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。唾液酸在自然界中分布广泛，已经发现许 多生物体内都有唾液酸的存在，目前发现的唾液酸已有50余种，N-乙酰-D-神经氨酸 （Neu5Ac)是唾液酸的主要种类，它的含量占整个唾液酸家族的99%以上，通常以α-糖 苷的形式位于非还原性寡聚糖如糖蛋白和糖脂的末端。

近些年来，唾液酸已经越来越多的受到人们的关注，唾液酸已经成功在食品、医药 和疾病诊断等领域得到应用，添加到婴儿奶粉中可以提高婴儿的智力和记忆力，提高其 免疫能力。添加到饮料中可以预防感冒，增加肠道对维生素及矿物质的吸收。可以作为 抗流感病毒药物合成的前体物质，对于肝病及肿瘤等的诊断具有重要价值。

从1964年Blix发现唾液酸至今，人们已经发现了多种唾液酸的生产方法，尤其是 生产唾液酸中主成分N-乙酰神经氨酸的一些方法，包括天然原料提取法、化学合成法、 酶催化法和发酵法等。其中天然原料提取法可得到高质量无污染的唾液酸产品，但由于 天然原料中唾液酸含量极低，导致该方法唾液酸的生产成本居高不下，限制了其大面积 推广应用。化学合成、酶催化在生产过程中需要添加昂贵的原料和有害的有机溶剂，导 致其生产出来的唾液酸往往只能用于药物的合成，而无法应用于食品和保健品。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新的产N-乙酰神经氨酸基因工程菌及其构建 方法和应用。本发明通过构建新的高产N-乙酰神经氨酸的基因工程大肠杆菌，提高了 N-乙酰神经氨酸的产量。

为解决上述技术问题，本发明的产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，首先是通过引入并 高表达6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因（GNA1）、N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因（AGE） 和N-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB），架构起从葡萄糖到N-乙酰神经氨酸的合成通路， 实现利用葡萄糖合成N-乙酰神经氨酸的目的。为了提高N-乙酰神经氨酸的产量，高表 达了6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因（nagB）以提高前体物氨基葡萄糖的供应量。为进一 步提高N-乙酰神经氨酸的产率，还可以敲除该代谢工程菌中的N-乙酰神经氨酸分解利用 代谢途径酶的基因。在一个实施方案中，本发明的工程菌敲除乙酰葡萄糖胺脱乙酰酶 编码基因（nagA）以避免中间产物N-乙酰葡萄糖胺的分解；敲除N-乙酰神经氨酸分解 代谢基因簇nanATEK，阻断N-乙酰神经氨酸的降解，达到在胞外积累终产物N-乙酰神经 氨酸的目的。详见附图1。

所述6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或能 表达相同功能酶的微生物，基因的获得可根据GenBank No.NM_001179949基因序列全 基因合成，或利用酿酒酵母（如菌株S288C）的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得， 或采用过类似手段从其他生物体获得。

所述N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因来源于鱼腥藻(Anabaena)或能表达相同功能酶 的微生物，基因的获得可根据GenBank No.DQ661858基因序列全基因合成，或利用鱼 腥藻（如藻株Anabaena sp.CH1）的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过 类似手段从其他生物体获得。

所述N-乙酰神经氨酸合成酶基因来源于空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）或能 表达相同功能酶的微生物，基因的获得可根据GenBank No.AF400048基因序列全基因 合成，或利用空肠弯曲菌（如菌株ATCC43438）的基因组DNA为模板通过PCR扩增获 得，或采用过类似手段从其他生物体获得。

所述6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因来源于大肠杆菌或能表达相同功能酶的微生物， 6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因的获得可根据大肠杆菌W3110基因组GenBank  No.NC_007779的中的nagB基因序列，经全基因合成得到，或利用大肠杆菌基因组DNA 为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。

所述6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因（GNA1）、N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因 （AGE）、N-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB）和6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因（nagB） 导入大肠杆菌并高表达，是将这四个基因克隆到表达载体上后，以质粒的方式在大肠 杆菌中表达。

所述的乙酰葡萄糖胺脱乙酰酶编码基因（nagA）为大肠杆菌自身基因组所有，能 将6-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺分解为6-磷酸葡萄糖胺，不利于N-乙酰神经氨酸前体物6- 磷酸-N-乙酰葡萄糖胺的积累，并影响最终N-乙酰神经氨酸的产量。

所述分解N-乙酰神经氨酸的nanATEK基因簇为大肠杆菌自身基因组中所有，包含 了四个基因，分别为：N-乙酰神经氨酸醛缩酶编码基因nanA、N-乙酰神经氨酸转运蛋 白编码基因nanT、N-乙酰-6-磷酸甘露糖胺异构酶编码基因nanE和N-乙酰甘露糖胺激 酶编码基因nanK，这四个基因能将N-乙酰神经氨酸从胞外转运至胞内并分解，不利 于N-乙酰神经氨酸的积累，具体可参见附图1。

本发明还公开了上述产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌的构建方法，具体步骤包括：将 nagB、GNA1、AGE和neuB基因分别克隆到表达载体上，转入大肠杆菌中，获得高产N- 乙酰神经氨酸代谢工程菌。其中所述四个基因可分别克隆至4个表达载体中，也可以以 任何方式组合分别克隆至3个表达载体中，或者以以任何方式组合分别克隆至2个表达 载体中。更特别地，可将所述四个基因克隆至一个表达载体中。

在一个特别的实施方案中，所述构建方法更加具体的步骤包括：

1）克隆6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因（nagB）至表达载体1，以实现该基因的高表 达；

2）克隆6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因（GNA1）至1）获得的表达载体上，获得双 基因表达载体，以实现两个基因的高表达；

3）克隆N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因（AGE）至表达载体2（载体1和2须能共 存于同一宿主菌），以实现该基因的高表达；

4）克隆N-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB）至3）获得的表达载体上，获得双基 因表达载体，以实现两个基因的高表达；

5）将2）和4）中获得的双基因表达载体转化大肠杆菌菌株中，获得产N-乙酰神经 氨酸代谢工程菌

在另一实施方案中，先敲除大肠杆菌中的分解N-乙酰神经氨酸的nanATEK基因簇 和分解6-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺的nagA基因，将nagB、GNA1、AGE和neuB基因分别克 隆到表达载体上，转入敲除了nanATEK基因簇和nagA基因的大肠杆菌中，获得高产N- 乙酰神经氨酸代谢工程菌。其中所述四个基因可分别克隆至4个表达载体中，也可以以 任何方式组合分别克隆至3个表达载体中，或者以以任何方式组合分别克隆至2个表达 载体中。更特别地，可将所述四个基因克隆至一个表达载体中。

在一个特别的实施方案中，该构建方法更加具体的步骤包括：

1）敲除上述大肠杆菌中的nagA基因，获得nagA失活的菌株；

2）敲除大肠杆菌中的基因簇nanATEK，获得基因簇nanATEK和nagA失活的菌株；

3）克隆6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因（nagB）至表达载体1，以实现该基因的高表 达；

4）克隆6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因（GNA1）至3）获得的表达载体上，获得双 基因表达载体，以实现两个基因的高表达；

5）克隆N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因（AGE）至表达载体2（载体1和2须能共 存于同一宿主菌），以实现该基因的高表达；

6）克隆N-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB）至5）获得的表达载体上，获得双基 因表达载体，以实现两个基因的高表达；

7）将4）和6）中获得的双基因表达载体转化入2）所得的菌株中，获得产N-乙酰 神经氨酸代谢工程菌；

本发明还公开了一种高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌的应用，即利用上述工程菌 进行N-乙酰神经氨酸的生产，该生产方法包括步骤：

1）挑取高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌的单菌落于种子培养基中，在30～40℃好 气培养12～20小时；其中，优选在35～38℃培养15～18小时；且种子能多级放大培 养；

2）将培养好的种子（高产N-乙酰神经氨酸代谢工程种子）接种于含有发酵培养基 的发酵罐中，在30～40℃（优选33～38℃，尤其优选37℃）发酵培养，搅拌速度300～800 转/分钟，通风培养，用氨水控制pH6～8，优选pH6.8～7.1；

4）当菌体浓度OD₆₀₀为20～30时，加入终浓度为0.05～1mM IPTG（异丙基-β-D- 硫代吡喃半乳糖苷），30～40℃继续培养（优选33-37℃），至结束发酵。其中，IPTG的 终浓度优选0.1～0.5mM，最优选0.2mM。

所述步骤1）和2）中的种子培养基和发酵培养基的配方如下：

氮源，0.1-10g/L，磷源0.1-25g/L，葡萄糖或甘油1-100g/L，微量元素0.01-50mg/L。 氮源包括酵母提取物、蛋白胨、玉米浆、铵盐、硝酸盐或其组合的混合物。磷源包括磷 酸及其盐类。微量元素包括：锰、锌、钼、硼、钴、铜、镍。

本发明通过在大肠杆菌中构建一条新的高产N-乙酰神经氨酸的代谢通路（如图1 所示），增强N-乙酰神经氨酸合成途径中的限速酶基因表达。在一个特别的实施方案中， 还进一步失活导致N-乙酰神经氨酸消耗和回流的基因，阻止N-乙酰神经氨酸的回流和 消耗，使得工程菌株能积累高浓度的N-乙酰神经氨酸。通过本发明的方法，得到了基 因工程大肠杆菌，该菌株可以利用葡萄糖或甘油合成高水平N-乙酰神经氨酸，具有工 业化生产的潜力。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是大肠杆菌中构建高水平N-乙酰神经氨酸生产工程菌株代谢相关途径。

具体实施方式

以下实施例中使用的质粒、PCR试剂等采用商业产品，具体操作按照说明书进行。 其他未注明的实验操作按照常规分子操作方法进行。pKD46、pKD778和pIJ773质粒参 见[Gust,B.,et al.,PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain  needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin.Proceedings of the National  Academy of Sciences of the United States of America,2003.100(4):p.1541]。

实施例1：高产N-乙酰神经氨酸基因工程菌的构建

一、采用RED重组方法，失活菌株中的nagA基因和nanATEK基因簇，其具体步 骤如下：

1、nagA基因的敲除

1）根据大肠杆菌BL21（DE3）（Invitrogen公司）基因组（Genbank No.CP001509） 序列，设计引物：上游引物F-KO-nagA：

TATGCATTAACCCAGGGCCGGATCTTTACCGGCCACGAAATTCCGGGGATCCGTCG ACC（SEQ ID NO.1所示）和下游引物R-KO-nagA：

TTGAGTTACGACCTCGTTACCGTTAACGATGGTCCTGGTTGTAGGCTGGAGCTGCT TCG（SEQ ID NO.2所示）。

利用引物F-KO-nagA和R-KO-nagA，以质粒pIJ773为模板，利用商业化的PCR试 剂，经PCR扩增得到DNA片段，纯化备用。

2）将RED重组酶表达质粒载体pKD46利用电击转化法转入大肠杆菌BL21（DE3）， 30度过夜培养得到菌株BL21（DE3）/pKD46；

3）LB培养基中加入1%（m/V，质量体积百分比）的L-阿拉伯糖，30℃震荡培养 菌株BL21（DE3）/pKD46至OD600达到0.6，然后制备感受态细胞。将上述制备好的 DNA片段电转化入该感受态细胞内，涂布安普霉素抗性（50μg/mL）LB平板，30度过 夜培养得到转化子。

4）挑取转化子，用菌落PCR鉴定

菌落PCR引物为F-nagA：CCTGACACCTTGCTCAGGGC（SEQ ID NO.3所示）和 R-KO-nagA。

挑取的转化子菌落经PCR扩增，能扩增出大小为1.5kb左右条带的菌落，即为nagA 失活的菌株BL21（DE3）/pKD46/ΔnagA。

2、nanATEK基因簇的敲除

1）根据大肠杆菌BL21（DE3）（Invitrogen公司）基因组（Genbank No.CP001509） 序列，设计引物：上游引物F-KO-nanA：

GCAACGAATTTACGTGGCGTAATGGCTGCACTCCTGACTATTCCGGGGATCCGTC GACC（SEQ ID NO.4所示）和下游引物R-KO-nanK：

TTTTTCTCCCTGGGCCAACAGCGCAGCCCCAAGTAAACCTGTAGGCTGGAGCTGC TTC（SEQ ID NO.5所示），利用引物F-KO-nanA和R-KO-nanK，以质粒pIJ778为模板， 利用商业化的PCR试剂，经PCR扩增得到DNA片段，纯化备用。

2）LB培养基中加入1%（m/V，质量体积百分比）的L-阿拉伯糖，30℃震荡培养 菌株BL21（DE3）/pKD46/ΔnagA至OD600达到0.6，然后制备感受态细胞。将上述 制备好的DNA片段电转化入该感受态细胞内，涂布链霉素抗性（50μg/mL）LB平板， 37度过夜培养得到转化子，以便同时消除质粒pKD46。

4）挑取转化子，用菌落PCR鉴定

菌落PCR引物为F-nanA：GACAAGCATCACTTCAGAGG（SEQ ID NO.6所示）和 R-KO-nanK。

挑取的转化子菌落经PCR扩增，能扩增出大小为1.5kb左右条带的菌落，即为 nanATEK失活的菌株BL21（DE3）/ΔnagA/ΔnanATEK。

二、nagB和GNA1基因双表达载体pACYCDuet-nagB-GNA1的构建

1、nagB基因的克隆表达

1）根据大肠杆菌W3110基因组GenBank No.NC_007779的中的nagB基因序列设计 引物：正向引物F-nagB：ctaggatccatgagactgatccccctgactac（SEQ ID NO.7）和反向引物 R-nagB：gcgaagcttttacagacctttgatattttctg（SEQ ID NO.8），引物两端添加了BamHI和HindIII 酶切位点序列，以便后续的基因操作。

2）以大肠杆菌W3110菌株（美国大肠杆菌遗传保藏中心，The E.coli genetic stock  center，cgsc）的总DNA为模板，以上述引物（SEQ ID NO.7-8所示）PCR扩增得到nagB 基因片段，并用BamHI和HindIII酶切，回收备用。

3）抽提纯化表达载体pACYCDuet-1，用BamHI和HindIII双酶切，回收备用。

4）连接上述酶切纯化好的载体和片段，用T4DNA连接酶连接，并转入大肠杆菌 DH5α（购自TAKARA公司）感受态细胞，得到表达载体pACYCDuet-nagB。

2、GNA1基因的克隆表达

1）根据GNA1的基因序列（GenBank No.NM_001179949）全基因合成GNA1基因， 两端加NdeI和XhoI位点，具体序列如下所示（SEQ ID NO.9）。

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2）将合成的基因片段用NdeI和XhoI酶切，回收备用。

3）抽提纯化上步构建好的表达载体pACYCDuet-nagB，用NdeI和XhoI双酶切，回 收备用。

4）连接上述酶切纯化好的载体和片段，用T4DNA连接酶连接，并转入大肠杆菌 DH5α（购自TAKARA公司）感受态细胞，得到表达载体pACYCDuet-nagB-GNA1。

三、AGE和neuB基因双表达载体pETDuet-AGE-neuB的构建

1、AGE基因的克隆表达

1）根据AGE的基因序列（GenBank No.DQ661858）全基因合成AGE基因，两端添加 了BamHI和HindIII酶切位点序列，以便后续的基因操作，具体序列如下所示（SEQ ID  NO.10）。

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2）将合成的基因片段用BamHI和HindIII酶切，回收备用。

3）抽提纯化表达载体pETDuet-1，用BamHI和HindIII双酶切，回收备用。

4）连接上述酶切纯化好的载体和片段，用T4DNA连接酶连接，并转入大肠杆菌 DH5α（购自TAKARA公司）感受态细胞，得到表达载体pETDuet-AGE。

2、neuB基因的克隆表达

1）根据neuB的基因序列（GenBank No.AF400048）全基因合成neuB基因，两端 加NdeI和XhoI位点，具体序列如下所示（SEQ ID NO.11）。

catatgagcttacccgatggattttatataaggcgaatggaagagggggatttggaacaggtcactgagac

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2）将合成的基因片段用NdeI和XhoI酶切，回收备用。

3）抽提纯化上步构建好的表达载体pETDuet-AGE，用NdeI和XhoI双酶切，回收 备用。

4）连接上述酶切纯化好的载体和片段，用T4DNA连接酶连接，并转入大肠杆菌 DH5α（购自TAKARA公司）感受态细胞，得到表达载体pETDuet-AGE-neuB。

四、N-乙酰神经氨酸工程菌的构建

1）分别用液体LB培养基过夜培养含有载体pACYCDuet-nagB-GNA1和 pETDuet-AGE-neuB的大肠杆菌DH5α菌株，抽提质粒pACYCDuet-nagB-GNA1和 pETDuet-AGE-neuB。

2）分别培养大肠杆菌菌株BL21（DE3）/ΔnagA/ΔnanATEK、BL21（DE3），制备 感受态细胞，并电击转化质粒载体pACYCDuet-nagB-GNA1和pETDuet-AGE-neuB进 入该菌株，分别获得能高产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌株BL21（DE3）/ΔnagA/Δ nanATEK/pACYCDuet-nagB-GNA1/pETDuet-AGE-neuB、BL21（DE3） /pACYCDuet-nagB-GNA1/pETDuet-AGE-neuB，分别命名为CASOV-1和CASOV-2。

实施例2葡萄糖为碳源发酵生产N-乙酰神经氨酸

1、种子和发酵培养基（1L）：

(NH₄)₂SO₄4g/L；KH₂PO₄6g；K₂HPO₄·3H₂O8g；MgSO₄·7H₂O0.25g；葡萄糖 5g，微量元素10ml。

其中，微量元素为：硫酸锰100mg/L；氯化锌70mg/L；钼酸钠35mg/L；硼酸60 mg/L；氯化钴200mg/L；硫酸铜29.28mg/L；氯化镍25mg/L；浓盐酸（37%）0.9ml/L。

补料液：500g/L葡萄糖。

2、发酵过程：

1）挑取单菌落于装液量4ml LB试管中，37℃培养8小时。

2）2ml一级种子接种于200ml种子培养基中，37℃培养8～10小时。

3）二级种子接种于装液量3.5L的发酵罐中，37℃，搅拌速度300～800转/分钟， 溶氧保持在30%以上，用氨水控制pH在6.9。

4）葡萄糖耗完后，开始以5g/L.h的速度补加葡萄糖。

5）发酵液菌体OD₆₀₀=25～30时加入IPTG（IPTG终浓度为0.2mM），37℃培养，培 养基中葡萄糖浓度保持在2～5g/L，70小时后可减慢补料速度，至结束发酵。

经检测，发酵结束时，CASOV-1所产N-乙酰神经氨酸的浓度可达20g/L；CASOV-2 所产N-乙酰神经氨酸的浓度可达3g/L。

实施例3甘油为碳源发酵生产N-乙酰神经氨酸

以20g/L的甘油代替葡萄糖，发酵培养基其他成分同实施例2，补料培养基为600g/L 甘油；

发酵工艺同实施例2。

最终经过80小时左右发酵后，CASOV-1产物N-乙酰神经氨酸浓度可达30g/L； CASOV-2所产N-乙酰神经氨酸的浓度可达5g/L。

以上培养结果表明，经代谢工程技术构建的基因工程菌、尤其是CASOV-1具有产 N-乙酰神经氨酸的能力，具备了工业化的潜力。