无损检测细胞miRNA的表达量及确定细胞类型与状态的方法

摘要

本发明提供一种无损检测细胞miRNA的表达量及确定细胞类型与状态的方法，具体为利用细胞培养基中miRNA的表达量来判断细胞类型与状态的方法，包括培养不同类型的细胞，收集其培养基，提取培养基中的RNA，反转录，利用荧光定量PCR的方法检测细胞培养基中的miRNA，根据在对照不同细胞类型与状态下miRNA的表达量与所检到的miRNA表达量的关系来判断所检细胞的类型与状态。本发明的方法首次证明可通过检测培养基中miRNA的表达量判断细胞的类型与状态，包括干细胞的多能性水平和转分化获得的细胞状态等，从而避免对细胞的破坏，尤其适用于细胞数量有限的实验与临床方面的应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测细胞中miRNA(microRNA) 的表达量和确定细胞类型与状态的方法，尤其涉及一种快速、简便、对细 胞无损并且可以在培养过程中持续检测干细胞多能性水平和其它细胞类 型与状态的方法，具体为利用细胞培养基中微小RNA(microRNA，miRN A)的表达量来判断细胞类型与状态的方法，包括培养不同类型的细胞，收 集其培养基，提取培养基中的RNA，反转录，利用荧光定量PCR的方法 检测细胞培养基中的miRNA，从而根据标志miRNA的表达量判断干细胞 的多能性水平或其他细胞的类型与状态。

背景技术

miRNA是真核生物基因组中广泛存在的大小约为21~25个碱基的非 编码微小RNA。它一般由位于基因间区及内含子中的miRNA基因转录， 形成原始miRNA，在动物细胞核内被加工成70nt左右的miRNA前体 （pre-miRNA），再转运到胞质加工为成熟miRNA。成熟miRNA进入 miRNA诱导的基因沉默复合物（miRNA-induced silencing complex; miRISC），与目标mRNA配对，通过降解目标mRNA或阻碍蛋白质翻译 来负向调控基因表达（Valencia-Sanchez,M.A.,等,Control of translation and  mRNA degradation by miRNAs and siRNAs.Genes Dev,2006.20(5):p. 515-24）。目前的研究已发现人类miRNA有1900多种，这些miRNA参与 了人类1/3基因的表达调控，涉及多种关键生命过程。

2008年，Chen等（Chen,X.,等,Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.Cell  Res,2008.18(10):p.997-1006）用Solexa测序技术证明了人、大鼠、小鼠、 牛、马等物种的血清中可以检测到大量的miRNA。之后大量研究结果提 示，血清miRNA与肿瘤组织中miRNA的表达谱相关（Ng,E.K.,等, Differential expression of microRNAs in plasma of patients with colorectal cancer:a potential marker for colorectal cancer screening.Gut,2009.58(10):p. 1375-81；Lawrie,C.H.,等,Detection of elevated levels of tumour-associated  microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma.Br J  Haematol,2008.141(5):p.672-5；Lawrie,C.H.,等,MicroRNA expression  distinguishes between germinal center B cell-like and activated B cell-like  subtypes of diffuse large B cell lymphoma.Int J Cancer,2007.121(5):p. 1156-61；Zhu,W.,等,Circulating microRNAs in breast cancer and healthy  subjects.BMC Res Notes,2009.2:p.89）。此外，Gilad等（Gilad,S.,等, Serum microRNAs are promising novel biomarkers.PLoS One,2008.3(9):p. e3148）发现利用实时定量PCR（Quantitative Real-Time RT-PCR，qRT-PCR） 技术可以对人体的尿液、唾液、羊水及胸水中的miRNA进行定量。这些 发现为研究miRNA开辟了新的途径，证明了体液中普遍含有miRNA。

目前研究细胞中miRNA的方法一般都是通过收集破坏细胞提取RNA 来实现的。但由于胚胎干细胞、诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem  cells,iPS细胞)等具有临床应用价值的细胞一般数量有限，并且需要在临床 应用前对其细胞特性与状态等特征进行动态检测，收集破坏细胞的方法不 仅造成的大量细胞损耗，而且检测结果与继续培养的细胞也具有不一致 性，从而成为数量受限的细胞在基础研究与临床应用方面的一个重要瓶 颈。针对这一问题，本发明首次证明细胞培养基中存在可检测的miRNA， 并且其相对表达丰度与细胞中miRNA的相对表达丰度的变化趋势存在一 致性。在检测方法方面，本发明利用TRIZOL LS进行小分子RNA提取， 并利用糖原使RNA可见，从而最大限度地防止了RNA丢失。

利用不同手段转变细胞类型（如将分化的动物成体细胞转变为诱导多 能性干细胞(iPS细胞)和不经过干细胞状态的成体细胞转分化）是细胞生物 学研究的重要方向，也具有广阔的临床应用前景。但由于目前细胞命运转 变方法的诱导周期普遍较长，成功率还很低，如果能够在诱导过程中动态 地检测细胞的状态，则可在诱导早期对细胞的特性进行判断，有利于快速 筛选出符合要求的目标细胞，具有重要的基础研究与临床应用价值。在本 发明中，我们通过持续检测小鼠胚胎成纤维细胞（MEF细胞）诱导成为诱 导多能性干细胞（iPS细胞）过程中细胞培养基中miRNA在每一天的表达 变化情况，证明细胞培养基中miRNA的表达情况与细胞的类型与状态相 一致，因此可以通过检测细胞培养基中miRNA的表达情况来判断细胞状 态和监测细胞类型的转变。

发明内容

因而，本发明的目的是针对现有技术的不足，提出了一种检测细胞培 养基中miRNA含量的方法，首次证明细胞培养基中miRNA的相对丰度与 所培养细胞中miRNA的相对丰度的变化趋势存在一致性，因此可以通过 检测细胞培养基中miRNA的表达情况来鉴定细胞的类型与状态，从而避 免对细胞的破坏，尤其适用于细胞数量有限的基础研究与临床方面的应 用。本发明还提供了不同发育潜能的多能性干细胞（2N-iPS细胞为部分多 能性细胞，4N-iPS细胞为完全多能性细胞）以及他们的来源细胞培养基中 miRNA的表达检测结果，证明培养基中特定miRNA的相对表达量可以指 示细胞多能性水平的高低。其中2N-iPS细胞IP20D-3和IP36D-3，4NiPS 细胞IP14D-1和IP14D-6来源于小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryo  fibroblast，MEF），4N-iPS细胞IP16DT-2A来源于小鼠尾尖成纤维细胞 （tail-tip fibroblast，TTF），4N-iPS细胞IP14DN-5来源于小鼠神经前体细 胞（小鼠AM1-3细胞）。

除非特别指明，本文中的“Ct值”是指“每个反应管内的荧光信号达 到设定的域值时所经历的循环数”。

除非特别指明，本文中的“FBS”是指“胎牛血清（Fetal Bovine Serum）”。

除非特别指明，本文中的“EGF”是指“上表皮生长因子”。

除非特别指明，本文中的“bFGF”是指“碱性纤维生长因子”。

针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种快速、简便、对细胞无损的检测细胞中miRNA 的表达量的方法，其是通过检测培养基中的miRNA的表达量而进行的， 所述细胞培养基中miRNA表达量的检测通过包括以下步骤的方法进行：

1）收集过夜培养细胞的培养基，离心，取上清，再将其过滤；

2）用步骤1）获得的过滤后的上清液提取RNA；

3）将步骤2）提取的RNA进行逆转录反应，得到cDNA溶液；

4）将步骤3）得到的cDNA溶液进行PCR扩增反应，再用荧光定量 PCR仪检测，从而得出其miRNA表达量。

优选地，在步骤1）中，所述细胞选自人或动物胚胎成纤维细胞、人 或动物诱导多能性干细胞（iPS细胞）、人或动物尾尖成纤维细胞、动物胚 胎干细胞（ES细胞）、人或动物成体干细胞、转分化来源的人或动物细胞、 人或动物的分化细胞、或肿瘤等疾病细胞或疾病干细胞中的一种或多种。

优选地，所述动物胚胎成纤维细胞可为小鼠胚胎成纤维细胞（mouse  embryo fibroblast，MEF）。

优选地，所述动物诱导多能性干细胞可选自2N-iPS细胞和4N-iPS细 胞，更优选地，所述2N-iPS细胞包括细胞系IP20D-3和IP36D-3，所述 4N-iPS细胞包括细胞系IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A和IP14DN-5。

优选地，所述动物胚胎干细胞为小鼠胚胎干细胞ESC2和/或CL11。

优选地，所述人或动物的分化细胞可选自动物尾尖细胞和/或小鼠神经 前体细胞。

优选地，所述动物尾尖成纤维细胞可为小鼠尾尖成纤维细胞（tail-tip  fibroblast，TTF）。

优选地，所述神经前体细胞可为小鼠神经前体细胞（小鼠AM1-3细 胞）。

优选地，所述肿瘤细胞可为人乳腺癌细胞（MCF-7）。

优选地，当所述细胞为MEF、TTF或MCF-7细胞时，所述培养细胞 的培养基配方为450ml DMEM加入50ml FBS，5ml 100x青链霉素的培 养基。

优选地，当所述细胞为AM1-3时，所述培养细胞的培养基为加入EGF 和bFGF（浓度均为20ng/ml）的N2B27培养基。

优选地，当所述细胞为小鼠胚胎干细胞或iPS细胞（诱导多能性干细 胞）时，所述培养细胞的培养基为含15%FBS（胎牛血清,Gibco）的DMEM， 并添加1000U的LIF（白血病抑制因子，Chemicon）、2mM的谷氨酰胺 （glutamine，Sigma）、1mM的丙酮酸钠（sodium pyruvate，Sigma）、以 及0.1mM的β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol，Sigma）、0.1mM的非必 需氨基酸（non-essential amino acid，Gibco）等。

优选地，在步骤4）中，所述PCR扩增反应的上游引物为miRNA特 异扩增的上游引物，所述下游引物为序列为通用引物（Universal Adaptor  PCR Primer），优选地，所述通用引物为商品名AOMD-Q050，GeneCopoeia 的通用引物。

优选地，所述miRNA的特异扩增的上游引物为miRNA-292-3P、 miRNA-294-3P、miRNA-323-3P或miRNA-21-5P的特异扩增的上游引物。

优选地，所述miRNA-292-3P的特异扩增的上游引物为商品名为 MmiRQP0944，GeneCopoeia的引物。

优选地，所述miRNA-294-3P的特异扩增的上游引物为商品名为 MmiRQP0947，GeneCopoeia的引物。

优选地，所述miRNA-323-3P的特异扩增的上游引物为商品名为 MmiRQP0410，GeneCopoeia的引物。

优选地，所述miRNA-21-5P的特异扩增的上游引物为商品名为 HmiRQP0316，GeneCopoeia的引物。

优选地，所述步骤1）通过包括以下步骤的方法进行：收集过夜培养 细胞的培养基5-10ml，于2000-3000rpm离心，取上清，再将其用0.45μm 的过滤器过滤。

优选地，在步骤1）中，收集过夜培养细胞的培养基5ml，于2000rpm 离心。

优选地，在步骤2）中，用TRIZOL LS试剂提取RNA。

优选地，在步骤3）中，用All-in-OneTM miRNA反转录试剂盒进行逆 转录反应。

另一方面，本发明提供一种快速、动态、对细胞无损伤的确定干细胞 的多能性水平的检测方法，所述方法是通过上述方法检测干细胞培养基中 miRNA的表达量而进行的。

再一方面，本发明提供一种快速、动态、对细胞无损伤的确定细胞类 型与状态的检测方法，所述方法是通过上述方法检测细胞培养基中miRNA 的表达量而进行的。

还一方面，本发明提供一种快速、动态、对细胞无损伤的鉴定用于临 床治疗前细胞状态与性质的检测方法，所述方法是通过上述方法检测细胞 培养基中miRNA的表达量而进行的。

因而，从技术层面：本发明提出的检测细胞培养基中miRNA含量的 方法，首次证明细胞培养基中miRNA的相对丰度与所培养细胞中miRNA 的相对丰度一致，因此可以通过检测细胞培养基中miRNA的表达情况来 鉴定细胞的类型与状态，从而避免对细胞的破坏，尤其适用于细胞数量有 限的基础研究与临床方面的应用。从应用层面：通过检测细胞培养基中 miRNA的表达，可以实现：1）对不同类型干细胞多能性水平的检测；2） 对不同时期iPS诱导细胞多能性水平的检测；3）对转分化来源与转分化 过程中细胞类型与状态的检测；4）对通过其它方式改变细胞状态而获得 的细胞或其它来源与类型的细胞状态的检测。发明人在小鼠和人的培养细 胞获得一致的结果，说明本检测方法不具有物种局限性，可被应用于任何 物种来源的细胞。总之，本发明提供了有效地提取细胞培养基中的miRNA， 并通过对提取的miRNA进行定量PCR检测来判断细胞类型与状态的方 法。本发明的方法首次实现在对细胞无创伤的情况下对细胞的类型和状态 进行快速的分子水平判断，对于动态监测细胞类型改变、早期与快速的目 标细胞筛选、临床应用前细胞状态监测具有重要应用价值。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为实施例1中通过本发明的方法利用PCR检测CL11细胞培养基 中的miRNA-292-3P和miRNA-294-3P的扩增曲线，其中，图1A为CL11 细胞培养基中的miRNA-292-3P的扩增曲线，图1B为CL11细胞培养基中 的miRNA-294-3P的扩增曲线，图中dR表示基线校正的荧光值；

图2为实施例2中通过本发明的方法PCR检测iPS细胞诱导过程中细 胞培养基中的miRNA-294-3P的表达结果，其中纵坐标表示以第1天的 miRNA表达量为基准，在iPS细胞诱导过程中细胞培养基中，每天的 miRNA-294-3P的表达量；

图3为实施例3中通过本发明的方法PCR扩增检测iPS细胞诱导过程 中细胞中的miRNA-294-3P的表达结果，其中纵坐标表示以第1天的 miRNA表达量为基准，在iPS细胞诱导过程中细胞中，每天的 miRNA-294-3P的表达量；

图4为实施例4中通过本发明的方法PCR扩增检测不同细胞培养基中 的miRNA-323-3P的表达结果，其中纵坐标表示以第一天的MEF细胞培 养基中miRNA的表达量为基准，不同细胞培养基中的miRNA-323-3P的 表达量；

图5为实施例5中通过本发明的方法PCR检测不同细胞中的 miRNA-323-3P的表达结果，其中纵坐标表示以MEF细胞中miRNA的表 达量为基准，不同细胞中的miRNA-323-3P的表达量。

图6为实施例6中通过本发明的方法PCR检测人乳腺癌MCF-7细胞 培养基中的miRNA-21-5P的扩增曲线，图中dR表示基线校正的荧光值。

具体实施方式

除非特别指明，以下实施例中的MEF、TTF、AM1-3、IP20D-3、IP36D-3、 IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A、IP14DN-5、ESC2和人乳腺癌细胞系MCF-7 均购自中国科学院动物研究所，CL11细胞购自北京生命科学研究所。

其中MEF、TTF和MCF-7细胞的培养基配方为450ml DMEM加入 50ml FBS，5ml 100x青链霉素。AM1-3培养基为N2B27培养基加入EGF 和bFGF（浓度均为20ng/ml），小鼠ES细胞（胚胎干细胞）和iPS细胞 （诱导多能性干细胞）培养基为含15%FBS（胎牛血清,Gibco）的DMEM， 并添加1000U的LIF（白血病抑制因子，Chemicon）、2mM的谷氨酰胺 （glutamine，Sigma）、1mM的丙酮酸钠（sodium pyruvate，Sigma）、以 及0.1mM的β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol，Sigma）、0.1mM的非必 需氨基酸（non-essential amino acid，Gibco）等。

除非特别指明，以下实施例中所用的荧光定量PCR仪型号为 Stratagene Mx 3000P荧光定量PCR仪，购自吉泰公司。

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级的试剂，且可 从常规渠道商购获得。

实施例1

a.收集培养基：收集过夜培养的小鼠胚胎干细胞CL11细胞的培养基 5ml，2000rpm离心5分钟，取上清，用0.45μm的滤器过滤。

b.提取RNA：将收集的5ml培养基中加入15ml TRIZOL LS试剂 (Invitrogen)，用力振荡混匀，冰中静置15分钟。加入4ml氯仿用力震荡 均匀，静置15分钟。12000g离心15分钟，收集上清。加入等体积的异 丙醇沉淀，1μl糖原，1h（-20℃），然后12000g离心20分钟，沉淀总 RNA。用75%乙醇洗涤，干燥沉淀10分钟，用20μl无RNA酶的水溶解， 测浓度，-80℃备用。

c.RNA逆转录：用All-in-One^TMmiRNA反转录试剂盒(GeneCopoeia) 对步骤b获得的RNA进行逆转录反应，具体操作依该试剂盒说明书进行： 在0.5ml离心管中加入18μl在步骤b中获得的RNA，再加入5μl逆转 录反应液，1μl PolyA聚合酶，1μl RTase mix，37℃反应1小时，85℃ 5 分钟，得到cDNA溶液。

d.PCR检测：用SYBR Green PCR检测试剂盒对步骤c的cDNA溶液 进行PCR扩增反应。上游引物为：miRNA-292-3P特异扩增的上游引物为 商品名的MmiRQP0944，GeneCopoeia引物，miRNA-294-3P特异扩增的 上游引物为商品名的MmiRQP0947，GeneCopoeia引物，小RNA U6特异 扩增的上游引物为商品名的MmiRQP9002，GeneCopoeia引物，下游通用 引物为Universal Adaptor PCR Primer（商品名：AOMD-Q050， GeneCopoeia）。在荧光定量PCR反应管中分别加入上下游引物各1μl， cDNA溶液9μl，SYBR Green PCR反应缓冲液10μl。反应条件：95℃预 变性10分钟，然后95℃ 30秒，60℃ 1分钟，共40个循环。再用荧光定 量PCR仪检测，具体操作以检测试剂盒及荧光定量PCR仪说明书进行， 分三次平行扩增胚胎干细胞CL11培养基。

通过检测不同细胞培养基中的miRNA和小RNA U6（内参值）的Ct 值，就可根据公式△Ct=Ct_miRNA-Ct_U6来计算该miRNA的△Ct值，根据△ Ct值的大小就可以判断出该miRNA的相对表达量，△Ct值小，其对应的 miRNA的表达水平高；而△Ct值大，其对应的miRNA的表达水平低。

miRNA-292-3P（SEQ ID NO:1： AAAGUGCCGCCAGGUUUUGAGUGU）的扩增结果如图1A所示：图中 为胚胎干细胞CL11培养基三次平行扩增miRNA-292-3P的扩增曲线，从 扩增曲线可以得到三次平行扩增miRNA-292-3P的Ct值分别为：21.92， 21.81，21.99。miRNA-294-3P的扩增结果如图1B所示：图中为胚胎干细 胞CL11培养基三次平行扩增miRNA-294-3P的扩增曲线，从扩增曲线可 以得到三次平行扩增miRNA-294-3P的Ct值分别为：21.31，21.49，22.15。 以上结果说明：细胞培养基中存在miRNA，并且本检测方法存在一致性。

将上述实施例获得的PCR产物，送往中国科学院北京基因组研究所通 过Sanger测序法进行测序，结果证明所得PCR产物为目的miRNA-292-3P。

实施例2

a.收集培养基：接种约1x10⁴个MEF细胞，利用KOSM体系进行iPS 细胞诱导，收集MEF诱导为iPS细胞过程中从第1天到第16天每天的培 养基5ml，2000rpm离心5分钟，取上清，用0.45μm的滤器过滤。

b.提取RNA：将分离的5ml培养基中加入15ml TRIZOL LS试剂 (Invitrogen)，用力振荡混匀，冰中静置15分钟。加入4ml氯仿用力震荡 均匀，静置15分钟。12000g离心15分钟，收集上清。加入等体积的异丙 醇和1μl糖原沉淀1h（-20℃），然后12000g离心20分钟。沉淀总RNA。 用75%乙醇洗涤，干燥沉淀10分钟，用20μl无RNA酶的水溶解，测浓 度，-80℃备用。

c.RNA逆转录：用All-in-One^TMmiRNA反转录试剂盒(GeneCopoeia) 对步骤b获得的RNA进行逆转录反应，具体操作依该试剂盒说明书进行： 在0.5ml离心管中加入18μl在步骤b中获得的RNA，再加入5μl逆转录 反应液，1μl PolyA聚合酶，1μl RTase mix，37℃反应1小时，85℃ 5分 钟。得到cDNA溶液。

d.PCR检测：用SYBR Green PCR检测试剂盒对步骤c获得的cDNA 溶液进行PCR扩增反应。上游引物为：miRNA-294-3P特异扩增的上游引 物为商品名：MmiRQP0947，GeneCopoeia的引物，小RNA U6特异扩增 的上游引物为商品名MmiRQP9002，GeneCopoeia的引物，下游通用引物 为Universal Adaptor PCR Primer（商品名：AOMD-Q050，GeneCopoeia）。 在荧光定量PCR反应管中分别加入上下游引物各1μl，cDNA溶液9μl， SYBR Green PCR反应缓冲液10μl。反应条件：95℃预变性10分钟，然 后95℃ 30秒，60℃ 1分钟，共40个循环。再用荧光定量PCR仪检测， 具体操作以检测试剂盒及荧光定量PCR仪说明书进行。

通过检测不同诱导天数细胞培养基中的miRNA和小RNA U6的Ct值， 就可根据公式△Ct=Ct_miRNA-Ct_U6来计算该miRNA的△Ct值，根据△Ct值 的大小就可以判断出该miRNA的相对表达量，△Ct值小，其对应的miRNA 的表达水平高；而△Ct值大，其对应的miRNA的表达水平低。

培养基中miRNA-294-3P（SEQ ID NO:2： AAAGUGCUUCCCUUUUGUGUGU）的相对表达量如图2所示：图中为 荧光定量PCR结果经过上述公式计算后得到的各个样品中miRNA-294-3P 的相对表达量，纵坐标为miRNA的相对表达量。可以看到：miRNA-294-3P 为ES细胞特异表达的标记物（marker），因此在iPS细胞诱导过程中，随 着诱导时间的增长，ES克隆逐渐增加，细胞培养基中的miRNA-294-3P的 相对表达量也随着诱导时间的增长而增高。图中，以诱导第1天细胞培养 基中的表达量为1，其他诱导时间的表达量均为与第1天相比而得到的相 对表达量。

将上述实施例获得的PCR产物，送往中国科学院北京基因组研究所通 过Sanger测序法进行测序，结果证明所得PCR产物为目的miRNA-294-3P。

实施例3

a.收集细胞：接种约1x10⁴个MEF细胞，利用KOSM体系进行iPS 细胞诱导，收集MEF诱导为iPS细胞过程中从第1天到第16天每天的细 胞，冰PBS洗涤一遍。

b.提取RNA：将约1x10⁴个细胞加入1ml TRIZOL试剂(Invitrogen)， 用力振荡混匀，冰中静置15分钟。加入200μl氯仿用力震荡均匀，静置 15分钟。12000g离心15分钟，收集上清。加入等体积的异丙醇沉淀1h （-20℃），然后12000g离心，20分钟。沉淀总RNA。用75%乙醇洗涤， 干燥沉淀10分钟，用40μl无RNA酶的水溶解，测浓度，-80℃备用。

c.RNA逆转录：用All-in-One^TMmiRNA反转录试剂盒(GeneCopoeia) 对步骤b获得的RNA进行逆转录反应，具体操作依该试剂盒说明书进行： 在0.5ml离心管中加入18μl在步骤b中获得的RNA，再加入5μl逆转录 反应液，1μl PolyA聚合酶，1μl RTase mix，37℃反应1小时，85℃ 5分 钟。得到cDNA溶液。

d.PCR检测：用SYBR Green PCR检测试剂盒对步骤c的cDNA溶液 进行PCR扩增反应。上游引物：miRNA-294-3P的特异扩增的上游引物为 商品名MmiRQP0947，GeneCopoeia的引物，小RNA U6的特异扩增的上 游引物为商品名的MmiRQP9002，GeneCopoeia引物，下游通用引物为 Universal Adaptor PCR Primer（商品名：AOMD-Q050，GeneCopoeia）。在 荧光定量PCR反应管中分别加入上下游引物各1μl，cDNA溶液9μl，SYBR Green PCR反应缓冲液10μl。反应条件：95℃预变性10分钟，然后95℃ 30秒，60℃ 1分钟，共40个循环。再用荧光定量PCR仪检测，具体操 作以检测试剂盒及荧光定量PCR仪说明书进行。

通过检测不同细胞中的miRNA和小RNA U6的Ct值，就可根据公式 △Ct=Ct_miRNA-Ct_U6来计算该miRNA的△Ct值，根据△Ct值的大小就可以 判断出该miRNA的相对表达量，△Ct值小，其对应的miRNA的表达水 平高；而△Ct值大，其对应的miRNA的表达水平低。

细胞中miRNA-294-3P的相对表达量如图3所示：图中为荧光定量PCR 结果经过上述公式计算后得到的各个样品中miRNA-294-3P的相对表达 量，纵坐标为miRNA的相对表达量。可以看到：在iPS细胞诱导过程中， 细胞中的miRNA-294-3P的相对表达量随着诱导时间的增长而增高。结果 表示以诱导第1天细胞的表达量为1，其他诱导时间的表达量均为与第1 天相比而得到的相对表达量。

miRNA-294-3P（SEQ ID NO:2：AAAGUGCUUCCCUUUUGUGUGU） 为ES细胞特异表达的标记物（marker），因此在iPS细胞诱导过程中，随 着诱导时间的增长，ES细胞克隆逐渐增加，细胞中的miRNA-294-3P的相 对表达量随着诱导时间的增长而增高。与图2相比表明，细胞培养基 miRNA-294-3P的表达与所培养细胞状态的改变趋势相一致。

将上述实施例获得的PCR产物，送往中国科学院北京基因组研究所通 过Sanger测序法进行测序，结果证明所得PCR产物为目的miRNA-294-3P。

实施例4

a.收集培养基：收集过夜培养MEF、TTF、AM1-3、IP20D-3、IP36D-3、 IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A、IP14DN-5、ESC2、CL11细胞的培养基 各5ml，2000rpm离心5分钟，取上清，用0.45μm的滤器过滤。

b.提取RNA：将收集的5ml不同细胞培养基中分别加入15ml TRIZOL LS试剂(Invitrogen)，用力振荡混匀，冰中静置15分钟。加入4ml 氯仿用力震荡均匀，静置15分钟。12000g离心15分钟，收集上清。加入 等体积的异丙醇和1μl糖原沉淀1h（-20℃），然后12000g离心20分钟。 沉淀总RNA。用75%乙醇洗涤，干燥沉淀10分钟，用20μl无RNA酶的 水溶解，测浓度，-80℃备用。

c.RNA逆转录：用All-in-One^TMmiRNA反转录试剂盒(GeneCopoeia) 对步骤b获得的RNA进行逆转录反应，具体操作依该试剂盒说明书进行： 在0.5ml离心管中加入18μl在步骤b中获得的RNA，再加入5μl逆转录 反应液，1μl PolyA聚合酶，1μl RTase mix，37℃反应1小时，85℃ 5分 钟。得到cDNA溶液。

d.PCR检测：用SYBR Green PCR检测试剂盒对步骤c的cDNA溶液 进行PCR扩增反应。上游引物：所述miRNA-323-3P的特异扩增的上游引 物为商品名MmiRQP0410，GeneCopoeia的引物，小RNA U6的特异扩增 的上游引物为商品名的MmiRQP9002，GeneCopoeia引物，下游通用引物 为Universal Adaptor PCR Primer（商品名：AOMD-Q050，GeneCopoeia）。 在荧光定量PCR反应管中分别加入上下游引物各1μl，cDNA溶液9μl， SYBR Green PCR反应缓冲液10μl。反应条件：95℃预变性10分钟，然 后95℃ 30秒，60℃ 1分钟，共40个循环。再用荧光定量PCR仪检测， 具体操作以检测试剂盒及荧光定量PCR仪说明书进行。

通过检测不同细胞培养基中的miRNA和小RNA U6的△Ct值，就可 根据公式△Ct=Ct_miRNA-Ct_U6来计算该miRNA的△Ct值，根据△Ct值的大 小就可以判断出该miRNA的相对表达量，△Ct值小，其对应的miRNA 的表达水平高；而△Ct值大，其对应的miRNA的表达水平低。

miRNA-323-3P（SEQ ID NO:3：CACAUUACACGGUCGACCUCU） 的相对表达量如图4所示：图中为荧光定量PCR结果经过上述公式计算后 得到的各个细胞的培养基中miRNA-323-3P的相对表达量，纵坐标为 miRNA的相对表达量。可以看到：miRNA-323-3P是干细胞多能性标志的 标记物（marker），在多能性水平高的细胞中高表达，因此miR-323-3P在 成纤维细胞（MEF、TTF）和4N-iPS细胞（IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A、 IP14DN-5）及ES细胞（ESC2、C L11）的培养基高表达，而在2N-iPS细 胞（IP20D-3、IP36D-3）及神经前体细胞（AM1-3）的培养基表达很低或 不表达。图中，以MEF细胞培养基中的表达量为1，其他细胞的表达量均 为与MEF细胞相比而得到的相对表达量。

将上述实施例获得的PCR产物，送往中国科学院北京基因组研究所所 通过Sanger测序法进行测序，结果证明所得PCR产物为目的 miRNA-323-3P。

实施例5

a.收集细胞：收集MEF、TTF、AM1-3、IP20D-3、IP36D-3、IP14D-1、 IP14D-6、IP16DT-2A、IP14DN-5、ESC2和CL11细胞各约1x10⁶个，冰 PBS洗涤一遍。

b.提取RNA：将不同细胞中分别加入1ml TRIZOL试剂(Invitrogen)， 用力振荡混匀，冰中静置15分钟。加入200μl氯仿用力震荡均匀，静置 15分钟。12000g离心15分钟，收集上清。加入等体积的异丙醇沉淀1h （-20℃），然后12000g离心20分钟。沉淀总RNA。用75%乙醇洗涤， 干燥沉淀10分钟，用40μl无RNA酶的水溶解，测浓度，-80℃备用。

c.RNA逆转录：用All-in-One^TMmiRNA反转录试剂盒(GeneCopoeia) 对步骤b获得的RNA进行逆转录反应，具体操作依该试剂盒说明书进行： 在0.5ml离心管中加入18μl在步骤b中获得的RNA，再加入5μl逆转录 反应液，1μl PolyA聚合酶，1μl RTase mix，37℃反应1小时，85℃ 5分 钟。得到cDNA溶液。

d.PCR检测：用SYBR Green PCR检测试剂盒对步骤c的cDNA溶液 进行PCR扩增反应。扩增的上游引物为miRNA-323-3P和U6特异扩增的 上游引物，miRNA-323-3P的上游引物为商品名MmiRQP0410， GeneCopoeia的引物，小RNA U6的特异扩增的上游引物为商品名 MmiRQP9002，GeneCopoeia的引物，下游通用引物为Universal Adaptor  PCR Primer（商品名：AOMD-Q050，GeneCopoeia）。在荧光定量PCR反 应管中分别加入上下游引物各1μl，cDNA溶液9μl，SYBR Green PCR反 应缓冲液10μl。反应条件：95℃预变性10分钟，然后95℃ 30秒，60℃ 1 分钟，共40个循环。再用荧光定量PCR仪检测，具体操作以检测试剂盒 及荧光定量PCR仪说明书进行。

通过检测不同细胞中的miRNA和小RNA U6的Ct值，就可根据公式 △Ct=Ct_miRNA-Ct_U6来计算该miRNA的△Ct值，根据△Ct值的大小就可以 判断出该miRNA的相对表达量，△Ct值小，其对应的miRNA的表达水 平高；而△Ct值大，其对应的miRNA的表达水平低。

在各个细胞中miRNA-323-3P（SEQ ID NO:3： CACAUUACACGGUCGACCUCU）的相对表达量如图5所示：图中为荧 光定量PCR结果经过上述公式计算后得到的各个细胞中miRNA-323-3P的 相对表达量，纵坐标为miRNA的相对表达量。可以看到：miRNA-323-3P 在成纤维细胞（MEF、TTF）和4N-iPS细胞（IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A、 IP14DN-5）及ES细胞（ESC2、CL11）高表达，而在2N-iPS细胞（IP20D-3、 IP36D-3）及神经前体细胞（AM1-3）表达很低或不表达。与相应细胞培养 基中的表达趋势一致，图中以MEF细胞中的表达量为1，其他细胞的表达 量均为与MEF细胞相比而得到的相对表达量。

将上述实施例获得的PCR产物，送往中国科学院北京基因组研究所通 过Sanger测序法进行测序，结果证明所得PCR产物为目的miRNA-323-3P。

实施例6

a.收集培养基：收集过夜培养人乳腺癌细胞系MCF-7培养基5ml， 2000rpm离心5分钟，取上清，用0.45μm的滤器过滤。

b.提取RNA：将收集的5ml培养基中加入15ml TRIZOL LS试剂 (Invitrogen)，用力振荡混匀，冰中静置15分钟。加入4ml氯仿用力震荡 均匀，静置15分钟。12000g离心15分钟，收集上清。加入等体积的异 丙醇和1μl糖原沉淀1h（-20℃），然后12000g离心20分钟。沉淀总RNA。 用75%乙醇洗涤，干燥沉淀10分钟，用20μl无RNA酶的水溶解，测浓 度，-80℃备用。

c.RNA逆转录：用All-in-One^TMmiRNA反转录试剂盒(GeneCopoeia) 对步骤b获得的RNA进行逆转录反应，具体操作依该试剂盒说明书进行： 在0.5ml离心管中加入18μl在步骤b中获得的RNA，再加入5μl逆转录 反应液，1μl PolyA聚合酶，1μl RTase mix，37℃反应1小时，85℃ 5分 钟。得到cDNA溶液。

d.PCR检测：用SYBR Green PCR检测试剂盒对步骤c的cDNA溶液 进行PCR扩增反应。上游引物：所述miRNA-21-5P的特异扩增的上游引 物为商品名为HmiRQP0316，GeneCopoeia的引物，小RNA U6的特异扩 增的上游引物为商品名MmiRQP9002，GeneCopoeia的引物，下游通用引 物为Universal Adaptor PCR Primer（商品名：AOMD-Q050，GeneCopoeia）。 在荧光定量PCR反应管中分别加入上下游引物各1μl，cDNA溶液9μl， SYBR Green PCR反应缓冲液10μl。反应条件：95℃预变性10分钟，然 后95℃ 30秒，60℃ 1分钟，共40个循环。再用荧光定量PCR仪检测， 具体操作以检测试剂盒及荧光定量PCR仪说明书进行，分三次平行扩增人 乳腺癌细胞MCF-7细胞培养基。

通过检测细胞培养基中的miRNA和小RNA U6的△Ct值，就可根据 公式△Ct=Ct_miRNA-Ct_U6来计算该miRNA的△Ct值，根据△Ct值的大小就 可以判断出该miRNA的相对表达量，△Ct值小，其对应的miRNA的表 达水平高；而△Ct值大，其对应的miRNA的表达水平低。

miRNA-21-5P（SEQ ID NO:4：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA） 的扩增结果如图6所示：图中为人乳腺癌细胞MCF-7培养基三次平行扩 增miRNA-21-5P的扩增曲线，从扩增曲线可以得到三次平行扩增的Ct值 分别为：27.01，26.98，27.35。以上结果说明：人乳腺癌细胞MCF-7细胞 培养基中存在miRNA，并且本检测方法存在一致性。

将上述实施例获得的PCR产物，送往中国科学院北京基因组研究所通 过Sanger测序法进行测序，结果证明所得PCR产物为目的miRNA-21-5P。

本发明涉及由本方法检测到ES细胞特异高表达的标记物（marker） —miRNA-292-3P和miRNA-294-3P以及Dlk1-Dio3印迹区的微小RNA— miRNA-323-3P，其中Dlk1-Dio3印迹区中的微小RNA在2N-iPS细胞中表 达低而在4N-iPS细胞中表达高。在我们的结果中可以看到：1.在MEF诱 导为iPS细胞的过程中，MEF为成纤维细胞，不表达ES细胞特异表达的 miRNA-294-3P，而随着诱导时间的增加，ES细胞越来越多，miRNA-294-3P 表达逐渐上升，第一时间观察到了细胞命运的转换。2.miRNA-323-3P在 成纤维细胞（MEF、TTF），4N-iPS细胞（IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A、 IP14DN-5）及ES细胞（ESC2、CL11）中高表达，而在2N-iPS细胞（IP20D-3、 IP36D-3）及神经前体细胞（AM1-3）中表达很低或不表达。可以通过检测 培养基中miRNA的表达鉴定细胞的多能性水平。3.在人的细胞培养基中 也可以检测到miRNA，说明本方法适用于多种属，为以后本方法应用于 利用ES与iPS细胞进行临床治疗前细胞性质检测、转分化来源的细胞性 质检测、临床对IVF胚胎植入前发育潜能的检测以及其它需要无损伤确定 细胞状态的应用提供了很好的基础。通过本发明的方法首次检测到细胞培 养基中的miRNA且证明培养基中的miRNA的表达趋势与所培养细胞中 miRNA的表达趋势一致。首次证明可以通过检测培养基中miRNA的表达 鉴定细胞的类型与状态，从而避免对细胞的破坏，尤其适用于细胞数量有 限的基础研究与临床方面的应用。总之，本发明首次采用无损伤性的方法 检测细胞在不同类型和状态下miRNA的表达水平，可为动态的无创性鉴 定细胞类型和特性与观察细胞命运的转换提供了新的思路。