一种共表达L-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌

摘要

本发明公开了一种共表达L-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌。该菌株包含SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。本发明的基因工程菌可以通过催化L-阿拉伯糖生产L-核糖，一步转化，工艺简单，转化率高，通过本发明的基因工程菌，L-核糖的转化率达到25~50%，具有良好的产业化前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种共表达L-阿拉伯糖异构酶基因和甘露 糖-6-磷酸异构酶基因的基因工程菌构建及其应用。

背景技术

核糖（Ribose，C₅H₁₀O₅）是一种典型的五碳糖，是各种核糖核酸(RNA)、核苷酸辅 酶、以及ATP、NADP的组成成分，与生物遗传的关系密切，对生物体的生理活性具有 重要的调控作用。自然界中的核糖主要以D-核糖形态存在，D-核糖以呋喃糖型广泛存 在于植物和动物细胞中，D-核糖也是多种维生素、辅酶以及某些抗生素，如新霉素A、 B和巴龙霉素的成分；L-核糖是与D-核糖相对的手性对映异构体，在自然界和生物体内 并不存在，是极为昂贵的稀有糖类。纯净的L-核糖是白色晶体或白色晶体粉末，带有甜 味；可溶于水、乙醇、甲醇、不溶于乙醚、苯和丙酮。L-核糖具有良好的抗肿瘤抗病毒 能力且对正常细胞的毒副作用很小。L-核糖是重要的药物合成中间体，广泛用于合成具 有抗病毒活性的核苷类化合物，在抗艾滋病、抗病毒中间体方面显示强大的潜能。L-核 糖经还原脱氧水解等加工还可生产2-脱氧-L-核糖，该中间体与腺嘌呤等有机碱形成的 核苷衍生物在癌症、乙肝、丙肝等疾病的治疗方面也具有很大的应用潜能。

随着L-核糖应用面的不断扩大，全球L-核糖的需求量逐年增加，人们对制备和开 发适应工业化生产L-核糖方法的兴趣日益浓厚。随着L-核糖应用面的不断扩大，全球 L-核糖的需求量逐年增加，人们对制备和开发适应工业化生产L-核糖方法的兴趣日益浓 厚。

尽管目前采用化学法合成L-核糖，在合成步骤与收率等方面均有了较大的提高，但 仍存在合成工艺路线复杂，反应步骤繁琐，试剂昂贵，总收率低，需使用大量有机溶剂 和产生有害的副产物等问题，难以适应工业化生产的要求。通过微生物或酶进行生物转 化生产L-核糖已成为国内外研究热点，生物转化合成L-核糖具有立体选择性好、反应 条件温和、污染少等特点。根据原料不同可分为两类：以核糖醇为原料和以L-阿拉伯糖 为原料，其中值得提到的是近年来研究较多的以L-阿拉伯糖为原料转化为L-核糖需要 二步催化,很多研究人员致力于将L-阿拉伯糖异构酶和甘露糖-6-磷酸异构酶两种酶作 为一个酶催化体系,实现两种酶一步催化L-阿拉伯糖生产L-核糖。

随着基因工程技术的迅速发展，利用分子克隆和外源表达技术可以大幅度地提高某 种工业酶在宿主微生物中的表达量，通过这种方法构建的基因工程菌株具有普通微生物 难以企及的酶催化效率；利用共表达基因工程菌株生产L-核糖的工艺在国内尚没有报 道，本发明选择自筛的发酵乳杆菌和嗜热栖热菌作为分子生物学操作的出发菌株，通过 PCR技术从该菌株的基因组上扩增得到了L-阿拉伯糖异构酶的编码基因araA和甘露糖 -6-磷酸异构酶的编码基因manA，利用大肠杆菌作为宿主，成功构建了能够高效共表达 L-阿拉伯糖异构酶和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种生产过程简单、条件适宜，能大幅度降低生 产成本的基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题，是提供上述基因工程菌的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种外源共表达L-阿拉伯糖异构酶和甘露糖-6-磷酸异构酶基因工程菌，其特征在 于，其为导入了核苷酸序列SEQ ID NO：1（L-阿拉伯糖异构酶的基因序列，araA）和 核苷酸序列SEQ ID NO：2（甘露糖-6-磷酸异构酶的基因序列，manA）的重组大肠杆菌。

上述基因工程菌的构建方法，它包括以下步骤：

（1）含有L-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶基因的表达载体的构建：

根据Genbank公布的来源于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum，保藏号： CGMCC2921)和嗜热栖热菌(Thermus thermophilus HB8,ATCC27634)的L-阿拉伯糖异构 酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶基因的序列，运用Vector NTI软件设计下述引物：

araA-up：5’GGAATTCCATATGCGTAAGATGCAAG3’；

araA-down：5’GCGGTACCCTACTTGATGTTGAT3’；

manA-up：5’ATATATCCATGGGTGGGGCCCCGGGTA3’；

manA-down：5’AGAATTCTCACGCCCCCTCCTT3’；

分别提取处于对数生长期的发酵乳杆菌基因组DNA和嗜热栖热菌基因组DNA作 为模板，进行PCR扩增，分别得到L-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶基因 的PCR扩增产物；回收所述L-阿拉伯糖异构酶基因和所述甘露糖-6-磷酸异构酶基因的 PCR扩增产物，将L-阿拉伯糖异构酶基因经限制性内切酶Nde I和Kpn I双酶切，与经 过同样双酶切的质粒pETDuet-01在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒 pETDuet-araA；将重组质粒pETDuet-araA转化至感受态大肠杆菌BL21（DE3）中，涂 布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养12～16h得到单克隆；

（2）经抗性培养基筛选得到阳性克隆：

分别挑取单克隆于5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、 200rpm培养过夜，获得L-阿拉伯糖异构酶基因工程菌；

（3）对L-阿拉伯糖异构酶基因工程菌进行质粒提取：

对（1）中回收的甘露糖-6-磷酸异构酶基因用限制性内切酶Nco I和EcoR I双酶切， 再与经过同样双酶切的质粒pETDuet-araA在T4连接酶的作用下进行连接，得到共表达 质粒pETDuet-araA-manA；

（4）将共表达质粒pETDuet-araA-manA转化至宿主细胞中：

将共表达质粒pETDuet-araA-manA转化至感受态大肠杆菌BL21（DE3）中，涂布 含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养12～16h得到单克隆；

（5）经抗性培养基筛选得到阳性克隆：

分别挑取单克隆于5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、 200rpm培养过夜，获得共表达L-阿拉伯糖异构酶和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌。

其中，PCR扩增体系为：基因组DNA2μL，araA-up/manA-up和araA-down /manAdown各2μL，dNTP4μL，10×Taq缓冲液5μL，Taq酶1μL，ddH₂O34μL；

PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，然后55℃退火30s，72℃ 延伸2min，循环35次；最后72℃延伸10min。

上述的基因工程菌在制备L-核糖中的应用。

利用上述基因工程菌，以L-阿拉伯糖为底物制备L-核糖的工艺如下：

（1）基因工程菌的诱变表达：将所述基因工程菌接种于LB液体培养基中培养过夜， 然后以0.5～10%(v/v)的接种量转接入LB培养基中，20～40℃发酵培养1～3h，再加入终 浓度0.1～10g/L的乳糖或终浓度0.1～1.5mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，并置于 20～40℃下诱导表达3～48h，离心收集菌体；

或者将所述基因工程菌接种于LB液体培养基中培养过夜，然后以0.5～10%(v/v)的 接种量转接入发酵培养基中，直接于20～40℃下诱导表达3～48h，离心收集菌体，其中， 所述的发酵培养基包含质量比2:1:2的乳糖、蛋白胨或酵母粉和NaCl，pH值为4～10， 经高压湿热灭菌处理；

（2）转化反应：以25～100g/L L-阿拉伯糖为底物，加入（1）中诱导后的基因工程 菌进行转化反应，用量以湿菌计为10～100g/L，pH值为5～12，反应温度40～80℃，转 化时间12～48h，反应结束后，液相检测L-核糖的含量；

或者，以25～100g/L L-阿拉伯糖为底物，加入1～15mmol/L Mn²⁺离子和0.2～5mmol/L  Co²⁺离子，然后加入（1）中诱导后的基因工程菌进行转化反应，用量以湿菌计为 10～100g/L，pH值为5～12，反应温度40～80℃，转化时间12～48h，反应结束后，液相 检测L-核糖的含量。

上述的LB培养基包含质量比2:1:2的蛋白胨、酵母粉和NaCl。

有益效果：本发明的L-阿拉伯糖异构酶和甘露糖-6-磷酸异构酶共表达基因工程菌 在适宜条件下可以通过催化L-阿拉伯糖生产L-核糖，一步转化，节约反应时间，转化 率高，通过本发明的基因工程菌，L-核糖的转化率达到25～60%，具有良好的产业化前 景，低浓度Mn²⁺和Co²⁺离子的添加可以大幅度提高酶的酶活力，添加1～15mmol/L Mn²⁺离子和0.2～5mmol/L Fe²⁺离子后比不添加金属离子的对照组酶活提高58%。

附图说明

图1araA产物PCR的琼脂糖凝胶电泳验证，泳道1～2为araA产物PCR，3为标准 DNA分子量，自上而下的条带分别为（kb）：15.0，10.0，7.5，5.0，2.5，1.0。

图2manA产物PCR的琼脂糖凝胶电泳验证，泳道1为标准DNA分子量，自上而 下的条带分别为（kb）：15.0，10.0，7.5，5.0，2.5，1.0，泳道2～3为manA产物PCR。

图3重组质粒pETDuet-araA核酸胶验证，其中泳道1～4为重组质粒1～4号对araA 的PCR产物，泳道5为标准DNA分子量，自上而下的条带分别为（kb）：15.0，10.0， 7.5，5.0，2.5，1.0。泳道6为空质粒pETDuet-01的Nde I单切产物，泳道7～10为重组 质粒1～4号的Nde I单切产物。

图4共表达质粒pETDuet-araA-manA的构建示意图。

图5共表达质粒pETDuet-araA-manA的PCR验证泳道1～6为共表达质粒1～6号对 araA的PCR产物，泳道7～12为共表达质粒1～6对manA的PCR产物，泳道13为标准 DNA分子量，自上而下的条带分别为（kb）：15.0，10.0，7.5，5.0，2.5，1.0。

图6共表达质粒pETDuet-araA-manA的双酶切验证，泳道1为标准DNA分子量， 自上而下的条带分别为（kb）：15.0，10.0，7.5，5.0，2.5，1.0。泳道2～3分别为共表达 质粒2号的Nde I和Kpn I，Nco I和EcoR I双切产物，泳道4～5分别为共表达质粒3号 的Nde I和Kpn I，Nco I和EcoR I双切产物。

图7L-阿拉伯糖异构酶和甘露糖-6-磷酸异构酶共表达菌株诱导表达SDS-PAGE图， 泳道M为标准蛋白分子量，泳道1～2分别为共表达菌株上清和全细胞。

图8产物混合样的液相检测图谱。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的 本发明。

实施例1：含有L-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶基因的共表达质粒载体的 构建。

根据Genbank上已报道的来源于发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum，保藏号： CGMCC2921）和嗜热栖热菌（Thermus thermophilus HB8,ATCC27634）的L-阿拉伯糖 异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶基因的序列，运用Vector NTI软件设计引物，引物序 列如表1所示：

表1 引物序列

按照生产商提供的使用说明书，用Genomic DNA Purification Kit（Takara，大连） 抽提处于对数生长期的发酵乳杆菌NXTag1（Lactobacillus fermentum，保藏号： CGMCC2921，其公开于专利文献ZL200910025982.9）和嗜热栖热菌（Thermus  thermophilus，HB8,ATCC27634）的基因组DNA，并用1%（10g/L）琼脂糖凝胶电泳 对所获得的基因组DNA进行检测，分别以提取的发酵乳杆菌基因组DNA和嗜热栖热 菌基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。

PCR（聚合酶链式反应）的扩增体系为：基因组DNA2μL，引物araA-up(manA-up） 和引物araA-down(manAdown)各2μL，dNTP4μL，10×Taq缓冲液5μL，Taq酶1μL， ddH₂O34μL；

PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，然后55℃退火30s，72℃ 延伸2min，循环35次；最后72℃延伸10min；

将PCR产物于1%（10g/L）琼脂糖凝胶电泳验证，结果见图1和图2。发现分别 与预期分子量（1424bp和900bp）大小相符的DNA条带后分别用Axygen公司的柱式 割胶回收试剂盒回收。

用预先设计在引物序列中酶切位点所对应的限制性内切酶对（2）中获得的PCR产 物araA进行酶切反应。所用的限制性内切酶是EcoRI和Hind III。酶切体系为：PCR产 物12.5μL，Nde I1μL，Kpn I1μL，10×M缓冲液2.5μL，ddH₂O8μL，总体积25μL。 将酶切后的PCR产物经过DNA纯化试剂盒纯化。

使用同样的限制性内切酶和酶切体系对pETDuet-01质粒进行酶切，由于所选用的 两个酶切位点在pETDuet-01质粒的多克隆位点（Multiple Cloning Site,MCS）上相距很 近（约20bp），因此酶切之后的质粒只需要经过DNA纯化试剂盒即可达到纯化的目的。

将经过纯化的PCR产物和pETDuet-01质粒进行连接。连接反应体系为：酶切纯化 的PCR产物6μL，酶切纯化的pETDuet-01质粒2μL，T4连接酶1μL，10×T4连接酶 缓冲液1μL。在37℃连接2h后即可获得重组质粒pETDuet-araA。

重组质粒pETDuet-araA转化感受态大肠杆菌细胞使用氯化钙法：

(1)取10μL重组质粒pETDuet-araA于50μL大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 感受态细胞中，冰浴30min。

(2)42℃水浴热激90s，快速置于冰上2～3min。

(3)加入新鲜LB液体培养基800μL，于37℃振荡培养45min。

(4)取200μL菌体涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基表面。37℃ 培养12～16h至单菌落出现。

重组子pETDuet-araA的鉴定：将单菌落接种于含有氨苄青霉素（100μg/mL）的 LB液体培养基中37℃过夜培养并分别提取质粒，对各质粒进行菌落PCR验证，再按 照“限制性酶切反应，纯化及连接反应”中的酶切体系和条件用Nde I对空质粒 pETDuet-01和重组质粒pETDuet-araA分别进行单酶切，将菌落PCR产物和酶切产物进 行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图3所示。实验结果说明获得的重组质粒pETDuet-araA 是正确的。

经电泳结果证实，该阳性克隆菌落含有DNA片段插入质粒pETDuet-araA，含此重 组质粒pETDuet-araA的重组大肠杆菌即为转化的重组大肠杆菌BL21-araA。测序结果 显示插入片段含有一个长1424bp的开放阅读框架（Open Reading Frame，ORF）。

manA基因的限制性酶切反应，纯化及连接反应：用预先设计在引物序列中酶切位点所 对应的限制性内切酶对获得的PCR产物manA和重组质粒pETDuet-araA进行酶切反应。 所用的限制性内切酶是Nco I和EcoR I。酶切体系为：PCR产物12.5μL，Nco I1μL， EcoR I1μL，10×M缓冲液2.5μL，ddH₂O8μL，总体积25μL。将酶切后的PCR产物 和重组质粒经过DNA纯化试剂盒纯化。

将经过纯化的PCR产物和pETDuet-araA重组质粒进行连接。连接反应体系为：酶 切纯化的PCR产物5μL，酶切纯化的pETDuet-araA质粒3μL，T4连接酶1μL，10×T4 连接酶缓冲液1μL。在37℃连接2h后即可获得共表达质粒pETDuet-araA-manA，其 主要结构如图4所示。

共表达质粒pETDuet-araA-manA转化感受态大肠杆菌细胞使用氯化钙法，方法同上 述重组质粒pETDuet-araA转化感受态大肠杆菌细胞使用的氯化钙法。

重组子pETDuet-araA-lacZ的鉴定：将单菌落接种于含有氨苄青霉素（100μg/mL） 的LB液体培养基中37℃过夜培养并分别提取质粒，对各质粒进行菌落PCR验证，再 按照上述的限制性酶切、纯化及连接反应中的酶切体系和条件分别用Nde I和KpnI，NcoI 和EcoRI对共表达质粒pETDuet-araA-manA进行双酶切，将菌落PCR产物和双酶切产 物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定结果见图5和图6，实验结果说明获得的共表达质粒 pETDuet-araA-manA3号是正确的。

经电泳结果证实，如图5和图6所示，该阳性克隆菌落含有DNA片段插入质粒 pETDuet-araA-manA，含此共表达质粒pETDuet-araA-manA的重组大肠杆菌即为转化的 重组大肠杆菌BL21-araA-manA。测序结果显示插入片段含有一个长1424bp的开放阅读 框架（Open Reading Frame，ORF）和一个长900bp的开放阅读框架。

实施例2：基因工程菌的诱导表达。

采用两种方式对实施例1中获得的基因工程菌诱导表达：

（1）配制种子液1L，培养基为LB液体培养基（蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、 NaCl10g/L，经121℃高压湿热灭菌30min后装入数个500mL广口三角瓶中。用接种 针向种子液接入一环实施例1中基因工程菌菌种，并置于37℃摇床以200rpm的转速 过夜培养。配制含有蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L的LB培养基1000mL， 分装于容量500mL的广口三角瓶中，每瓶的装液量为100mL；将上述LB培养基于 121℃高压湿热灭菌30min。待培养基冷却后接入过夜培养的种子液1mL，将三角瓶置 于37℃摇床以200rpm的转速培养，约1.5h后加入终浓度为0.1～10g/L的乳糖或者终 浓度为1mM的IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷），并置于37℃摇床以200rpm 转速进行诱导作用6h，得到共表达基因工程菌发酵液A，发酵液离心收集得到共表达 基因工程菌菌体A。

（2）配制种子液1L，培养基为LB液体培养基（蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10 g/L，用NaOH调节pH值为7.0），经121℃高压湿热灭菌30min后装入数个500mL 广口三角瓶中。用接种针向种子液接入一环基因工程菌菌种，并置于37℃摇床以200 rpm的转速过夜培养。配制含有乳糖10g/L、蛋白胨（或酵母粉）5g/L、氯化钠10g/L 的发酵培养基1000mL，分装于容量500mL的广口三角瓶中，每瓶的装液量为100mL； 将上述发酵培养基于121℃高压湿热灭菌30min。待培养基冷却后接入过夜培养的种子 液1mL，将三角瓶置于25℃摇床以200rpm的转速培养，乳糖既作碳源又作为诱导剂， 进行诱导作用22h，得到共表达基因工程菌发酵液B。发酵液离心收集，得到共表达基 因工程菌菌体B，通过SDS-PAGE检测，结果如图7所示。

实施例3：金属离子种类及浓度对共表达L-阿拉伯糖异构酶和甘露糖-6-磷酸异构酶基因 工程菌株酶活的影响。

向1mL100mM磷酸钠缓冲溶液（pH6.5）中添加L-阿拉伯糖至终浓度为100mM， 再加入共表达基因工程菌菌体12mg，各金属离子的添加终浓度为1mM或者10mM，65℃ 水浴20min，通过HPLC测定生成的L-核糖的生成量，测定结果如表2所示（以未添加 金属离子组为对照，设定酶活为100%）。

表2 不同金属离子及浓度对共表达基因工程菌株酶活力的影响

从结果中可以看出，当Co²⁺浓度为1mM、Mn²⁺浓度为10mM时酶活较高，固在用 共表达基因工程菌制备L-核糖时添加离子浓度为Co²⁺1mM、Mn²⁺10mM。

实施例4：利用共表达基因工程菌制备L-核糖（不加金属离子）。

取1.2g离心收集的共表达基因工程菌菌体A投入到100mM pH6.5磷酸钠缓冲配置 的30g/L L-阿拉伯糖进行催化反应，反应条件是温度65℃，摇床转速180rpm。每4小 时取样，测定生成的L-核糖含量，29h后反应结束。HPLC检测L-核糖的转化率达到17%。

实施例5：利用共表达基因工程菌制备L-核糖（加金属离子）。

取1.2g离心收集的共表达基因工程菌菌体B，将收集的菌体投入100mM pH6.5磷 酸钠缓冲配置的30g/L L-阿拉伯糖进行催化反应，反应条件是温度50℃，添加10mM  Mn²⁺和1mM Co²⁺，摇床转速180rpm。每4小时取样，测定生成的L-核糖含量，29h 后反应结束。经HPLC检测L-核糖的转化率达到32%。

实施例6：

利用共表达基因工程菌制备L-核糖，方法同实施例5，不同的是，共表达基因工程 菌菌体B用量为3.6g，底物L-阿拉伯糖的浓度为60g/L，反应温度为65℃，反应时间 为24h。经HPLC检测L-核糖的转化率达到43%，如图8所示。

实施例7：

利用共表达基因工程菌制备L-核糖，方法同实施例5，不同的是，取3.6g离心收集 的共表达基因工程菌菌体A，底物L-阿拉伯糖的浓度为100g/L。经HPLC检测L-核糖 的转化率达到28%。

实施例8：

利用共表达基因工程菌制备L-核糖，方法同实施例5，不同的是，反应温度为65℃， 反应时间为25h。经HPLC检测L-核糖的转化率达到36%。

实施例9：利用共表达基因工程菌制备L-核糖，方法同实施例5，不同的是，底物L-阿 拉伯糖的浓度为100g/L，反应时间为36h。经HPLC检测L-核糖的转化率达到18%。

实施例10：

利用共表达基因工程菌制备L-核糖，方法同实施例5，不同的是，所用的菌体为共 表达基因工程菌体A，反应时间为30h，HPLC检测L-核糖的转化率达到21%。

实施例11：

利用共表达基因工程菌制备L-核糖，方法同实施例5，不同的是，所用的菌体为共 表达基因工程菌体A，菌体量为3.6g，反应时间为28h，HPLC检测L-核糖的转化率达 到25%。