大肠杆菌DH10B甘露糖-6-磷酸异构酶表达与功能鉴定及转cry3A基因马铃薯抗性表达分析

摘要

甘露糖-6-磷酸异构酶（Mannose-6-phosphate isomerase，PMI）可催化D-甘露糖-6-磷酸醛糖异构化为D-果糖-6-磷酸酮糖。目前PMI在转基因植物中做为筛选标记已经越来越多地被应用，对转基因植物的发展起着重要作用。其作用原理是因为大多数植物中不含pmi基因，所以不能利用甘露糖作为碳源，如果使其转变成为果糖，就可以被植物生长代谢所利用。一些实验室从微生物中获得pmi基因转入植物中，植株可在只含有甘露糖做为碳源的培养基上进行生长和代谢;非转基因植株则不能生长，最后死亡。因此，寻求不同来源pmi基因并筛选出做为选择标记基因进行高效利用是当前转基因植物的任务之一。
　　本论文根据NCBI数据库给出的pmi基因组序列(1200bp; Genbank accessionno.CP000948)，设计出两对分别供原核表达载体构建和真核表达载体构建的特异引物，用PCR方法从大肠杆菌DH10B中克隆出pmi基因。pmi基因构建到原核表达载体pET-23b中，经诱导表达出46kD大小条带。经镍柱纯化和Western检测证实表达的蛋白为PMI目的蛋白。在蛋白纯化过程中，我们对裂解液和洗柱液中咪唑浓度进行优化，结果发现咪唑浓度分别为20mM和40mM的裂解液和洗柱液对目的蛋白挂柱的特异性要高于咪唑浓度为10mM和20mM的裂解液和洗柱液。
　　利用果糖可与盐酸和间苯二酚的显色反应来鉴定PMI酶的活性。我们把诱导并经过纯化的PMI蛋白加入到甘露糖-6-磷酸标准液中进行体外催化反应，反应得到果糖在进行显色反应，结果表明此蛋白具有高的催化活性。
　　我们先将pmi基因构建到中间载体pD513上，然后再将由CaMV35S启动予驱动的表达框插入到真核表达载体pCAMBIA2301上。通过农杆菌介导法，利用甘露糖作筛选剂，将pmi基因导入烟草中。这些结果暗示我们克隆的pmi基因具有较高的酶催化活性，并可以直接作为高效的筛选标记应用于转基因植物。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 PMI相关研究进展

1．1 转基因植物标记基因研究进展

1．2 果糖检测方法

1．3 蛋白纯化方法

1．4 植物遗传转化方法

2 马铃薯抗虫转基因研究进展

2．1 苏云金芽孢杆菌晶体蛋白基因及应用

2．2 蛋白酶抑制剂基因及应用

2．3 植物凝集素基因及其转基因植物的研究

2．4 RNAi抗虫转基因研究

2．5 抗虫转基因马铃薯研究及应用前景

第二章 大肠杆菌DH10B甘露糖-6-磷酸异构酶基因(manA／pmi)的克隆、表达及功能鉴定

2．1 材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 主要仪器及试剂

2．1．3 抗生素

2．1．4 培养基

2．1．5 质粒提取液

2．1．6 蛋白胶试剂及缓冲液

2．1．7 蛋白纯化试剂

2．1．8 Western相关试剂

2．2 方法

2．2．1 pmi基因的克隆及原核表达载体构建

2．2．2 PMI原核表达分析及体外功能检测

2．2．3 pmi基因烟草转化及表达分析

2．3 结果

2．3．1 pmi基因的克隆

2．3．2 pmi基因原核表达载体和真核表达载体的构建

2．3．3 pmi基因原核表达及Western Blot分析

2．3．4 pmi基因体外活性检测

2．3．5 转基因烟草表达分析

2．4 讨论

2．4．1 关于PMI蛋白纯化优化

2．4．2 关于酶促反应鉴定

2．4．3 关于pmi基因的重要性

第三章 转cry3A基因马铃薯的外源蛋白表达和对马铃薯甲虫抗性分析

3．1 材料和方法

3．1．1 材料

3．1．2 ELISA检测方法

3．1．3 叶片离体饲喂马铃薯甲虫实验和田间抗性调查

3．2 结果

3．2．1 转基因马铃薯株系的Cry3A表达量分析

3．2．2 转基因马铃薯的抗虫性分析和产量评价

3．3 讨论

参考文献

硕士期间发表的论文

致谢

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