快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法

摘要

本发明公开了一种快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，该方法是待小孢子胚状体产生时，将其转到2000lx、25℃、60r/min摇床上振荡培养，3～7d后将转绿的子叶型胚转移到含蔗糖2.5%，琼脂粉1%的B5固体培养基上继续培养获得再生芽；15～20d后，转入含10%椰汁，3%蔗糖，0.78%琼脂粉的MS固体培养基中，20～30d后大多数植株长成健壮且生根的幼苗，可驯化移栽，培养条件都为90uE/m2/s、12hr/d、25℃。再生植株平均成苗率达83.5%。本发明有效解决小孢子胚易褐化、玻璃化的问题；有效缩短利用游离小孢子培养获得DH株系的时间；不需添加任何激素，更安全。

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，属于植物 组织培养技术领域。

背景技术

芸薹属蔬菜属于异花授粉植物，杂种优势明显，在育种上获得一个纯系需要5～7年的 时间，而游离小孢子培养可以在1～2年获得双单倍体植株，大大节省纯化时间和工作量。 同时由于再生群体中单倍体的存在也有利于隐性性状的表达，丰富了育种资源。此外，游 离小孢子属于单细胞，应用于诱变育种、突变体筛选和基因转化等有其特殊的优势，自发 或人工加倍获得的DH群体更是进行分子标记和绘制基因图谱的理想材料。

游离小孢子培养技术，是由Lichter(1982)在甘蓝型油菜上首创的单细胞培养技术，随 后加拿大、德国等国家相继开展了此项研究工作，提高了小孢子的胚诱导频率，于20世 纪80年代末初步建立了甘蓝型油菜的小孢子培养体系。此后小孢子培养技术在芸薹属不 同蔬菜中得到了迅速发展，创造了从花蕾机械分离小孢子的方法，确立了可提高诱导率的 花蕾标准并将热激处理用于培养，并在芥菜、结球甘蓝、花椰菜、青花菜、大白菜等作物 上获得成功。我国在游离小孢子培养方面的研究起步较晚，主要是借鉴国外的经验，但发 展迅速。20世纪90年代，曹鸣庆等(1993)、陈玉萍等(1998)和严准等(1999)分别首次在不 结球白菜、紫菜薹和球茎甘蓝等作物的游离小孢子培养上获得成功。2003年，朱允华等(2003) 首次报道菜心游离小孢子培养成功。此外芸薹属蔬菜中青花菜、芥蓝、花椰菜也先后获得 了小孢子再生植株。

但前人的研究主要聚焦在高效诱导胚状体的产生方面，对小孢子胚再生植株频率的研 究甚少，而且缺乏深入的研究。但对于育种工作者来说，小孢子植株远比小孢子胚更具有 实际意义。因此，如何获得高频率的小孢子再生植株非常关键，也是目前获得小孢子再生 植株群体（DH）的主要限制因素。刘凡等（1997）的研究发现，小孢子胚能否顺利发育成 植株，受内外两种因素的限制。小孢子胚在分化、继代培养过程中存在着褐化、玻璃化等 现象，直接影响小孢子植株的再生率，因此本发明旨在建立稳定高频的不结球白菜和青花 菜游离小孢子培养再生植株体系。

发明内容

本发明目的在于针对上述现有技术中获得游离小孢子再生植株存在的成苗效率低的 问题，提供一种快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，该方法包括如下步 骤：

(1)花蕾的选择、预处理和灭菌：在初花期和盛花期，选取发育时期为单核靠边期的花 蕾；将花蕾保湿并置于冰箱中冷藏静置24h后灭菌；

(2)小孢子分离与纯化：向灭菌后的花蕾中加入B5-13液体培养基，采用挤压法使小孢 子游离出来，然后过滤，收集滤液，离心，弃上清液，得到纯化后的小孢子；所述的花蕾 与B5-13液体培养基的比例为每28-32个花蕾中加入1～2ml的B5-13液体培养基。

(3)培养液的分装、热激诱导：将纯化后的小孢子用含有13%蔗糖的1/2NLN液体培养 基重新悬浮，然后分装，小孢子密度1蕾/ml，封口后、热激诱导；

(4)胚状体形成：将热激后的小孢子悬浮液于25℃黑暗静置培养，2～3周后出现肉眼可 见的胚状体；

(5)振荡培养：将上述胚状体转到2000lx、25℃、60r/min摇床上振荡培养；

(6)诱导再生植株：振荡培养3～7d后将转绿的子叶型胚转移到含蔗糖2.5%，琼脂1%的 B5固体培养基上继续培养获得再生芽，15～20d后，将其转入含10%椰汁，3%蔗糖，0.78% 琼脂的MS固体培养基中，培养20～30d。

上述单核靠边期对应的花蕾长度不结球白菜为2.0～3.0mm，青花菜为3.0mm～4.0mm；

所述的B5-13液体培养基为小孢子提取液，是通过以下方法制备得到的：分别吸取B5 培养基的大量元素50ml、微量元素5ml、铁盐10ml、有机元素10ml四种母液混合到500ml 蒸馏水中，混匀，再加入130g蔗糖，搅拌至完全溶解，定容至1000ml，然后调pH至6.0～6.2； 于121℃，1.1Mpa条件下灭菌20分钟。

所述的1/2NLN液体培养基是通过以下方法制备得到的：分别吸取NLN培养基的大量 元素25ml、微量元素5ml、铁盐10ml、有机元素10ml四种母液混合到500ml蒸馏水中， 混匀，再依次加入肌醇0.1g、谷氨酰胺0.8g、丝氨酸0.1g、谷胱甘肽0.03g、蔗糖130g， 搅拌至完全溶解后，定容至1000ml，然后调pH至6.0～6.2；采用0.22μm的微孔滤膜抽滤 灭菌。

所述的B5固体培养基是通过以下方法制备得到的：分别吸取B5培养基的大量元素 50ml、微量元素5ml、铁盐10ml、有机元素10ml四种母液混合到500ml蒸馏水中，混匀， 再加入25g蔗糖，搅拌至完全溶解，定容至1000ml，加热至沸腾后，加入10g琼脂粉，搅 拌至完全溶解，调pH至5.8～6.0；在121℃，1.1Mpa条件下灭菌20分钟。

所述的MS固体培养基是通过以下方法制备得到的：分别吸取MS培养基的大量元素 50ml、微量元素5ml、铁盐10ml、有机元素10ml四种母液，椰汁100ml混合到500ml蒸 馏水中，混匀，再加入30g蔗糖，搅拌至完全溶解，定容至1000ml，加热至沸腾后，加入 7.8g琼脂粉，搅拌至完全溶解，调pH至5.8～6.0；在121℃，1.1Mpa条件下灭菌20分钟。

步骤(6)中再生植株的培养条件都为90uE/m²/s、12hr/d、25℃。

所述的灭菌步骤是将预处理后的花蕾依次用体积浓度为75％的酒精和7％(v/v)的 NaClO溶液消毒，无菌水冲洗。

所述的热激诱导是将小孢子悬浮液置于33℃高温下黑暗静置24h。

所述的花蕾的选择是通过醋酸洋红压片法镜检确定小孢子的发育时期及与花蕾长度 的对应关系，准确找到发育时期为单核靠边期的花蕾。

培养基中的大量元素可为NH₄NO₃、KNO₃、MgSO₄·7H₂O、(NH₄)₂SO₄、NaH₂PO₄·H₂O、 Ca(NO₃)₂·4H₂O、KH₂PO₄、CaCl₂中的一种或多种。微量元素可为MnSO₄·H₂0、H₃BO₃、 ZnSO₄·7H₂O、KI、Na₂MoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O中的一种或多种。Fe盐 可为：Na₂-EDTA、FeSO₄·7H₂O中的一种或多种。有机元素可为肌醇、烟酸、VB₆、VB₁、 甘氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、谷胱甘肽、叶酸、生物素中的一种或多种。

上述快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，具体包括如下步骤：

(1)花蕾的选择：在初花期和盛花期，通过醋酸洋红压片法镜检确定小孢子的发育时 期及与花蕾长度的对应关系，准确找到发育时期为单核靠边期的花蕾；

(2)花蕾预处理：将选取的适宜花蕾保湿并置于4℃冰箱中处理24h；

(3)灭菌：选取的花蕾用75％的酒精消毒30s，然后用7％(v/v)的NaClO溶液消毒 15min，最后用无菌水冲洗3次，每次3～5min；

(4)小孢子分离与纯化：将消毒后的花蕾置于研钵中，加入1～2ml B₅-13液体培养基， 采用挤压法使小孢子游离出来，然后用300目滤网过滤，将滤液收集于10ml离心管， 1000rpm离心3min，弃上清液，重复3次；

(5)培养液的分装：将纯化后的小孢子用含有13%蔗糖的1/2NLN液体培养基重新悬 浮，然后分装于60×15mm培养皿中，每皿3ml，小孢子密度约1蕾/ml，用Parafilm膜封 口；

(6)热激诱导：将上述小孢子悬浮液置于33℃高温下黑暗处理24h；

(7)胚状体形成：将热激后的小孢子悬浮液于25℃黑暗静置培养，2～3周后即可出现 肉眼可见的胚状体；

(8)振荡培养：将上述胚状体转到2000lx、25℃、60r/min摇床上振荡培养；

(9)诱导再生植株：振荡培养3～7d后将转绿的子叶型胚转移到含蔗糖2.5%，琼脂1% 的B5固体培养基上继续培养获得再生芽，15～20d后，将其转入含10%椰汁，3%蔗糖， 0.78%琼脂的MS固体培养基中，20～30d即可长成健壮且生根的幼苗，可驯化移栽；

游离小孢子培养的各种母液配方如下：

与现有技术比较本发明的有益效果：

本发明快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法获得了小孢子再生 植株群体（DH）。

通过本发明改良后的获得游离小孢子培养（IMC）再生植株方法，使对常规方法易褐 化、玻璃化、不易生根、不易得到再生植株的芸薹属蔬菜得到了高频率的再生植株，最高 胚芽诱导率达90%以上，再生植株平均成苗率达83.5%；除此之外，大多数仅使用添加椰 汁的MS培养基再生植株即可生根，平均生根率达75%左右，不用添加任何激素以及使用 生根培养基，节省了时间且更安全。

附图说明

图1为本发明中子叶型胚在含不同浓度琼脂粉的B5固体培养基中的生长状况：图中 A、B分别代表子叶型胚在0.8%和1%浓度琼脂粉的B5固体培养基中的生长状况。在含0.8% 琼脂的B5固体培养基中的子叶型胚易褐化，胚芽发生率极低；在含1%的B5固体培养基 中的子叶型胚大多数能诱导出再生芽，胚芽发生率提高。

图2为本发明中芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株在不同的MS固体培养基中的生 长及生根状况：图中A代表在不含椰汁的MS固体培养基中植株生长情况；图中B代表在 含椰汁10%的MS固体培养基中植株生长状况；图中C代表两种不同MS固体培养基中植 株生长及生根状况对比。在含10%椰汁的MS固体培养基上的再生植株长势更好，并且所 诱导的根粗且密。

具体实施方式

实施例1培养基的配制

1、母液的准备

实验前先将本发明方法中所需要用到的各种培养基的大量元素、微量元素、有机元素、 和铁盐配制成母液储存在4℃冰箱中，配制浓度分别为：20倍(以下用20X表示)、200倍(以 下用200X表示)、100倍(以下用100X表示)和100倍(以下用100X表示)，具体成分见表1。

表1游离小孢子培养的各种母液配方

2、培养基的配制及灭菌

①小孢子培养基（1/2NLN-13）：1/2NLN+13%蔗糖，pH为6.0～6.2；

培养基用0.22μm的微孔滤膜抽滤灭菌；

②小孢子提取液（B₅-13）：B₅基本培养基+13%蔗糖，pH为5.8；

③B5固体培养基：

a、B₅基本培养基+2.5%蔗糖+0.8％琼脂(ck)，pH为5.8；

b、B₅基本培养基+2.5%蔗糖+1％琼脂，pH为5.8；

④MS固体培养基：

a、MS基本培养基+3%蔗糖+0.78%琼脂(ck)，pH为5.8；

b、MS基本培养基+3%蔗糖+0.78%琼脂+10%椰汁，pH为5.8；

以上培养基于121℃,1.1Mpa条件下灭菌20分钟。

实施例2芸薹属蔬菜游离小孢子培养及诱导出胚

1、基因型：不结球白菜NHCC-549；青花菜A36-5，A47-4，A48-3。

不结球白菜NHCC-549——“马耳头”与“小松菜”的杂交种（由“马耳头”为母本，“小松菜” 为父本采用常规方法杂交得来）；青花菜A36-5——商品名为“优秀1号”；青花菜A47-4—— 商品名为“久绿”；青花菜A48-3——商品名为“富岛”。均采购于江苏省农科院明达种子经 营部。

2、花蕾的选择：在初花期和盛花期,通过醋酸洋红压片法镜检确定小孢子的发育时期及与 花蕾长度的对应关系，准确找到发育时期为单核靠边期的花蕾，其中适宜进行小孢子培养 的花蕾长度不结球白菜为2.0～3.0mm，青花菜为3.0mm～4.0mm；

3、花蕾预处理：将选取的适宜花蕾保湿并置于4℃冰箱中处理24h；

4、灭菌：选取的花蕾用75％的酒精消毒30s，然后用7％(v/v)的NaClO溶液消毒15min， 最后用无菌水冲洗3次，每次3～5min；

5、小孢子分离与纯化：将消毒后的花蕾置于研钵中，加入1～2ml B5-13培养基,采用挤压 法使小孢子游离出来,然后用300目滤网过滤，将滤液收集于10ml离心管，1000rpm离心 3min，弃上清液，重复3次；所述的花蕾与B5-13液体培养基的比例为每28-32个花蕾中 加入1～2ml的B5-13液体培养基。

6、培养液的分装：将纯化后的小孢子用含有13%蔗糖的1/2NLN培养基重新悬浮，然后分 装于60×15mm培养皿中，每皿3ml，小孢子密度约1蕾/ml,用Parafilm膜封口；

7、高温诱导：将上述小孢子悬浮液置于33℃高温下黑暗处理24h；

8、25℃黑暗静置培养；

9、胚状体形成：黑暗处理2～3周后即可出现肉眼可见的胚状体。

实施结果如下：

不同基因型的芸薹属蔬菜游离小孢子培养的出胚情况：暗室培养2周后对游离小孢子 培养材料进行统计，看是否有颗粒状胚状体出现。结果如表2表明，四种基因型的芸薹属 蔬菜中，青花菜A47-4出胚率最高，高达1.49。

表2不同基因型的芸薹属蔬菜游离小孢子培养的出胚情况

实施例3诱导胚状体获得再生芽

1、振荡培养：将实施例2中获得的胚状体转到2000lx、25℃、60r/min摇床上振荡培养； 2、诱导胚状体获得再生芽：将同等天数已转绿的子叶型胚分别转移到含蔗糖2.5%、琼脂 粉1%和含蔗糖2.5%、琼脂粉0.8%(ck)的两种B5固体培养基上继续培养15～20d，培养条 件为90uE/m2/s、12hr/d、25℃的培养室。观察其生长状况并进行统计记录。

实施结果如下：

表3结果表明：①NHCC-549及A48-3在含0.8%琼脂的B5固体培养基上几乎全部褐 化，胚芽发生率极低，但在含1%琼脂的B5固体培养基上，均有诱导出再生芽，胚芽发生 率分别为0.50和0.33；②A36-5和A47-4在含1%琼脂的B5固体培养基上的胚芽发生率分 别由0.75提高到了0.92，由0.71提高到了0.91。

表3四种基因型芸薹属蔬菜在含不同浓度琼脂的B5固体培养基的胚芽发生率的对比情况

实施例4获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株

1、基因型：青花菜A36-5，A47-4；

2、获得再生植株：将实施例3中得到的两种基因型中生长状况良好的胚状体再生芽分别 转入含10%椰汁、3%蔗糖、0.78%琼脂和无椰汁、3%蔗糖、0.78%琼脂(ck)的两种MS固体 培养基中，培养条件都为90uE/m2/s、12hr/d、25℃的培养室。20～30d后观察其生长状况 并进行统计记录。待植株长成4～6片真叶、健壮且生根的幼苗，可驯化移栽。

实施结果如下：

表4结果表明：A36-5及A47-4两个品种在添加10%椰汁的MS固体培养基上比在常 规无椰汁的MS固体培养基上的成苗率和生根率均高，分别提高了1.46倍，2.15倍和1.87 倍，3.36倍。并且由附图说明2可以看出在含10%椰汁的MS固体培养基上的再生植株长 势更好，并且所诱导的根粗且密。

表4两种基因型在不同MS固体培养基上游离小孢子再生植株的成苗率和生根率情况