一种七肽混合物及其在制备贝氏柯克斯体疫苗中的应用

摘要

本发明公开了一种七肽混合物及其在制备贝氏柯克斯体疫苗中的应用。本发明提供的七肽组合物，由序列表的序列1所示的多肽、序列表的序列2所示的多肽、序列表的序列3所示的多肽、序列表的序列4所示的多肽、序列表的序列5所示的多肽、序列表的序列6所示的多肽和序列表的序列7所示的多肽组成。本发明提供的七肽混合物能够刺激机体产生特异性CD4

说明书

技术领域

本发明涉及一种七肽混合物及其在制备贝氏柯克斯体疫苗中的应用。

背景技术

贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)又称贝纳氏柯克斯体，为专性吞噬细胞内寄生 的革兰阴性小杆菌,其所致疾病称为Q热（Q fever）。Q热分为急性和慢性两种临床 类型。急性Q热表现为急性流感样症状，以头痛、发热、肺炎为主要特征，而慢性Q 热主要表现为长期发热，常伴有心内膜炎、肝炎、骨髓炎等。目前已经报道的Q热病 例遍及全球各大洲几乎所有国家，成为当前分布最广的人兽共患病之一。贝氏柯克斯 体的感染剂量极低，单个病原体即可致病，因此该病原体已被某些国家用作生物武器、 还可能被恐怖组织用作生物恐怖剂。

虽然抗生素治疗对Q热有效,但由于Q热能以气溶胶的形式传播,一旦流行难以控 制。另外慢性Q热需要较长的疗程(可长达12个月)，且易复发。因此采用有效的疫苗 作预防接种是防止Q热发生和流行的最有效手段。目前已问世的灭活Q热疫苗需要鸡 胚大量繁殖贝氏柯克斯体进行制备，但是鸡胚繁殖量低，提取纯化贝氏柯克斯体的防 护要求高、工艺复杂、成本昂贵，因此难以大量制备和推广使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种七肽混合物及其在制备贝氏柯克斯体疫苗中的应用。

本发明提供的七肽组合物，由序列表的序列1所示的多肽、序列表的序列2所示 的多肽、序列表的序列3所示的多肽、序列表的序列4所示的多肽、序列表的序列5 所示的多肽、序列表的序列6所示的多肽和序列表的序列7所示的多肽组成。所述七 肽组合物中，序列表的序列1所示的多肽、序列表的序列2所示的多肽、序列表的序 列3所示的多肽、序列表的序列4所示的多肽、序列表的序列5所示的多肽、序列表 的序列6所示的多肽和序列表的序列7所示的多肽的质量配比具体可为 1:1:1:1:1:1:1。

本发明还保护所述七肽组合物在制备贝氏柯克斯体疫苗中的应用。所述疫苗为预 防性疫苗。

本发明还保护一种贝氏柯克斯体疫苗，其活性成分为所述七肽组合物。所述疫苗 为预防性疫苗。

有效的抗贝氏柯克斯体特异性免疫主要是通过激活CD4⁺T淋巴细胞及其它免疫活 性细胞分泌的细胞因子，特别是γ干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF）来激活 巨噬细胞及其他免疫效应细胞，增强这些细胞对贝氏柯克斯体的杀伤。本发明提供的 七肽混合物能够刺激机体产生特异性CD4⁺T细胞免疫应答对抗贝氏柯克斯体毒株攻击， 为具有Q热疫苗功能的保护性抗原。本发明提供的七肽混合物可以通过固相合成的方 法制备，操作简便、成本低、产量高。本发明对于贝氏柯克斯体的防控具有重大价值。

附图说明

图1为七肽混合物刺激贝氏柯克斯体免疫小鼠的CD4⁺T细胞的细胞因子表达水平。

图2为七肽混合物的免疫保护效果评价。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

C57BL/6小鼠：军事医学科学院实验动物中心。小鼠组织淋巴细胞分离液：天津 TBD公司，货号LTS1092。细胞RPMI-1640培养液：Hyclone公司，货号SH30809。胎 牛血清（Fetal bovine serum，FBS）：Hyclone公司，货号GWH0093。PerCP-标记的仓 鼠抗小鼠CD3e单克隆抗体(Anti-CD3e-PerCP)：BD公司，货号347692。APC-标记的大 鼠抗小鼠CD4单克隆抗体(Anti-CD4-APC)：BD公司，货号24531。PE-标记的大鼠抗 小鼠IFN-γ单克隆抗体(Anti-IFN-γ-PE)：BD公司，货号41772。FITC-标记的大鼠 抗小鼠TNF单克隆抗体(Anti-TNF-α-FITC)：BD公司，货号41623。莫能霉素 (GolgiStop)：BD公司，货号31509。破膜剂（Perm2）：BD公司，货号347692。组织 DNA提取试剂盒：Qiagen公司，货号69506。12孔板（12孔细胞培养板）：Costar 公司，货号3513。弗氏完全佐剂（CFA）：Sigma公司，产品目录号为F-5881。弗氏不 完全佐剂（IFA）：Sigma公司，产品目录号为F-5506。7300 Real Time PCR System： Applied Bio systems公司。

磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）的制备方法：取NaCl 8.5g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.86g、 NaH₂PO₄·2H₂O 0.312g，加MilliQ水溶解并定容至1000ml。T细胞培养液的制备方法： 将95ml RPMI-1640培养液与5ml胎牛血清混合，得到T细胞培养液。细胞固定液的制备 方法：将1g多聚甲醛溶于PBS缓冲液并用PBS缓冲液定容至100ml。

实施例中所用的贝氏柯克斯体为贝氏柯克斯体新桥株（Coxiella burnetii） Xinqiao strain在文献“Wen,B.,S.Yu,G.Yu,Q.Li,and X.Zhang.1991.Analysis  of proteins and lipopolysaccharides from Chinese isolates of Coxiella burnetii  with monoclonal antibodies.Acta Virol 35:538-544.”中公开过，公众可在法律 及军队相关规定允许的范围内从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 获得。

实施例1、七肽混合物的制备

七种多肽和对照多肽见表1。

表1七种多肽和对照多肽的氨基酸序列以及其编码基因的序列

  氨基酸序列 编码基因的序列 多肽Com1_45-59HYLVNHPEVLVEASQ（序列1） cattatttagtcaaccacccagaagttttagtagaagcatcccaa 多肽GroEL_474-488DVNYGYNAATGEYGD（序列2） gacgttaattatggttataacgcagcgacgggtgaatacggtgac 多肽Mip_159-173FDSSYKRGQPATFPL（序列3） tttgacagttcctacaaacggggtcaaccggcgacgttcccccta 多肽OmpA_146-160GKLGVAYTYNRANAG（序列4） gggaaattaggcgttgcttacacctacaatcgagctaacgccggt 多肽OmpH_13-27VAMIWSVAAVAQTVG（序列5） gtagccatgatttggagtgtagctgctgttgcccaaacggttggg 多肽P1_73-87PVSASITQFGPVGEL（序列6） ccagtttctgcttcaataacccaatttggtcctgtcggtgaatta 多肽YbgF_180-194LLTKKQYDKAQASFQ（序列7） ttattaactaaaaaacaatatgacaaagcacaagcgtcgtttcaa 对照多肽 GSRSRFWNPLFAAGV  

由北京赛百盛基因有限公司分别合成多肽Com1_45-59、多肽GroEL_474-488、多肽Mip_159-173、 多肽OmpA_146-160、多肽OmpH_13-27、多肽P1_73-87和多肽YbgF_180-194。将每种多肽用PBS缓冲液 制备为蛋白浓度为1mg/ml的多肽溶液。将多肽Com1_45-59溶液、多肽GroEL_474-488溶液、 多肽Mip_159-173溶液、多肽OmpA_146-160溶液、多肽OmpH_13-27溶液、多肽P1_73-87溶液和多肽 YbgF_180-194溶液各30μl混合，然后用PBS缓冲液定容至1ml，得到七肽混合物溶液（七 肽混合物溶液的总蛋白浓度为0.21mg/ml，每种多肽的浓度均为0.03mg/ml）。

由北京赛百盛基因有限公司合成对照多肽，用PBS缓冲液制备为蛋白浓度为 0.21mg/ml的多肽溶液，即为对照多肽溶液。

实施例2、七肽混合物刺激T细胞因子表达

1、取甲醛灭活纯化的贝氏柯克斯体菌体，超声破碎（VCX750超声仪，40%振幅, 超声5秒停9秒,共30分钟）后20000×g离心30分钟，收集上清，用PBS缓冲液调 整蛋白浓度至0.21mg/ml，得到菌体蛋白溶液。

2、将步骤1得到的菌体蛋白溶液与等体积的弗氏完全佐剂混合均匀并超声制备成 乳浊液，接种C57BL/6小鼠（接种量为200μl乳浊液/只，接种方式为背部皮下多点 注射）；接种后第14天处死小鼠，取脾脏，研磨并用PBS缓冲液稀释，得到研磨液； 取研磨液，加入2倍体积的小鼠组织淋巴细胞分离液，500×g离心5min，吸弃上清， 将沉淀用PBS缓冲液洗涤2次，得到脾脏淋巴细胞。

3、取步骤2得到的脾脏淋巴细胞，用T细胞培养液稀释并均匀接种至12孔板， 每孔2×10⁶个细胞。

4、取步骤3得到的12孔板，分成四组，每组3个复孔，分别处理如下：

第一组（七肽混合物组）：加入实施例1制备的七肽混合物溶液，每孔加入10μg 七肽混合物（以总蛋白计），然后37℃培养18小时；

第二组（对照多肽组）：加入实施例1制备的对照多肽溶液，每孔加入10μg对照 多肽，然后37℃培养18小时；

第三组（菌体蛋白组）：加入步骤1制备的菌体蛋白溶液，每孔加入10μg菌体蛋 白，然后37℃培养18小时；

第四组（空白对照组）：用等体积的PBS缓冲液代替七肽混合物溶液，其它同第 一组。

5、取步骤4得到12孔板，加入蛋白输出抑制剂莫能霉素(GolgiStop，0.7μl/10⁶cells)，然后37℃培养6小时。

6、完成步骤5后，分别收集各孔的T细胞并制成单细胞悬液。

7、取步骤6得到的单细胞悬液，分别用Anti-CD3e-PerCP、Anti-CD4-APC对CD4⁺T 细胞表面分子进行标记，避光染色15min，洗涤细胞，500×g离心5min，收集细胞。

8、取步骤7得到的细胞，加入0.5ml破膜剂，室温避光作用10min，洗涤细胞， 500×g离心5min，收集细胞。

9、取步骤8得到的细胞，分别用Anti-IFN-γ-PE、Anti-TNF-α-FITC标记细胞 内因子，室温避光30min，洗涤细胞，500×g离心5min，收集细胞。

10、取步骤9得到的细胞，用细胞固定液固定，然后用FACS-Calibur流式细胞仪 进行细胞内因子的检测，至少收集10000个淋巴细胞，最后用CellQuest软件分析数 据。

结果见图1。菌体蛋白刺激IFN-γ和TNF-α双阳细胞百分比分别为11.4%和16.3%, 七肽混合物刺激IFN-γ和TNF-α双阳细胞百分比分别为10.3%和5.1%，对照多肽刺 激IFN-γ和TNF-α双阳细胞的百分比分别为4.1%和0.6%,PBS缓冲液刺激IFN-γ 和TNF-α双阳细胞的百分比分别为1.1%和0.4%。结果表明，说明七肽混合物是贝氏 柯克斯体重要的CD4⁺T细胞表位,具有较强的免疫原性。

实施例3、七肽混合物的保护性评价

24只雌性4周龄C57BL/6小鼠随机分为四组，每组6只，分别进行如下处理：

第一组（七肽混合物组）：实验第1天，将实施例1制备的七肽混合物溶液与等体 积的弗氏完全佐剂混合均匀并超声制备成乳浊液，接种小鼠（接种量为200μl乳浊液 /只，接种方式为背部皮下多点注射）；实验第29天，将实施例1制备的七肽混合物溶 液与等体积的弗氏不完全佐剂混合均匀并超声制备成乳浊液，接种小鼠（接种量为 200μl乳浊液/只，接种方式为背部皮下多点注射）；实验第43天，将实施例1制备 的七肽混合物溶液与等体积的弗氏不完全佐剂混合均匀并超声制备成乳浊液，接种小 鼠（接种量为200μl乳浊液/只，接种方式为腹腔注射）；实验第57天，用贝氏柯克 斯体对小鼠进行攻毒（攻毒剂量为1×10⁶拷贝数/只，攻毒方式为腹腔接种,200μl/ 只）；实验第64天，处死小鼠，取10mg脾组织，提取DNA，溶于200μl去离子水中, 取其中2μl,采用实时荧光定量PCR检测脾脏中的贝氏柯克斯体载量；

第二组（对照多肽组）：用等体积的实施例1制备的对照多肽溶液代替七肽混合物 溶液，其它均同第一组；

第三组（菌体蛋白组）：用等体积的实施例2的步骤1制备的菌体蛋白溶液代替七 肽混合物溶液，其它均同第一组；

第四组（空白对照组）：用等体积的PBS缓冲液代替七肽混合物溶液，其它均同第 一组。

实时荧光定量PCR中采用的引物和探针如下：

Fp：5’-CGGCTGAATTTAAGCGATTTATTTT-3’；

Rp：5’-CGTAACCACACACGCATCTCA-3’；

TaqMan MGB2probe：5’-CCGAACC2CATTGCAA-3’。

进行三次重复实验，结果数据以表示。对定量PCR结果运用SAS9.1软件进 行单因素多水平方差分析及两两比较。

结果见表2和图2。

表2贝氏柯克斯体拷贝数的检测结果

（每100μg脾组织中的贝氏柯克斯体拷贝数）

  贝氏柯克斯体拷贝数 空白对照组 598833±242496 对照多肽组 465333±218578 七肽混合物组 40583±22557 菌体蛋白组 6210±2296

统计学分析显示，全菌蛋白组和七肽混合物组小鼠脾脏的贝氏柯克斯体平均载量 均显著少于空白对照组（P<0.05），对照多肽组与空白对照无显著性差异。说明七肽 混合物能诱发针对贝氏柯克斯体的保护性免疫。