叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法

摘要

本发明涉及抗肿瘤靶向药物技术领域，具体涉及叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，它包括以下步骤：步骤一，将盐酸米托蒽醌溶液与壳聚糖醋酸溶液混合，得到壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液；步骤二，将壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液加入到叶酸氨盐溶液中，然后继续往叶酸氨盐溶液中加入多聚磷酸钠水溶液，混合均匀，得到叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系；步骤三，将叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系进行离心得到沉淀物，将沉淀物洗涤后进行冷冻干燥，得到叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。该制备方法避免有机溶剂的使用，大大缩短了反应的时间，所制得的纳米微粒对肿瘤细胞具有明显的靶向作用，且生物相容性好。

说明书

技术领域

本发明涉及抗肿瘤靶向药物技术领域，具体涉及叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法。

背景技术

抗肿瘤药物往往存在选择性不高的缺点，在杀伤肿瘤细胞的同时也可能杀死机体正常细胞，毒副作用较大，给患者带来极大的痛苦。叶酸受体是肿瘤选择性药物输送的特异性靶点，叶酸受体在约30%的肿瘤细胞（如卵巢癌细胞、结肠直肠癌细胞、肺癌细胞、肾癌细胞等）膜表面的活性和数量明显高于一般正常细胞。在药理学上，由于受体与其配体的结合具有特异性、选择性、亲合力强等特点，利用配体作为药物载体或与载体偶联，通过受体介导作用，可增加药物在病灶局部的浓度，从而能够提高药物的疗效，降低毒副作用，达到靶向治疗的目的。因此，作为叶酸受体的配体，叶酸在肿瘤治疗及预防中越来越显示出其应用价值。

壳聚糖是一种广泛存在于自然界的聚阳离子多糖衍生物，又称可溶性甲壳质、甲壳胺、几丁聚糖等，其结构类似于纤维素。经壳聚糖负载的抗癌药物的作用时间显著延长，并且壳聚糖本身就具有抗肿瘤的特性，壳聚糖作为抗癌药物的载体和抗癌药物共同使用后，能够明显地提高药物疗效并降低药物的毒副作用， 因此，壳聚糖是抗癌药物的理想载体。

现有技术中，将叶酸分子偶联到药物载体上的方法，多采用偶联剂将叶酸制备成叶酸活性酯，并且在制备叶酸活性酯时需使用大量的有机溶剂（例如二甲基亚砜）作为液相用以进行反应。反应完毕后，为了除去有机溶剂，需要经过长时间的透析步骤，才能彻底将有机溶剂去除。因此，现有技术将叶酸分子偶联到药物载体上的方法，一方面存在反应时间长和步骤繁琐的缺点，导致整个制备时间长，生产效率低；另一方面，所使用的偶联剂和作为液相的有机溶剂通常具有毒性，且偶联剂容易残留，残留的偶联试剂容易对机体造成细胞毒性以及对大分子产生灭活。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，该制备方法简单且反应时间短。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一，将盐酸米托蒽醌溶液与壳聚糖醋酸溶液混合，得到壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液；

步骤二，在一定温度下，将所述壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液加入到叶酸氨盐溶液中，然后继续往所述叶酸氨盐溶液中加入多聚磷酸钠水溶液，混合均匀，得到叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系；

步骤三，将步骤二得到的叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系进行离心得到沉淀物，将沉淀物洗涤后进行真空冷冻干燥，得到叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。

上述技术方案中，所述盐酸米托蒽醌溶液、所述壳聚糖醋酸溶液、所述叶酸氨盐溶液和所述多聚磷酸钠水溶液的体积比为1mL~2mL：2mL~6mL：2mL~6mL：1mL~3mL。

上述技术方案中，步骤一中，所述盐酸米托蒽醌溶液是通过将盐酸米托蒽醌溶于水中配制而成，所述盐酸米托蒽醌溶液的质量/体积浓度为0.5mg/mL~3mg/mL。

上述技术方案中，步骤一中，所述壳聚糖醋酸溶液是通过将壳聚糖溶于醋酸溶液中配制而成，所述壳聚糖醋酸溶液的质量/体积浓度为1mg/mL~5mg/mL；所述醋酸溶液的质量百分浓度为1%~5%。

上述技术方案中，步骤二中，所述叶酸氨盐溶液是通过将叶酸粉末溶于氨水中配制而成，所述叶酸氨盐溶液的质量/体积浓度为0.2mg/mL~1mg/mL；所述氨水的质量百分浓度为35%~45%。

上述技术方案中，步骤二中，所述多聚磷酸钠水溶液是通过将多聚磷酸钠溶于水中配制而成，所述多聚磷酸钠水溶液的质量/体积浓度为1mg/mL~4mg/mL。

上述技术方案中，所述多聚磷酸钠为三聚磷酸钠、四聚磷酸钠或五聚磷酸钠中的任意一种。

上述技术方案中，步骤二中，在磁力搅拌和水浴加热的条件下，将所述壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液加入到叶酸氨盐溶液中，然后往所述叶酸氨盐溶液中继续加入多聚磷酸钠水溶液，加入完毕后，继续磁力搅拌10min~20min；

所述磁力搅拌的速度为900r/min~1000r/min；所述水浴加热的温度为50℃~60℃。

上述技术方案中，步骤二中，将所述壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液用注射器以逐滴滴入的方式加入到叶酸氨盐溶液中，然后往所述叶酸氨盐溶液中继续用注射器以逐滴滴入的方式加入多聚磷酸钠水溶液，所述逐滴滴入的速度均为1滴/秒~3滴/秒。

上述技术方案中，步骤三中，将沉淀物洗涤用的洗涤液是pH值为4.0~6.0的醋酸溶液；步骤三的离心速度为4500r/min~5500r/min，离心时间为20min~40min；步骤三的真空冷冻干燥的真空度为8 Pa ~12Pa，冷冻温度为-18℃~-22℃，真空冷冻干燥的时间为9小时~11小时。

其中，所述盐酸米托蒽醌溶液、所述壳聚糖醋酸溶液、所述叶酸氨盐溶液和所述多聚磷酸钠水溶液配制完成后，均用微孔滤膜过滤后再用于制备叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。优选的，所述微孔滤膜的孔径为0.2μm~0.45μm。

本发明的有益效果是：

（1）本发明提供的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，是对壳聚糖进行亲水改性，即将壳聚糖、叶酸和盐酸米托蒽醌在水相中一步偶联，避免了有机溶剂的使用，大大缩短了反应的时间。

（2）本发明提供的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，与现有技术中叶酸偶联壳聚糖的方法相比，本发明的制备方法无需使用大量的有机试剂和有毒的偶联剂，能够避免偶联剂的残留，从而避免偶联剂对机体造成细胞毒性以及对大分子产生灭活。

（3）本发明提供的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，所制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒对肿瘤细胞具有明显的靶向作用，且制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的生物相容性好，并且能够提升盐酸米托蒽醌的控释性和靶向性，从而提高盐酸米托蒽醌抗肿瘤的疗效。

（4）本发明提供的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，所制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒具有粒径可控的特点，通过控制各反应因素，能够控制叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的粒径大小，其中，上述反应因素包括：叶酸氨盐溶液和壳聚糖醋酸溶液的质量/体积浓度；盐酸米托蒽醌溶液、壳聚糖醋酸溶液、叶酸氨盐溶液和多聚磷酸钠水溶液的体积比；壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液的滴入速度，水浴加热的温度；磁力搅拌的速度。

（5）本发明提供的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，所制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒在透射电镜下观察，具有颗粒形态圆整、颗粒大小均匀、无黏连的特点，而且该叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备重复性良好，所制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的粒径为25纳米~40纳米。

（6）本发明提供的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，所制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒对盐酸米托蒽醌的包封率高达89.9%~90.9％，载药率为19.5%~20.7%。

（7）本发明提供的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，所制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒在pH值为1．2人工胃液或pH值为6．8的人工肠液中均具有良好的缓控释作用，且无突释现象。

（8）本发明提供的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，具有反应条件温和、制备方法简单、易于工业化生产的优点。

附图说明

利用附图对发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。

图1是本发明的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法的实施例1所制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的透射电镜图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步的说明。

本发明的盐酸米托蒽醌是一种抗癌药物。

实施例1。

    叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一，将盐酸米托蒽醌溶液与壳聚糖醋酸溶液混合，得到壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液；

其中，盐酸米托蒽醌溶液是通过将盐酸米托蒽醌溶于水中配制而成，本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液的质量/体积浓度为1mg/mL。

其中，壳聚糖醋酸溶液是通过将壳聚糖溶于醋酸溶液中配制而成，本实施例中，壳聚糖醋酸溶液的质量/体积浓度为2mg/mL，醋酸溶液的质量百分浓度为2%。

步骤二，在磁力搅拌和水浴加热的条件下，用注射器将壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液以1滴/秒的速度逐滴滴入叶酸氨盐溶液中，然后继续往叶酸氨盐溶液中以1滴/秒的速度逐滴滴入三聚磷酸钠水溶液，滴加完毕后，继续磁力搅拌15min；得到叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系；

本实施例中，磁力搅拌的速度为950r/min；水浴加热的温度为55℃。

其中，叶酸氨盐溶液是通过将叶酸粉末溶于氨水中配制而成，叶酸氨盐溶液的质量/体积浓度为0.5mg/mL；氨水的质量百分浓度为40%。

其中，三聚磷酸钠水溶液是通过将三聚磷酸钠溶于水中配制而成，三聚磷酸钠水溶液的质量/体积浓度为2mg/mL。

步骤三，将步骤二得到的叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系进行离心得到蓝绿色沉淀物，然后用pH值为5.0的醋酸溶液洗涤沉淀物，然后再重复上述离心和洗涤步骤，共重复三次，最后将沉淀物进行真空冷冻干燥，得到叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。

本实施例中，离心速度为5000r/min，离心时间为30min；真空冷冻干燥的真空度为10Pa，冷冻温度为-20℃，真空冷冻干燥的时间为10小时。

本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液、壳聚糖醋酸溶液、叶酸氨盐溶液和多聚磷酸钠水溶液的体积比为1mL：5mL：5mL：2mL。

本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液、壳聚糖醋酸溶液、叶酸氨盐溶液和多聚磷酸钠水溶液配制完成后，均用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤后再用于制备叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。

本实施例1制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒对肿瘤细胞具有明显的靶向作用，且制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的生物相容性好，并且能够提升盐酸米托蒽醌的控释性和靶向性，从而提高盐酸米托蒽醌抗肿瘤的疗效。

实施例2。

叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一，将盐酸米托蒽醌溶液与壳聚糖醋酸溶液混合，得到壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液；

其中，盐酸米托蒽醌溶液是通过将盐酸米托蒽醌溶于水中配制而成，本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液的质量/体积浓度为3mg/mL。

其中，壳聚糖醋酸溶液是通过将壳聚糖溶于醋酸溶液中配制而成，本实施例中，壳聚糖醋酸溶液的质量/体积浓度为5mg/mL，醋酸溶液的质量百分浓度为4%。

步骤二，在磁力搅拌和水浴加热的条件下，用注射器将壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液以2滴/秒的速度逐滴滴入叶酸氨盐溶液中，然后继续往叶酸氨盐溶液中以2滴/秒的速度逐滴滴入四聚磷酸钠水溶液，滴加完毕后，继续磁力搅拌10min；得到叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系；

本实施例中，磁力搅拌的速度为1000r/min；水浴加热的温度为50℃。

其中，叶酸氨盐溶液是通过将叶酸粉末溶于氨水中配制而成，叶酸氨盐溶液的质量/体积浓度为1mg/mL；氨水的质量百分浓度为45%。

其中，四聚磷酸钠水溶液是通过将四聚磷酸钠溶于水中配制而成，四聚磷酸钠水溶液的质量/体积浓度为4mg/mL。

步骤三，将步骤二得到的叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系进行离心得到蓝绿色沉淀物，然后用pH值为6.0的醋酸溶液洗涤沉淀物，然后再重复上述离心和洗涤步骤，共重复三次，最后将沉淀物进行真空冷冻干燥，得到叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。

本实施例中，离心速度为4500r/min，离心时间为40min；真空冷冻干燥的真空度为8Pa，冷冻温度为-22℃，真空冷冻干燥的时间为10.5小时。

本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液、壳聚糖醋酸溶液、叶酸氨盐溶液和多聚磷酸钠水溶液的体积比为2mL：6mL：6mL：3mL。

本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液、壳聚糖醋酸溶液、叶酸氨盐溶液和多聚磷酸钠水溶液配制完成后，均用孔径为0.2μm的微孔滤膜过滤后再用于制备叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。

本实施例2制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒对肿瘤细胞具有明显的靶向作用，且制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的生物相容性好，并且能够提升盐酸米托蒽醌的控释性和靶向性，从而提高盐酸米托蒽醌抗肿瘤的疗效。

实施例3。

叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一，将盐酸米托蒽醌溶液与壳聚糖醋酸溶液混合，得到壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液；

其中，盐酸米托蒽醌溶液是通过将盐酸米托蒽醌溶于水中配制而成，本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液的质量/体积浓度为0.5mg/mL。

其中，壳聚糖醋酸溶液是通过将壳聚糖溶于醋酸溶液中配制而成，本实施例中，壳聚糖醋酸溶液的质量/体积浓度为1mg/mL，醋酸溶液的质量百分浓度为1%。

步骤二，在磁力搅拌和水浴加热的条件下，用注射器将壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液以3滴/秒的速度逐滴滴入叶酸氨盐溶液中，然后继续往叶酸氨盐溶液中以3滴/秒的速度逐滴滴入五聚磷酸钠水溶液，滴加完毕后，继续磁力搅拌20min；得到叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系；

本实施例中，磁力搅拌的速度为900r/min；水浴加热的温度为60℃。

其中，叶酸氨盐溶液是通过将叶酸粉末溶于氨水中配制而成，叶酸氨盐溶液的质量/体积浓度为0.2mg/mL；氨水的质量百分浓度为35%。

其中，五聚磷酸钠水溶液是通过将五聚磷酸钠溶于水中配制而成，五聚磷酸钠水溶液的质量/体积浓度为1mg/mL。

步骤三，将步骤二得到的叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系进行离心得到蓝绿色沉淀物，然后用pH值为4.0的醋酸溶液洗涤沉淀物，然后再重复上述离心和洗涤步骤，共重复三次，最后将沉淀物进行真空冷冻干燥，得到叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。

本实施例中，离心速度为5500r/min，离心时间为20min；真空冷冻干燥的真空度为12Pa，冷冻温度为-18℃，真空冷冻干燥的时间为9.5小时。

本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液、壳聚糖醋酸溶液、叶酸氨盐溶液和多聚磷酸钠水溶液的体积比为1.5mL：4mL：3mL：1mL。

本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液、壳聚糖醋酸溶液、叶酸氨盐溶液和多聚磷酸钠水溶液配制完成后，均用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后再用于制备叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。

本实施例3制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒对肿瘤细胞具有明显的靶向作用，且制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的生物相容性好，并且能够提升盐酸米托蒽醌的控释性和靶向性，从而提高盐酸米托蒽醌抗肿瘤的疗效。

实施例4。

叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一，将盐酸米托蒽醌溶液与壳聚糖醋酸溶液混合，得到壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液；

其中，盐酸米托蒽醌溶液是通过将盐酸米托蒽醌溶于水中配制而成，本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液的质量/体积浓度为2mg/mL。

其中，壳聚糖醋酸溶液是通过将壳聚糖溶于醋酸溶液中配制而成，本实施例中，壳聚糖醋酸溶液的质量/体积浓度为3mg/mL，醋酸溶液的质量百分浓度为5%。

步骤二，在磁力搅拌和水浴加热的条件下，用注射器将壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液以1滴/秒的速度逐滴滴入叶酸氨盐溶液中，然后继续往叶酸氨盐溶液中以2滴/秒的速度逐滴滴入三聚磷酸钠水溶液，滴加完毕后，继续磁力搅拌13min；得到叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系；

本实施例中，磁力搅拌的速度为970r/min；水浴加热的温度为52℃。

其中，叶酸氨盐溶液是通过将叶酸粉末溶于氨水中配制而成，叶酸氨盐溶液的质量/体积浓度为0.7mg/mL；氨水的质量百分浓度为38%。

其中，三聚磷酸钠水溶液是通过将三聚磷酸钠溶于水中配制而成，三聚磷酸钠水溶液的质量/体积浓度为3mg/mL。

步骤三，将步骤二得到的叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系进行离心得到蓝绿色沉淀物，然后用pH值为4.5的醋酸溶液洗涤沉淀物，然后再重复上述离心和洗涤步骤，共重复三次，最后将沉淀物进行真空冷冻干燥，得到叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。

本实施例中，离心速度为4800r/min，离心时间为33min；真空冷冻干燥的真空度为9Pa，冷冻温度为-19℃，真空冷冻干燥的时间为9小时。

本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液、壳聚糖醋酸溶液、叶酸氨盐溶液和多聚磷酸钠水溶液的体积比为1.2mL：2mL：4mL：1.5mL。

本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液、壳聚糖醋酸溶液、叶酸氨盐溶液和多聚磷酸钠水溶液配制完成后，均用孔径为0.3μm的微孔滤膜过滤后再用于制备叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。

本实施例4制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒对肿瘤细胞具有明显的靶向作用，且制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的生物相容性好，并且能够提升盐酸米托蒽醌的控释性和靶向性，从而提高盐酸米托蒽醌抗肿瘤的疗效。

实施例5。

叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一，将盐酸米托蒽醌溶液与壳聚糖醋酸溶液混合，得到壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液；

其中，盐酸米托蒽醌溶液是通过将盐酸米托蒽醌溶于水中配制而成，本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液的质量/体积浓度为1.5mg/mL。

其中，壳聚糖醋酸溶液是通过将壳聚糖溶于醋酸溶液中配制而成，本实施例中，壳聚糖醋酸溶液的质量/体积浓度为4mg/mL，醋酸溶液的质量百分浓度为3%。

步骤二，在磁力搅拌和水浴加热的条件下，用注射器将壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液以3滴/秒的速度逐滴滴入叶酸氨盐溶液中，然后继续往叶酸氨盐溶液中以1滴/秒的速度逐滴滴入四聚磷酸钠水溶液，滴加完毕后，继续磁力搅拌17min；得到叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系；

本实施例中，磁力搅拌的速度为930r/min；水浴加热的温度为58℃。

其中，叶酸氨盐溶液是通过将叶酸粉末溶于氨水中配制而成，叶酸氨盐溶液的质量/体积浓度为0.8mg/mL；氨水的质量百分浓度为36%。

其中，四聚磷酸钠水溶液是通过将四聚磷酸钠溶于水中配制而成，四聚磷酸钠水溶液的质量/体积浓度为2.5mg/mL。

步骤三，将步骤二得到的叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系进行离心得到蓝绿色沉淀物，然后用pH值为5.5的醋酸溶液洗涤沉淀物，然后再重复上述离心和洗涤步骤，共重复三次，最后将沉淀物进行真空冷冻干燥，得到叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。

本实施例中，离心速度为5200r/min，离心时间为22min；真空冷冻干燥的真空度为11Pa，冷冻温度为-21℃，真空冷冻干燥的时间为11小时。

本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液、壳聚糖醋酸溶液、叶酸氨盐溶液和多聚磷酸钠水溶液的体积比为1.7mL：3mL：2mL：2.5mL。

本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液、壳聚糖醋酸溶液、叶酸氨盐溶液和多聚磷酸钠水溶液配制完成后，均用孔径为0.3μm的微孔滤膜过滤后再用于制备叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。

本实施例5制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒对肿瘤细胞具有明显的靶向作用，且制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的生物相容性好，并且能够提升盐酸米托蒽醌的控释性和靶向性，从而提高盐酸米托蒽醌抗肿瘤的疗效。

实施例6。

叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一，将盐酸米托蒽醌溶液与壳聚糖醋酸溶液混合，得到壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液；

其中，盐酸米托蒽醌溶液是通过将盐酸米托蒽醌溶于水中配制而成，本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液的质量/体积浓度为2.5mg/mL。

其中，壳聚糖醋酸溶液是通过将壳聚糖溶于醋酸溶液中配制而成，本实施例中，壳聚糖醋酸溶液的质量/体积浓度为2.5mg/mL，醋酸溶液的质量百分浓度为3.5%。

步骤二，在磁力搅拌和水浴加热的条件下，用注射器将壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液以2滴/秒的速度逐滴滴入叶酸氨盐溶液中，然后继续往叶酸氨盐溶液中以1滴/秒的速度逐滴滴入五聚磷酸钠水溶液，滴加完毕后，继续磁力搅拌18min；得到叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系；

本实施例中，磁力搅拌的速度为980r/min；水浴加热的温度为54℃。

其中，叶酸氨盐溶液是通过将叶酸粉末溶于氨水中配制而成，叶酸氨盐溶液的质量/体积浓度为0.6mg/mL；氨水的质量百分浓度为41%。

其中，五聚磷酸钠水溶液是通过将五聚磷酸钠溶于水中配制而成，五聚磷酸钠水溶液的质量/体积浓度为3.5mg/mL。

步骤三，将步骤二得到的叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系进行离心得到蓝绿色沉淀物，然后用pH值为5.0的醋酸溶液洗涤沉淀物，然后再重复上述离心和洗涤步骤，共重复三次，最后将沉淀物进行真空冷冻干燥，得到叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。

本实施例中，离心速度为5300r/min，离心时间为21min；真空冷冻干燥的真空度为10Pa，冷冻温度为-19℃，真空冷冻干燥的时间为10.2小时。

本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液、壳聚糖醋酸溶液、叶酸氨盐溶液和多聚磷酸钠水溶液的体积比为1.3mL：4.5mL：5.5mL：1.8mL。

本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液、壳聚糖醋酸溶液、叶酸氨盐溶液和多聚磷酸钠水溶液配制完成后，均用孔径为0.4μm的微孔滤膜过滤后再用于制备叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。

本实施例6制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒对肿瘤细胞具有明显的靶向作用，且制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的生物相容性好，并且能够提升盐酸米托蒽醌的控释性和靶向性，从而提高盐酸米托蒽醌抗肿瘤的疗效。

实施例7。

叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一，将盐酸米托蒽醌溶液与壳聚糖醋酸溶液混合，得到壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液；

其中，盐酸米托蒽醌溶液是通过将盐酸米托蒽醌溶于水中配制而成，本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液的质量/体积浓度为0.8mg/mL。

其中，壳聚糖醋酸溶液是通过将壳聚糖溶于醋酸溶液中配制而成，本实施例中，壳聚糖醋酸溶液的质量/体积浓度为1.8mg/mL，醋酸溶液的质量百分浓度为2.5%。

步骤二，在磁力搅拌和水浴加热的条件下，用注射器将壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液以1滴/秒的速度逐滴滴入叶酸氨盐溶液中，然后继续往叶酸氨盐溶液中以3滴/秒的速度逐滴滴入三聚磷酸钠水溶液，滴加完毕后，继续磁力搅拌16min；得到叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系；

本实施例中，磁力搅拌的速度为920r/min；水浴加热的温度为57℃。

其中，叶酸氨盐溶液是通过将叶酸粉末溶于氨水中配制而成，叶酸氨盐溶液的质量/体积浓度为0.4mg/mL；氨水的质量百分浓度为43%。

其中，三聚磷酸钠水溶液是通过将三聚磷酸钠溶于水中配制而成，三聚磷酸钠水溶液的质量/体积浓度为1.5mg/mL。

步骤三，将步骤二得到的叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系进行离心得到蓝绿色沉淀物，然后用pH值为5.0的醋酸溶液洗涤沉淀物，然后再重复上述离心和洗涤步骤，共重复三次，最后将沉淀物进行真空冷冻干燥，得到叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。

本实施例中，离心速度为4600r/min，离心时间为38min；真空冷冻干燥的真空度为9.5Pa，冷冻温度为-19.5℃，真空冷冻干燥的时间为9.8小时。

本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液、壳聚糖醋酸溶液、叶酸氨盐溶液和多聚磷酸钠水溶液的体积比为1.8mL：5.5mL：5.8mL：2.1mL。

本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液、壳聚糖醋酸溶液、叶酸氨盐溶液和多聚磷酸钠水溶液配制完成后，均用孔径为0.25μm的微孔滤膜过滤后再用于制备叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。

本实施例7制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒对肿瘤细胞具有明显的靶向作用，且制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的生物相容性好，并且能够提升盐酸米托蒽醌的控释性和靶向性，从而提高盐酸米托蒽醌抗肿瘤的疗效。

实施例8。

叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一，将盐酸米托蒽醌溶液与壳聚糖醋酸溶液混合，得到壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液；

其中，盐酸米托蒽醌溶液是通过将盐酸米托蒽醌溶于水中配制而成，本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液的质量/体积浓度为2.2mg/mL。

其中，壳聚糖醋酸溶液是通过将壳聚糖溶于醋酸溶液中配制而成，本实施例中，壳聚糖醋酸溶液的质量/体积浓度为3.5mg/mL，醋酸溶液的质量百分浓度为4.5%。

步骤二，在磁力搅拌和水浴加热的条件下，用注射器将壳聚糖与盐酸米托蒽醌混合液以1滴/秒的速度逐滴滴入叶酸氨盐溶液中，然后继续往叶酸氨盐溶液中以1滴/秒的速度逐滴滴入三聚磷酸钠水溶液，滴加完毕后，继续磁力搅拌16min；得到叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系；

本实施例中，磁力搅拌的速度为990r/min；水浴加热的温度为51℃。

其中，叶酸氨盐溶液是通过将叶酸粉末溶于氨水中配制而成，叶酸氨盐溶液的质量/体积浓度为0.9mg/mL；氨水的质量百分浓度为44%。

其中，三聚磷酸钠水溶液是通过将三聚磷酸钠溶于水中配制而成，三聚磷酸钠水溶液的质量/体积浓度为1.8mg/mL。

步骤三，将步骤二得到的叶酸-壳聚糖-盐酸米托蒽醌微球水分散体系进行离心得到蓝绿色沉淀物，然后用pH值为5.5的醋酸溶液洗涤沉淀物，然后再重复上述离心和洗涤步骤，共重复三次，最后将沉淀物进行真空冷冻干燥，得到叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。

本实施例中，离心速度为5100r/min，离心时间为28min；真空冷冻干燥的真空度为10.5Pa，冷冻温度为-20.5℃，真空冷冻干燥的时间为9.6小时。

本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液、壳聚糖醋酸溶液、叶酸氨盐溶液和多聚磷酸钠水溶液的体积比为1.1mL：3.8mL：4.2mL：2.3mL。

本实施例中，盐酸米托蒽醌溶液、壳聚糖醋酸溶液、叶酸氨盐溶液和多聚磷酸钠水溶液配制完成后，均用孔径为0.35μm的微孔滤膜过滤后再用于制备叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒。

本实施例8制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒对肿瘤细胞具有明显的靶向作用，且制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的生物相容性好，并且能够提升盐酸米托蒽醌的控释性和靶向性，从而提高盐酸米托蒽醌抗肿瘤的疗效。

检测指标

（一）透射电镜测定叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的粒径

    利用透射电镜观察实施例1至实施例8所制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒，所制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的粒径为25纳米~40纳米，且纳米微粒的颗粒形态圆整、大小均匀、无黏连。

（二）包封率和载药率的测定

将实施例1至实施例8所制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒进行包封率和载药率的测定，实施例1至实施例8所制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒样品分别用1^#、2^#、3^#、4^#、5^#、6^#、7^#、8^#表示，测定数据见表1：

表1 包封率和载药率的测定数据表

样品1^#2^#3^#4^#5^#6^#7^#8^#包封率90.9%90.5%89.9%90.1%90.7%90.3%90.8%90.7%载药率20.7%20.5%20.3%19.5%19.7%20.1%19.9%20.6%

上述测定结果表明：本发明所制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒对盐酸米托蒽醌的包封率和载药率均较高。

具体测定方法：在紫外可见分光光度计上于波长610nm处检测分离的上清中的盐酸米托蒽醌的含量。包封率载和药率的计算公式如下：

包封率=（加入盐酸米托蒽醌的质量-上清中盐酸米托蒽醌的质量）/加入的盐酸米托蒽醌质量×100%

载药率=（加入盐酸米托蒽醌的质量-上清中盐酸米托蒽醌的质量）/叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒的质量×100%

（三）累积释放率的测定实验

将实施例1所制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒分别进行累积释放率的测定，并将实施例1所制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒标记为样品1^*。

测定方法：称量2mg样品，然后将样品分散于pH值为1．2人工胃液中，得到样品的分散液，然后将上述样品的分散液置于截留分子量为8000-12000的透析袋中，然后将透析袋用透析夹夹紧分别后放入装有60mL人工胃液的容器中，然后将容器置于37℃水平恒温振荡器内进行动态透析，每隔一个小时从容器中收集1mL透析液，同时往容器中补充1mL的人工胃液，然后用外分光光度计测定610nm处的盐酸米托蒽醌溶液的吸光度，进而计算累积释放率。

将上述pH值为1．2人工胃液换成pH值为6．8的人工肠液，重复上述释放率的测定实验。

累积释放率的测定结果见表2：

表2  累积释放率的测定数据表

取样时间第1h第2h第12h第24h第36h第48h第60h第72h第96h人工胃液0%5.6%11.5%18.7%26%33.1%40.5%47.6%62.5%人工肠液0%5.6%11.4%18.7%26.2%33%40.3%48%62.5%

上述累积释放率的测定结果表明，所制得的叶酸偶联壳聚糖-盐酸米托蒽醌纳米微粒在pH值为1．2人工胃液或pH值为6．8的人工肠液中均具有良好的缓控释作用，且无突释现象。

其中，人工胃液和人工肠液的配制如下：

人工胃液配制：取浓度为1mol/mL的稀盐酸，加水稀释，将稀盐酸的pH值调至1.2，每100mL稀盐酸中加入1g胃蛋白酶，混匀，然后用0.2μm的无菌滤头过滤待用。

人工肠液配制：取6.8g的KH2PO4加入到500mL的水中进行溶解，然后用0.4%(w/w)的NaOH调节pH值至6.8，得到混合液，每100mL的混合液中加入1g胰蛋白酶，混匀，然后用0.2μm的无菌滤头过滤待用。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。