一种麻黄药材及其制剂中三种生物碱的含量测定方法

摘要

本发明涉及一种麻黄药材及其制剂中三种生物碱的含量测定方法。其特征：首次以普通的反相色谱柱，非缓冲盐，体积比为1～1.5∶4～4.2∶94.5～95.0的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相，在207±2nm处，同时测定了麻黄药材及其制剂中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和盐酸甲基麻黄碱含量。样品只需含水甲醇超声提取，氧化铝柱除杂，即得到近无色的透明溶液，方法简便、快捷、重现、准确。依据三种生物碱的定量色谱图，基线平稳，波峰分离良好，在20分钟内出峰完毕。与一直采用的缓冲盐流动相、特定的色谱柱和非常规的有机相比例与流速比较，仪器及色谱柱寿命延长，成本降低，检测条件普通化，利于基层单位的普及与推广应用。

说明书

技术领域

本发明属中药质量控制领域，涉及一种麻黄药材及其制剂的质量检测方法，具体 地，涉及一种麻黄药材及其制剂中三种生物碱的含量测定方法。

背景技术

麻黄为麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica Stapf、中麻黄Ephedra intermedia Schrenk  et C.A.Mey.或木贼麻黄Ephedra equisetina Bge.的干燥草质茎。是一种止咳复方制剂中 的常用中药，具发汗散寒，宣肺平喘，利水消肿的功效。用于风寒感冒，胸闷喘咳，风 水浮肿。蜜麻黄润肺止咳。制剂系指麻杏止咳片和金麻杏止咳片，都为止咳的复方制剂。 麻杏止咳片的处方、制法和功能主治如下：

处方：麻黄  600g  苦杏仁  400g  石膏  1200g  炙甘草  300g

制法：以上四味，取石膏60g，粉碎成细粉；剩余石膏与麻黄、炙甘草粉碎成粗 粉，加水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液；苦含仁去油后，加水煎煮2小时， 滤过，滤液与上述滤液合并，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15(70℃)的清膏，减压 浓缩至干膏，粉碎，与石膏细粉及淀粉适量，混匀，制成颗粒，干燥，加入硬脂酸镁适 量，压制成1000片，包糖衣或薄膜衣，即得。

功能主治：镇咳，祛痰，平喘。用于急、慢性支气管炎及喘息等。

金麻杏止咳片的处方、制法和功能主治如下：

处方：金黄芩150-190份  蜜炙枇杷叶280-350份  蜜炙麻黄150-200份

苦杏仁150-200份       前  胡250-320份      桑白皮250-320份

瓜  萎280-310份       桔  梗160-200份      金银花250-300份

竹  茹250-320份

制法：以上十味，枇把叶(蜜炙)、麻黄(蜜炙)、苦杏仁、前胡用10倍量60％乙 醇提取二次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，备用；桑白皮、 竹茹、瓜蒌、桔梗、金银花，加10倍量水煎煮至沸，加入黄芩，煎煮二次，每次2小时， 合并提取液，滤过，滤液浓缩成相对密度1.05-1.10(60℃热测)清膏，加95％7醇，边 加边搅拌，至醇浓度70％，冷藏放置24小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，与醇提液 合并，浓缩至相对密度1.10一1.15(60℃热测)清膏，喷雾干燥。取喷雾粉与适量淀粉， 混匀，制颗粒，压制成1000片，包薄膜衣，即得。

功能主治：清肺化痰，止咳平喘。用于痰热引起的急性气管-支气管炎以及慢性支 气管炎急性发作，症见咳嗽、咳痰，气喘，痰黄或白粘，身热，胸闷，口干，咽痛、尿 黄、便干等，舌红苔黄腻，脉滑数。

文献报道，麻黄的主要有效成分为生物碱类，大体有六种生物碱，即麻黄碱、伪 麻黄碱、去甲基麻黄碱，去甲基伪麻黄碱、甲基麻黄碱，甲基伪麻黄碱。其中含量较高 的是麻黄碱、伪麻黄碱和甲基麻黄碱，其高低顺序是麻黄碱>伪麻黄碱>甲基麻黄碱， 三者之和占到六种麻黄碱总量的80％以上。剩余的甲基伪麻黄碱、去甲基麻黄碱和去甲基 伪麻黄碱含量很低，一般在复方提取制剂中剂量低微，所以目前在复方制剂的法定标准 中，都是以麻黄碱和伪麻黄碱的含量总和控制含量限度的。

在复方制剂中，除了麻黄碱和伪麻黄碱之外，能检测到含量的还有甲基麻黄碱， 而且药效学研究表明：麻黄碱具有中枢神经和交感神经兴奋作用，其发汗平喘、利胆、 升血压、收缩血管等作用都比较强；伪麻黄碱具有很强的抗炎和利尿作用，对鼻粘膜肿 胀引起的鼻塞症方面疗效确实；甲基麻黄碱对气管平滑肌的扩张作用及镇咳作用与麻黄 碱相当，而且具有良好的抗变态反应作用。所以以三种麻黄生物碱的总量，控制药材和 其复方制剂的含量，能较全面地反应药材和制剂的质量。

查阅文献得知，中国药典2010年版一部收载的麻黄药材以及小儿清肺化痰口服 液、小青龙颗粒、风寒止嗽丸等，都是控制麻黄碱和伪麻黄碱的含量总和，麻黄药材含 量测定的色谱柱必须要专门配备，其填充剂是极不常用的极性乙醚连接苯基键合硅胶。 而且这些药材和制剂的流动相全是中国药典2010年版一部附录VI D的(3)项下所不建 议使用的磷酸缓冲盐类，且有机相比例多低于5％，不仅给仪器和色谱柱的使用寿命带来 了危害，还对测定完毕后，色谱柱的冲洗增加了操作步骤。

虽然也有同时测定麻黄药材中五种生物碱(麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱、去 甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱)、四种生物碱(麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱、去甲基 麻黄碱)和三种生物碱(麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱)的报道，但其五种生物碱的 测定需要专门的苯基柱，柱长度为250mm，流动相为磷酸缓冲盐体系，有机相与缓冲盐水 系的比例是4∶96，流速是0.6ml／min；四种生物碱的测定虽为普通的Waters-ODS柱，其 柱长度为250mm，流动相为磷酸缓冲盐体系，有机相与缓冲盐水系的比例是3∶97.25，流 速是0.8ml／min；而三种生物碱的测定为Phenomenex synersi柱，其长度为250mm，流 动相为磷酸缓冲盐体系，有机相与缓冲盐水系的比例是2∶98，流速是1ml／min。由此看 来，多种麻黄碱类成分的同时测定，其各种参数的设定都是药典附录VI D高效液相色谱 法规定参数之外的，都需破常规的单独设定。

在上述背景情况下，为简便、快捷、科学、规范、多指标控制药材与其制剂的质 量，发明了采用普通的色谱柱、非缓冲盐为流动相，在药典附录VI D高效液相色谱法所 规定参数范围内，同时测定麻黄药材及其制剂中三种生物碱的含量。

发明内容

首次以普通的反相色谱柱，非缓冲盐流动相，其体积比为1～1.5∶4～4.2∶ 94.5～95.0的乙腈-甲醇-0.1％磷酸，在207±2nm处，同时测定了麻黄药材及其制剂中 盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和盐酸甲基麻黄碱的含量。依据三种生物碱的定量色谱图， 波峰分离良好，基线平稳，在20分钟内出峰完毕(图1、2、3、4、5)。

通过方法学考察，盐酸麻黄碱的进样量在0.1029-0.686μg，与峰面积呈良好的线 性关系(见图6)，回归方程为：Y=2303175.3X-1526，r=0.9999；盐酸伪麻黄碱进样量在 0.02511-0.1674μg，与峰面积呈良好的线性关系(见图7)，回归方程为Y=2307131X-4611， r=0.9996；盐酸甲基麻黄碱进样量在0.02223～0.1482μg，与峰面积呈良好的线性关系(见 图8)，回归方程为：Y=2054332.3X-1016，r=0.9999。采用加样回收实验，结果表明：盐 酸麻黄碱的平均回收率为100.56％(n=6)，RSD为0.20％(见表1)；盐酸伪麻黄碱的平均 回收率为97.84％(n=6)，RSD为0.94％(见表2)。盐酸甲基麻黄碱的平均回收率为98.45％ (n=6)，RSD为1.05％(见表3)。精密度(见表4)、稳定性(见表5)、重复性(见表6)、 专属性(见图3、4、5)等，经验证均符合方法学要求。适用于麻黄药材及其制剂中的三 种生物碱的定量测定。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：

(1)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比 为1～1.5∶4～4.2∶94.5～95.0的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；柱温：40℃;检测 波长为207nm；按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱与盐酸甲基麻黄碱适量， 精密称定，加体积比为1∶200的盐酸-70％甲醇溶液，制成每1ml含盐酸麻黄碱30～15 μg、盐酸伪麻黄碱10～5μg、盐酸甲基麻黄碱6～3μg的溶液，作为对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备取麻黄药材细粉0.2～0.3g，精密称定，或麻黄制剂 0.5～0.8g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量， 以功率250W，频率33kHz超声处理10～30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足 减失的重量，摇匀，，滤过，精密量取续滤液2ml，置装有100-120目中性氧化铝1～2g 的内径1cm的色谱柱上，用70％甲醇洗脱至10ml的量瓶中至约9ml，加1滴磷酸，用 70％的甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱 仪，测定样品中三种生物碱的含量。

对于麻黄药材优选的测定技术方案为：

(1)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比 为1.5∶4∶94.5的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；柱温：40℃;检测波长为207nm；按 盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备分别取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱与盐酸甲基麻黄碱适 量，精密称定，加体积比为1∶200的盐酸-70％甲醇溶液，制成每1ml含盐酸麻黄碱20 μg、盐酸伪麻黄碱10μg、盐酸甲基麻黄碱3μg的溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备取麻黄药材细粉0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中， 精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，以功率250W，频率33kHz超声处理30分钟， 放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤纸滤过，精密量取续滤液2ml， 置装有100-120目中性氧化铝1.5g的内径1cm的色谱柱上，用70％甲醇洗脱至10ml的 量瓶中至约9ml，加1滴磷酸，用70％的甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜 滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色 谱仪，测定麻黄药材中三种生物碱的含量。

对于麻杏止咳片优选的测定技术方案为：

(1)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比 为1∶4.2∶94.8的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；柱温：40℃；检测波长为207nm；按 盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备分别取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱与盐酸甲基麻黄碱适 量，精密称定，加体积比为1∶200的盐酸-70％甲醇溶液，制成每1ml含盐酸麻黄碱30 μg、盐酸伪麻黄碱10μg、盐酸甲基麻黄碱5μg的溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备取麻杏止咳片20片，除去包衣，精密称定，研细，过 50目筛，取0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加70％甲醇25ml，密塞，称定重 量，以功率250W，频率33kHz超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失 的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置装有100-120目中性氧化铝1.5g的内径 1cm的色谱柱上，用70％甲醇洗脱至10ml的量瓶中至约9ml，加1滴磷酸，用70％的甲 醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色 谱仪，测定麻杏止咳片中三种生物碱的含量。

对于金麻含止咳片优选的测定技术方案为：

(1)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比 为1∶4∶95的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；柱温：40℃；检测波长为207nm；按盐酸 麻黄碱峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备分别取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱与盐酸甲基麻黄碱适 量，精密称定，加体积比为］∶200的盐酸-70％甲醇溶液，制成每1ml含盐酸麻黄碱15 μg、盐酸伪麻黄碱5μg、盐酸甲基麻黄碱3μg的溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备取金麻杏止咳片20片，除去包衣，精密称定，研细，过 50目筛，取0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加70％甲醇25ml，密塞，称定重 量，以功率250W，频率33kHz超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失 的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置装有100-120目中性氧化铝1.8g的内径 1cm的色谱柱上，用70％甲醇洗脱至10ml的量瓶中至约9ml，加1滴磷酸，用70％的甲 醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色 谱仪，测定金麻杏止咳片中三种生物碱的含量。

本发明的原理如下：

利用盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和盐酸甲基麻黄碱，在205±2nm都呈现最大吸 收峰(见图9、10、11)，以207nm为检测波长，该三种生物碱的进样量在一定范围内， 分别与其峰面积呈现良好的线性关系，而用于定量测定。

本发明的创新点及有益效果如下：

(1)首次以普通的反相色谱柱，非缓冲盐流动相，即体积比为1～1.5∶4～4.2∶ 94.5～95.0的乙腈-甲醇-0.1％磷酸，在207±2nm处，同时测定了麻黄药材及其制剂中 盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和盐酸甲基麻黄碱的含量。测定结果提示，该三种生物碱类， 在麻黄药材和制剂中含量是属于比较高的，具有评价质量的测定价值。

(2)查阅文献得知，目前只麻黄药材有测定三种以上生物碱的含量报道，在复方 组成的制剂中，由于药味的增多，成分的干扰，目前都是测定麻黄碱，或麻黄碱和伪麻 黄碱总量的报道，其流动相也多是缓冲盐类，易腐蚀仪器的光学部件以及损坏色谱柱。

(3)本发明的非缓冲盐流动相，有效保护了仪器性能，延长了色谱柱寿命，简化 了检测结束后，色谱柱的冲洗程序。

(4)本发明所采用的普通反相色谱柱与报道的特定色谱柱相比，首先色谱柱的 长度范围扩大，150～250nm长的色谱柱都能应用，且波峰分离都符合要求，不再受色谱 柱品牌的限制，使检测条件普通化，成本降低，利于基层单位的普及与推广应用。

(5)在已报道的麻黄药材中，五种生物碱的测定，有机相的比例是4，流速是 0.6ml／min；四种生物碱的测定，有机相的比例3，流速是0.8ml／min；三种生物碱的测定， 有机相的比例2，流速是1ml／min。不但其有机相比例小于5，而且流速多小于1ml／min， 这样，就会延长测定的运行时间，色谱柱长时间在高比例的含缓冲盐水系，不但会出现 C18链的随机卷曲导致的组分保留值变化，造成的色谱系统不稳定，还会出现色谱柱的理 论塔板数直线下降，波峰形状改变，不符合测定要求，色谱柱报废。因此，本发明流动 相，将有机相的比例落入了中国药典2010年版一部附录VI D项下规定的有机相比例通 常应不低于5％规定，避免了C₁₈链的随机卷曲而导致不良后果，保持了色谱柱的正常使 用寿命。本发明流动相还能有效分离麻黄药材中的六种生物碱(见图2)，但限于与制剂 的一致性，其评价指标才有质量控制意义，选择测定含量较高的三种生物碱。

(6)本发明方法的问世，解决了麻黄药材及其制剂麻杏止咳片和金麻杏止咳片中 多种生物碱同时简便、快捷、低成本测定的难题，实现了多成分、多指标、综合判断药 品质量的目的。还为含麻黄药材的其他制剂，提供了多指标定量测定新途径，具表率与 示范作用。

附图说明

图1三种生物碱对照品HPLC色谱图

图2麻黄药材HPLC色谱图

图3金麻杏止咳片HPLC色谱图

图4麻杏止咳片HPLC色谱图

图5麻杏止咳片空白HPLC色谱图

图6盐酸麻黄碱的线性关系图

图7盐酸伪麻黄碱的线性关系图

图8盐酸甲基麻黄碱的线性关系图

图9盐酸麻黄碱光谱扫描图

图10盐酸伪麻黄碱光谱扫描图

图11盐酸甲基麻黄碱光谱扫描图

图6、图7、图8中，纵坐标为峰面积；横坐标为进样量(μg)

图9、图10、图11中，纵坐标为吸光度单位(mAU)；横坐标为波长(nm)

图1、图2、图3、图4中，1.为盐酸麻黄碱峰，2.为盐酸伪麻黄碱峰，3.为盐 酸甲基麻黄碱峰，4.盐酸甲基伪麻黄碱5.盐酸去甲基麻黄碱6.盐酸去甲基伪麻黄碱

本发明具体实施方式

实施例1：

(1)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积 比为1～1.5∶4～4.2∶94.5～95.0的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；柱温：40℃；检 测波长为207nm；按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱与盐酸甲基麻黄碱适量， 精密称定，加体积比为1∶200的盐酸-70％甲醇溶液，制成每1ml含盐酸麻黄碱30～15 μg、盐酸伪麻黄碱10～5μg、盐酸甲基麻黄碱6～3μg的溶液，作为对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备取麻黄药材细粉0.2～0.3g，精密称定，或麻黄制剂 0.5～0.8g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量， 以功率250W，频率33kHz超声处理10～30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足 减失的重量，摇匀，，滤过，精密量取续滤液2ml，置装有100-120目中性氧化铝1～2g 的内径1cm的色谱柱上，用70％甲醇洗脱至10ml的量瓶中至约9ml，加1滴磷酸，用 70％的甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5～10μl，注入液相 色谱仪，测定样品中三种麻黄碱的含量。测定了市售3批麻黄含量，结果见表7。

实施例2：

(1)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以体积比 为1∶4.2∶94.8的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；柱温：40℃；检测波长为207nm；按 盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备分别取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱与盐酸甲基麻黄碱适 量，精密称定，加体积比为1∶200的盐酸-70％甲醇溶液，制成每1ml含盐酸麻黄碱30 μg、盐酸伪麻黄碱10μg、盐酸甲基麻黄碱5μg的溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备取麻杏止咳片20片，除去包衣，精密称定，研细，过 50目筛，取0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加70％甲醇25ml，密塞，称定重 量，以功率250W，频率33kHz超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失 的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置装有100-120目中性氧化铝1.5g的内径 1cm的色谱柱上，用70％甲醇洗脱至10ml的量瓶中至约9ml，加1滴磷酸，用70％的甲 醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色 谱仪，测定供试品中三种麻黄碱的含量。测定了市售3批麻含止咳片含量，结果见表7。

实施例3：

(1)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比 为1∶4∶95的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相;柱温：40℃；检测波长为207nm；按盐酸 麻黄碱峰计算应不低于3000;

(2)对照品溶液的制备分别取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱与盐酸甲基麻黄碱适 量，精密称定，加体积比为1∶200的盐酸-70％甲醇溶液，制成每1ml含盐酸麻黄碱15 μg、盐酸伪麻黄碱5μg、盐酸甲基麻黄碱3μg的溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备取金麻杏止咳片20片，除去包衣，精密称定，研细， 过50目筛，取0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加70％甲醇25ml，密塞，称定 重量，以功率250W，频率33kHz超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减 失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置装有100-120目中性氧化铝1.8g的内 径1cm的色谱柱上，用70％甲醇洗脱至10ml的量瓶中至约9ml，加1滴磷酸，用70％ 的甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色 谱仪，测定供试品中三种麻黄碱的含量。测定了3批金麻杏止咳片含量，结果见表7。

表1样品中盐酸麻黄碱的回收率试验结果

表2样品中盐酸伪麻黄碱的回收率试验结果

表3样品中盐酸甲基麻黄碱的回收率试验结果

注：为节约对照品，样品的总体积不是25ml，是15ml，在浓度一致情况下，取样量减少。

表4对照品精密度实验结果(峰面积)

表5对照品稳定性实验结果(峰面积)

表6重复性试验结果(mg/g)

表7麻黄药材和制剂的含量测定结果(mg／g)