液相色谱法用柱和血红蛋白类的分析方法

摘要

本发明的目的在于，提供能够廉价地制造、并能够抑制来自生物体的成分的非特异吸附的液相色谱法用柱。此外，本发明的目的还在于，提供使用该液相色谱法用柱的血红蛋白类的分析方法。本发明是一种液相色谱法用柱，其具有柱管和末端接头，所述柱管和所述末端接头由聚乙烯或者聚甲基丙烯酸甲酯制成。

说明书

技术领域

本发明涉及液相色谱法用柱。此外，本发明涉及使用该液相色谱法用 柱的血红蛋白类的分析方法。

背景技术

在有机化学、生物化学、医学等领域中，在样品中的成分测定或分析中 广泛使用液相色谱法。例如，在医学领域中，在测定作为糖尿病诊断指标 的血红蛋白A1c时使用液相色谱法。血红蛋白A1c为血液中的糖与血红蛋 白的β链N末端化学结合的糖化血红蛋白，可以说血红蛋白类中血红蛋白 A1c的比例、即糖化血红蛋白相对于糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白的合 计的比例反映了1～2个月期间的血糖平均值。表示血红蛋白类中血红蛋 白A1c比例的血红蛋白A1c值（%）与血糖值不同，并不是表示一时的变 动，因此，作为糖尿病诊断的指标被广泛使用。

以往，作为在高效液相色谱中使用的柱，主要使用耐压性优良的不锈 钢制的柱。

但是，如果使用不锈钢制的柱测定蛋白质、核酸、糖类等来自生物体的 试样，则会在柱内面上非特异地吸附来自生物体的成分，会对分析产生不 好的影响。特别是，如果在血红蛋白A1c分析时发生对柱内面的非特异吸 附，则无法获得正确的测定值，因此成为较大的问题。因此，如专利文献 1中公开的那样进行利用硅酮树脂等的涂覆处理是有必要的。

此外，专利文献2中，公开了使用以聚醚醚酮（PEEK）为代表的强 度（耐压性）优异的工程塑料的柱。如果使用这样的柱，则能够抑制来自 生物体的成分的非特异吸附。

但是，以PEEK为代表的工程塑料具有价格昂贵的缺点。

因此，期待能够廉价地制作、并能够抑制来自生物体的成分的非特异 吸附的柱。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2000-131302号公报

专利文献2：日本特开平6-229999号公报

发明内容

本发明的目的在于，提供能够廉价地制作、并能够抑制来自生物体的 成分的非特异吸附的液相色谱法用柱。此外，本发明的目的在于，提供使 用该液相色谱法用柱的血红蛋白类的分析方法。

用于解决问题的手段

本发明是一种液相色谱法用柱，其具有柱管和末端接头，上述柱管和 上述末端接头由聚乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯制成。

以下对本发明进行详细描述。

为了抑制来自生物体的成分向柱内面的非特异吸附，来进行正确的测 定，考虑使构成柱的材料为疏水性高的材料（具体而言，水的接触角为90° 以上）。但是，实际上制作由疏水性高的材料制成的柱并进行血红蛋白类 等的试样的测定时，有时分离性能根据材料而发生劣化。此外，当使用疏 水性比较低的材料制作出的柱时，在用于血红蛋白类等试样的测定的情况 下，也能够良好地分离检出测定对象。因此，认为构成柱的材料的疏水性 程度未必会影响血红蛋白类等的分离性能。

因此，本发明人未局限于疏水性的程度，而是对各种材料进行了深入 研究，结果发现在使用聚乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯作为柱管和末端接头的 材料时，能够廉价地制作出抑制了来自生物体的成分的非特异吸附、且可 以进行正确测定的液相色谱法用柱，从而完成了本发明。

本发明的液相色谱法用柱（以下，也称作“本发明的柱”）具有由聚 乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯制成的柱管和末端接头。不仅是疏水性高的聚乙 烯，即使在使用了疏水性低的聚甲基丙烯酸甲酯的情况下，也可抑制来自 生物体的成分的非特异吸附，能够进行正确的测定。此外，聚乙烯和聚甲 基丙烯酸甲酯为常用的树脂，因此本发明的柱能够廉价地制作，可以进行 焚烧处理，因此易于废弃。

使用由聚乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯制成的柱时，对来自生物体的成分 的非特异吸附进行抑制的效果，特别是在血红蛋白类的测定中得以显著地 发挥。即，使用本发明的液相色谱法用柱，在特定的压力条件下进行测定， 由此不会发生柱的破损或者漏液等不良情况，能够以高分离性能分析血红 蛋白类。

作为本发明柱的制造方法，可以举出例如注射成型，挤出成型，切削 加工等。

此外，柱管和末端接头的形状没有特别限定。作为连接柱管和末端接 头的方式，可以列举例如套圈（フェラル）式，拧入式等。

在本发明的柱中充填充填剂粒子后，通过在规定条件下向柱中送液洗 脱液和测定试样，从而对试样进行测定。特别是，当测定血红蛋白类时， 在柱管和末端接头使用由聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯等制 成的柱的情况下，容易发生对柱内面的非特异吸附，而在使用本发明的柱 的情况下能够抑制对柱内面的非特异吸附，因此能够以高分离性能分析血 红蛋白类。

使用本发明柱的血红蛋白类的分析方法也是本发明的一个方面。

本发明的血红蛋白类的分析方法中使用的液相色谱可以通过在具备 洗脱液送液用泵、检测器等的公知液相色谱上，连接充填有充填剂粒子的 本发明的柱而构成。

在本发明的血红蛋白类的分析方法中，分析时柱的通液压力由充填剂 粒子的粒径或粒度分布、柱内径、柱长度、洗脱液的流速等来决定。因此， 由于其压力不能唯一地确定，因而只要在能够获得所期望的分离性能的范 围内适当调整即可，但是为了不发生柱破损或者漏液等不良情况，并能够 以高分离性能分析血红蛋白类，将分析时的柱的通液压力优选设为4.0MPa 以下，更优选设为3.0MPa以下。

需要说明的是，柱的通液压力通过由送液泵与柱之间连接的压力计读 取压力值来测定。

对于给分离性能带来较大影响的充填剂粒子的平均粒径、柱的内径、 柱的长度和洗脱液的送液速度而言，优选在以下的范围内进行调整。

充填剂粒子的平均粒径的优选下限为2μm，优选上限为20μm。充填 剂粒子的平均粒径如果小于2μm，则柱的通液压力变高，有时会发生柱的 破损或漏液等不良情况。充填剂粒子的平均粒径如果超过20μm，则分离 性能降低，用于血红蛋白A1c测定时，有时会出现血红蛋白类的分离变得 不充分的情况。上述充填剂粒子的平均粒径的更优选的下限为5μm，更优 选的上限为15μm。

需要说明的是，充填剂粒子的平均粒径为采用粒度分布测定装置 （Particle Sizing Systems公司制，“Accusizer780”）测定的值。

本发明柱内径的优选下限为2.0mm，优选上限为6.0mm。如果柱内径 小于2.0mm，则柱内流动的流动相的线速度变得过高，柱的通液压力变高， 有时会发生柱的破损或漏液等不良情况。如果柱的内径超过6.0mm，则引 起柱内样品或流动相的过度扩散，有时存在分离性能下降的情况。柱内径 的更优选的下限为3.0mm，更优选的上限为5.0mm。

本发明柱的长度的优选下限为10mm，优选上限为50mm。柱的长度 如果小于10mm，则存在分离性能随着理论塔板数的降低而降低的情况。 柱的长度如果超过50mm，则柱的通液压力变高，有时会发生柱的破损或 漏液等不良情况。柱长度的更优选的下限为15mm，更优选的上限为 40mm。

由送液用泵提供的洗脱液的送液速度的优选下限为0.5mL/分钟，优选 上限为2.5mL/分钟。如果洗脱液的送液速度小于0.5mL/分钟，则由于流速 慢而测定时间变长。如果洗脱液的送液速度超过2.5mL/分钟，则柱的通液 压力变大，有时会产生柱的破损或漏液等不良情况。上述洗脱液的送液速 度的更优选的下限为1.0mL/分钟，更优选的上限为2.0mL/分钟。

作为在本发明的柱中充填的充填剂粒子，可以使用以往公知的离子交 换液相色谱法用的充填剂粒子。其中，优选如日本专利第3990713号中公 开的那种具有离子交换基团、且最表面被臭氧水亲水化处理过的充填剂粒 子。通过使用这样的充填剂粒子，即使柱的通液压力降低也能够以高分离 性能测定血红蛋白类等试样。

在本发明柱的上游侧和下游侧，优选配置用于防止柱内的充填剂粒子 从筒状容器漏出的过滤器。该过滤器并非用于捕捉异物，而只要能够防止 充填剂粒子从筒状容器漏出即可。

作为过滤器，可以举出例如由纸、树脂、金属等制成的过滤器。其中， 优选如日本特开2006-189427号公报中所记载，具有含有孔径不同的3层 的结构的不锈钢制过滤器。

过滤器的过滤面的形状可以为圆形或者其他形状。

在反复使用同一柱测定的情况下，优选在柱的上游侧，设置用于捕捉 异物的预过滤器。预过滤器可以与本发明的柱分别配置，也可以在1个筒 状容器内一体化配置。在任一情况下，预过滤器均以成为柱上游的方式与 装置的配管相结合。

在本发明的血红蛋白类的分析方法中，作为液相色谱所使用的洗脱 液，优选使用含有公知的盐化合物的缓冲液类或有机溶媒类，具体而言， 可以举出例如有机酸、无机酸、和他们的盐类、氨基酸类、Good’s缓冲液 （Good's buffers）等。

作为有机酸可以举出例如柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、苹果酸等。

作为无机酸可以举出例如盐酸、硝酸、硫酸，磷酸，硼酸，醋酸等。

作为氨基酸类可以举出例如甘氨酸、牛磺酸、精氨酸等。

此外，在缓冲液中，此外还可以适当添加通常添加的物质，例如表面 活性剂、各种聚合物、亲水性的低分子化合物，离液离子类等。

进行血红蛋白类的测定时的缓冲液的盐浓度的优选下限为10mmol/L， 优选上限为1000mmol/L。如果缓冲液的盐浓度小于10mmol/L，则无法进 行离子交换反应，有时会发生无法分离血红蛋白类的情况。如果缓冲液的 盐浓度超过1000mmol/L，则有时会发生盐析出而对系统产生不良影响。

通过本发明的血红蛋白类的分析方法，能够测定血红蛋白AO，血红 蛋白A1c，血红蛋白F（胎儿血红蛋白），血红蛋白A2等。此外，能够 测定异常血红蛋白类，例如，血红蛋白S，血红蛋白C，血红蛋白D，血 红蛋白E等。

发明效果

根据本发明，可提供能够廉价制作、并能够抑制来自生物体的成分的 非特异吸附的液相色谱法用柱。在使用不锈钢制柱时，需要采用硅酮树脂 进行涂覆处理等表面处理，而本发明的柱不需要进行这样的表面处理。此 外，由于聚乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯为常用树脂，因而是廉价的，在经济 上的优点也较大。而且，由于本发明的柱可以进行焚烧处理，因此能够容 易地废弃。

此外，根据本发明，可提供使用该液相色谱法用柱的血红蛋白类的分 析方法。根据本发明的血红蛋白类的分析方法，能够抑制来自生物体的成 分的非特异吸附，能够进行正确的测定。

附图说明

图1为使用聚乙烯制的柱测定血红蛋白类而得到的色谱图。

图2为使用聚甲基丙烯酸甲酯制的柱测定血红蛋白类而得到的色谱 图。

图3为使用实施了利用硅酮树脂的涂覆处理的不锈钢制柱测定血红蛋 白类而得到的色谱图。

图4为使用未实施表面处理的不锈钢制柱测定血红蛋白类而得到的色 谱图。

图5为使用聚丙烯制的柱测定血红蛋白类而得到的色谱图。

图6为使用聚对苯二甲酸乙二醇酯制的柱测定血红蛋白类而得到的色 谱图。

图7为使用聚碳酸酯制的柱测定血红蛋白类而得到的色谱图。

图8表示实施例和比较例中各材质的柱与血红蛋白A1c峰的半峰宽之 间的关系的图。

图9表示实施例和比较例中各材质的柱与总峰面积之间关系的图。

具体实施方式

以下列举实施例来进一步详细说明本发明，但本发明并不仅限于这些 实施例。

实施例1、2和比较例1～5

空柱的准备

柱管和末端接头中使用表1所示的材料，准备内径4.6mm，长度15mm 的柱。

需要说明的是，比较例1中不锈钢（SUS316）制柱所实施的利用硅酮 树脂的涂覆处理，是采用SR2410（道康宁公司制）进行的。

表1

  柱材料 实施例1 聚乙烯 实施例2 聚甲基丙烯酸甲酯 比较例1 不锈钢（SUS316）有利用硅酮树脂的涂覆处理 比较例2 不锈钢（SUS316）无表面处理 比较例3 聚丙烯 比较例4 聚对苯二甲酸乙二醇酯 比较例5 聚碳酸酯

充填剂粒子的准备

在3重量%聚乙烯醇（日本合成化学工业公司制）水溶液2000mL中， 添加四甘醇二甲基丙烯酸酯（新中村化学工业公司制）300g、三甘醇二甲 基丙烯酸酯（新中村化学工业公司制）100g、和过氧化苯酰（Kishida化 学公司制）1.0g的混合物，在氮气气氛的反应容器中搅拌的同时，在80℃ 下聚合1小时。

接着，作为具有离子交换基团的单体，将2-甲基丙烯酰胺-2-甲基丙磺 酸（东亚合成公司制）100g、聚乙二醇甲基丙烯酸酯（日油公司制，乙二 醇链n=4）100g溶解于离子交换水中，得到混合物。将得到的混合物进一 步添加到聚合1小时后的上述反应器中，在氮气氛下搅拌的同时，于80℃ 下聚合2小时。使用水和丙酮洗涤得到的聚合组合物，由此得到具有离子 交换基团的粒子。

将得到的具有离子交换基团的粒子10g浸漬于溶解臭氧气浓度为 100ppm的臭氧水300mL中，搅拌30分钟。搅拌结束后，反复进行2次 使用离心分离机（日立制作所公司制，“Himac CR20G”）离心分离、并 除去上清液的操作，得到充填剂粒子。

对于得到的充填剂粒子，使用粒度分布测定装置（Particle Sizing  Systems公司制，“Accusizer780”）测定时，平均粒径为10μm，CV值为 14%。

柱的准备

将得到的充填剂粒子0.5g分散于40mmol/L磷酸缓冲液（pH5.3）20mL 中并进行搅拌而浆料化。5分钟超声波处理后，将全量的浆料注入连接有 空柱（内径4.6mm×长度15mm）的装柱机（AS ONE公司制）。在装柱机 上连接送液泵（GL Sciences公司制，“PU-614”），以8MPa的压力进行 送液，并进行定压充填。

评价

利用液相色谱法的性能评价

采用得到的柱，进行血红蛋白A1c对照样品（Sysmex公司制）的测 定。测定条件如表2所示。此外，将使用各材质的柱进行测定时的色谱图 示于图1～7。

表2

使用聚乙烯（PE）制的柱（图1）和聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制 的柱（图2）的情况下，显示出与实施了利用硅酮树脂的涂覆处理的不锈 钢制柱（图3）同等的分离模式。

另一方面，在使用未实施表面处理的不锈钢制的柱（图4）或聚丙烯 （PP）制的柱（图5）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）制的柱（图6）、 聚碳酸酯（PC）制的柱（图7）的情况下，与图1～3相比较，血红蛋白 A1c峰宽幅化等，分离模式恶化。

实施例和比较例中各材质的柱与血红蛋白A1c峰的半峰宽之间的关 系示于图8。需要说明的是，在图8和后述的图9中，将实施了利用硅酮 树脂的涂覆处理的不锈钢制的柱表示为“SUS316（有处理）”，将未实施 表面处理的不锈钢制柱表示为“SUS316（无处理）”。

对PE制的柱、PMMA制的柱、实施了利用硅酮树脂的涂覆处理的不 锈钢制柱进行比较，明确可知其他的柱的半峰宽变大、且宽幅化。

此外，将各材质的柱与总峰面积的关系示于图9。

需要说明的是，总峰面积的数值，是作为将实施了利用硅酮树脂的涂 覆处理的不锈钢制柱设为100时的值来进行绘制的。

PE制的柱、PMMA制的柱、与实施了利用硅酮树脂的涂覆处理的不 锈钢制柱显示出基本相同的值，但其他的柱显示出明显较低的值。

由此清楚可知，PE制的柱、PMMA制的柱不易引起血红蛋白类的非 特异吸附，可以获得与以往公知的实施了利用硅酮树脂的涂覆处理的不锈 钢制同等的性能。

产业上可利用性

根据本发明，可提供能够廉价地制作、并能够抑制来自生物体的成分 的非特异吸附的液相色谱法用柱。此外，根据本发明，可提供使用该液相 色谱法用柱的血红蛋白类的分析方法。

符号说明

1血红蛋白A1c