超滤联合UPLC-MS/MS法测定人血浆中游离多西他赛浓度

摘要

本发明涉及超滤联合UPLC-MS／MS法测定人血浆中游离多西他赛浓度。本发明提供了测定多西他赛脂质微球注射后血浆中游离多西他赛浓度的方法，所述方法包括超滤(ultrafiltration，UF)步骤和超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS／MS)分析步骤。本发明在不破坏血浆中结合药-游离药平衡的前提下建立了灵敏度高、专属性强、重现性好的UF-UPLC-MS／MS方法。本发明首次建立的测定游离药物浓度的方法在准确度、精密度、专属性、稳定性、提取回收率及基质效应等方面均达到CFDA2005年颁布的《化学药物临床药代动力学研究技术指导原则》对生物样品的分析要求。

说明书

技术领域

本发明涉及血浆中游离多西他赛浓度的测定法，属于分析技术领域。本发明的方法采用超滤联合UPLC-MS／MS对血浆中游离多西他赛浓度进行测定。本发明可用于晚期癌症患者静脉输注多西他赛脂质微球注射液后游离多西他赛浓度的测定。 

背景技术

多西他赛几乎不溶于水，临床的多西他赛制剂如泰索帝以吐温80作为增溶剂，增加溶解度的同时引起不良反应，包括严重的过敏反应、体液潴留等。而多西他赛脂质微球注射液不含有机溶剂和吐温80、显著降低了骨髓毒性、避免了药物与血管内壁的直接接触且能够为重症患者提供必需的脂肪酸和能量。 

现有技术用于测量多西他赛药物浓度的方法大多检测的是总多西他赛浓度。众所周知，血浆中游离药物能够穿越细胞膜，到达靶部位发挥药效，与药物疗效或毒性直接相关。因此，检测静脉输注多西他赛脂质微球注射液后游离的多西他赛药物浓度，而非与血浆蛋白结合的或者脂质微球包裹的药物具有更大的临床意义。 

定量检测结合或游离的紫杉烷类的药物浓度，主要采用超滤法、平衡透析法以及高速离心法等。然而，平衡透析法平衡时间长(例如8-24h，甚至64h)、存在稀释效应以及需要放射性标记(参见例如A.Sparreboom等人，Cancer Res.59(1999)1454.)，高速离心法需要特殊的设备、灵敏度低以及重复性差。 

对于多西他赛游离药物的分析较少，W.J.Loos等人(Clin.Pharmac01.Ther.74(2003)364.)采用平衡透析法研究了在吐温80存在下血浆中游离的多西他赛，他们的方法需要平衡48h，结果显示吐温80显著干扰血浆中游离多西他赛的浓度。M.R.Acharya等人(Anal.Biochem.331(2004) 192.)公开了采用4h平衡时间的平衡透析法。 

为了获得足够的灵敏度，上述方法均需要采用放射性药物标记(³H)和检测仪器(液闪仪)，并且平衡透析法需要很长的平衡时间。 

现有技术中尚未发现无需放射性标记测定晚期癌症患者静脉输注多西他赛脂质微球注射液后游离多西他赛浓度测定的方法。 

为满足临床检测的要求，本领域急需无特殊的设备要求、高通量、样品需求少、方便、快速的多西他赛脂质微球注射后游离多西他赛浓度测定方法。 

发明内容

本发明提供了多西他赛脂质微球注射后直接测量游离多西他赛浓度的方法。本发明的方法灵敏度高、专属性强、快速、重现性好，并且不需要放射性标记及相关特殊仪器，因此适合用于临床测量和监测多西他赛脂质微球注射后游离多西他赛浓度。 

因此，本发明的目的之一在于提供一种肿瘤患者静脉输注多西他赛脂质微球注射液后测定血浆中游离多西他赛浓度的方法。本方法采用超滤联合超高效液相色谱串联质谱法(UF-UPLC-MS／MS)检测晚期癌症患者静脉输注多西他赛脂质微球注射液后血浆中游离多西他赛浓度。本发明在不破坏血浆中结合-游离药物平衡的前提下建立了灵敏度高、专属性强、快速、重现性好的UF-UPLC-MS／MS方法。 

在本发明的方法中，液相条件中流动相优选采用0.2％甲酸-5mM乙酸铵(水相)-0.2％甲酸乙腈(有机相)。加入甲酸能够促进被分析物离子化，提高检测的灵敏度。加入乙酸铵是利用了电解质效应，不仅增加了待测物的离子化效果而且有利于消除色谱峰的拖尾现象。此外，在本发明的方法中采用高效的ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(50mm×2.1mm I.D.，粒径为1.7μm)，提高了分离效率，实现了每个样品的分析时间仅为2.5min，显著增加了分析通量，提高了分析速度，有利于大批量临床样品的快速分析。本发明的方法采用高灵敏度、超快速扫描速度的QTRAP5500质谱系统，定量的检测限低至0.2ng／mL。 

在不破坏正常血浆蛋白结合率的前提下检测血浆中游离药物浓度是 定量分析中的关键。为此，试验中采用超滤的方法实现游离药物与结合药物的分离，配制4个浓度水平的血浆质控样本(200，500，1000，5000ng／mL)进行了分析。试验结果表明，在本发明方法的条件下，血浆中游离药物分数基本保持一致，提示试验操作未破坏结合-游离药物的平衡，所检测的药物浓度能够真实反映体内游离药物的水平。 

在本发明的方法中，采用比文献报道更少的样品体积，例如450μL VS2.0mL。血浆样本于37℃平衡1h，精密吸取450μL血浆样品加入到超滤管的上室并在37℃离心，所得超滤液体积能够满足浓度分析的需要。本发明的方法已经证明，在本发明的条件下定量分析血浆中游离多西他赛浓度所需样品体积显著低于文献报道的血浆样本体积(如2mL)，因此特别适合于临床试验中较少的血浆样本体积分析的目的。 

现有技术中已经报道较低离心力(例如1500g)下进行超滤离心(参见H.van den Bongard等人，Anal.Biochem.324(2004)11.)。然而，本发明令人吃惊地发现优选使用较高离心力，例如2000g以上，如2000-10000g(包括例如2500-9000g，3000-8000g，4000-7000g，4500-6500g等)进行。离心时间可以为0.5-2h(包括例如0.5-1.75h，0.8-1.5h，0.9-1.25h等)。离心温度可在25-37℃下进行。在本发明的条件下，我们发现较高的离心力并没有影响游离药物浓度和游离分数。本发明所建立的测定法在准确度、精密度、专属性、稳定性、提取回收率及基质效应等方面均达到CFDA对生物样品的分析要求，并且显著缩短了分析时间。本发明的方法采用精密吸取450μL血浆样本加入到超滤管的上室，于37℃平衡1h，6000g，37℃离心1h。经3mL叔丁基甲醚液液萃取后，40℃氮气流下挥干，复溶后吸取5μL进行UPLC-MS／MS分析。 

血浆样品的前处理过程是UPLC-MS／MS中获得高灵敏度的关键。在本发明中，可采用蛋白沉淀法、固相萃取法和液液萃取法对血浆样品进行处理。然而，本发明的方法优选采用液液萃取法进行血浆样本的预处理。本发明提供的数据表明采用液液萃取法简便、灵敏、提取回收率高，液液萃取法完全满足试验中对测定的要求。 

因此，本发明提供了测定多西他赛脂质微球注射后血浆中游离多西他赛浓度的方法，所述方法包括超滤步骤和超高效液相色谱串联质谱 (UPLC-MS／MS)分析步骤。本发明的方法可用于分析哺乳动物如大鼠、小鼠、人血浆中游离多西他赛的浓度。 

在本发明方法的优选实施方案中，超滤步骤可以采用300μL-1.8mL的样品进行，例如采用320μL-1.5mL，360μL-1.5mL，380μL-1.2mL，400μL-1.0mL，420μL-0.8mL的样品进行。 

在本发明方法的优选实施方案中，超滤步骤包括在2000-10000g，例如在2500-9000g，3000-8000g，4000-7000g，4500-6500g进行离心的步骤。 

在本发明方法的优选实施方案中，超滤步骤包括进行0.5-2h，例如0.75-1.75h，0.8-1.5h，0.9-1.25h离心。 

在本发明方法的优选实施方案中，超滤步骤包括在4℃、25℃和37℃，优选在37℃进行离心的步骤。 

在本发明方法的优选实施方案中，在所述超高效液相色谱串联质谱分析前通过蛋白沉淀法、固相萃取法和液液萃取法对血浆样品进行处理，优选通过液液萃取法对血浆样品进行处理。 

在本发明方法的优选实施方案中，液液萃取法采用叔丁基甲醚进行。 

在本发明方法的优选实施方案中，超高效液相色谱串联质谱分析采用0.2％甲酸-5mM乙酸铵(水相)-0.2％甲酸乙腈(有机相)为流动相进行梯度洗脱。 

在本发明方法的优选实施方案中，超高效液相色谱串联质谱分析采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱进行。 

在本发明方法的优选实施方案中，超高效液相色谱串联质谱分析中包括内标紫杉醇。 

本发明所建立的超滤-超高效液相色谱串联质谱测定法在准确度、精密度、专属性、稳定性、提取回收率及基质效应等方面均达到CFDA对生物样品的分析要求。特别指出的是，本测定方法利用的血浆样品体积为450μL，分析时间低至2.5min，显著低于文献报道的体积量和时间，较小的样品需求量以及相对较短的分析时间使得本发明适用于高通量检测静脉输注多西他赛脂质微球注射液后血浆中游离多西他赛的浓度。 

本发明首次建立的方法可用于晚期肿瘤患者静脉输注多西他赛脂质微球注射液后血浆中游离多西他赛浓度的测定，为更好的理解药代-药效之 间的关系提供依据，也为将来其他脂质微球形式的新剂型的游离药物浓度检测提供参考。 

附图说明

图1：不同温度条件下多西他赛的游离药物分数。 

图2：不同离心力时多西他赛游离药物分数。 

图3：本发明方法的特异性与专属性。 

图4：多西他赛游离药物浓度与总药物浓度的比较。 

图5：多西他赛和内标紫杉醇的质谱扫描图。 

具体实施方式

为了更加清楚的对本发明进行说明，以下通过具体实施实例对本发明的具体实施方式进行更为详细的说明。但是应该理解，以下所述具体实施实例仅用于本发明进行示例性说明，而非用于本发明进行任何性质限定，其中所用材料、试剂、仪器及操作条件仅为代表性的，其并不限于所列举的情况。所属技术领域的技术人员通过阅读以下说明可以对本发明做出不脱离本发明权利要求所限定的保护范围的改动和改进，这些改动和改进也处于本发明所要求保护的范围内。 

1仪器、材料与试剂 

1.1仪器Waters超高效液相色谱仪串联QTRAP5500质谱检测器，美国Waters公司和AB Sciex公司；氮吹仪，杭州奥盛有限公司；MillQ-Direct8超纯水系统，美国密理博公司；固定转角离心机，美国Thermo Scientific公司。 

1.2样品与试剂多西他赛(纯度>98％)、紫杉醇(纯度>98％)，购于中国药品生物制品检定所；HPLC级叔丁基甲醚、甲醇、乙腈均购于美国Fisher Scientific公司；ultra-0.5超滤管(截留分子量为10KDa)，购于美国密理博公司。 

2实验部分 

2.1超滤条件分析根据临床静脉输注多西他赛脂质微球注射液后 血浆中总的药物浓度范围，配制至少3个浓度水平的血浆质控样品(200，500，1000，5000ng／mL)，用于分析超滤过程。在选择离心温度时，我们考察了模拟血浆样品在4℃、25℃和37℃时血浆游离药物分数，同时也考察了不同的离心力(2000，6000和10000g)、不同的离心时间(30和60min)对游离分数的影响。 

2.2血浆样品预处理取7mL离心管，加入50ng／mL内标溶液10μL及20μL工作液，加入经超滤去除血浆蛋白的超滤液血浆样品200μL，涡旋1min，混合均匀。然后加入叔丁基甲醚3mL，涡旋震荡10min，4000rpm离心10min。取上层有机相2mL，转移至干净的EP管中，于40℃氮气流下挥干，残留物用200μL甲醇复溶，涡旋震荡1min，于12000rpm离心10min，除去残余杂质，吸取50μL上清液于样品瓶中，取上清液5μL进样进行UPLC-MS／MS分析，记录质量色谱图及化合物的峰面积，采用内标法计算多西他赛的浓度。 

2.3UPLC-MS／MS条件 

色谱条件：采用高效的ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱(50mm×2.1mm I.D.，粒径为1.7μm)，柱温为35℃。流动相为A相(水，含有0.2％的甲酸和5mM乙酸铵)：B相(乙腈，含有0.2％的甲酸)=90∶10(v∶v)。流速为0.3mL／min，进样量为5μL。采用梯度洗脱，分析时间为2.5min。 

质谱条件：采用电喷雾离子源(Electrospray ionization，ESI)，在正离子电离模式下，选用多反应监测模式(multiple reaction monitoring，MRM)的质谱扫描方式进行测定，每个MRM通道的扫描时间为100ms，多西他赛和内标紫杉醇的母、子离子对的质荷比分别为：m／z808.8→527.1(多西他赛)和m／z854.6→285.9(紫杉醇，IS)，保留时间分别为1.32min、1.32min。对多西他赛和内标紫杉醇的质谱扫描图见下图。 

3结果 

3.1超滤条件的优化为了保证超滤方法适用于分离结合药物与游离药物，本发明通过血浆质控的游离分数比较(表1)，对超滤的条件进行分析。其中，当血浆药物浓度为10000ng／mL时游离药物浓度超出标准曲线上限，所以最终确定的血浆质控样品的浓度分别为200、500、1000和5000 ng／mL。不同超滤温度对游离分数的影响见图1，随着温度的升高游离分数呈现升高趋势，为了不破坏体内游离-结合药物的平衡，最终采用37℃下进行离心，因为此温度是正常人体的温度，更好的模拟了人体的真实状态。我们也对超滤的时间、离心力进行考察，结果见表2和图2，优选样品的超滤过程是在6000g，离心60min。疏水性药物对超滤膜的非特异性结合是超滤方法的关键因素，本发明中采用甲醇配制了低、中、高浓度的质控样品进行非特异性结合的考察，结果表明在本试验条件下非特异性结合不干扰未知样品的测定。 

表1超滤条件的血浆质控浓度分析 

表2超滤条件的超滤时间分析 

3.2方法学验证 

3.2.1专属性本方法中待测物与内标的专属性以标准曲线最低浓度 点与同法操作的空白血浆超滤液进行对比进行评价。双空白血浆超滤液、空白血浆超滤液加入内标紫杉醇(50ng/mL)、低定量下限(LLOQ，0.5ng／mL)时和静脉输注多西他赛脂质微球注射液后患者血浆超滤液的色谱图见图3。以上结果表明，方法的专属性好，空白血浆超滤液中内源性物质不干扰药物浓度的检测，多西他赛和内标的保留时间1.32min。图3显示了方法的特异性与专属性。 

3.2.2线性与灵敏度180μL健康人血浆超滤液中加入多西他赛工作液20μL，加入内标溶液(50ng／mL)10μL，配制成相当于浓度为0.5、1、2、10、20、100和200ng／mL的样品，按照2.3项下进行UPLC-MS／MS分析，用加权(W=1／X²)最小二乘法进行回归计算，采用内标法，求得直线回归方程，即为标准曲线。本方法的线性范围为0.5～200ng／mL，相关系数r²>0.99。本方法最低检测限和最低定量下限分别为0.2ng／mL(S／N=3)和0.5ng/mL(S／N=10)。 

3.2.3精密度与准确度按照上述操作，制备多西他赛低、中、高3个浓度(1.5、20、150ng／mL)的质控样品，每个浓度平行5样品分析，连续测定3个批次，计算方法的批内、批件精密度(RSD％)和准确度(RE％)，分析结果如表3。如表所示，批内、批件精密度准确度的低质控浓度均在±20％之内，中高质控浓度均在±15％之内，说明本方法具有良好的精密度和准确度，符合生物样品定量分析的要求。