组合物和用于分离、表征且施用可溶性含硒糖蛋白的方法

摘要

本发明涉及可溶性硒组合物及其生产、分离和纯化方法。特别地，本发明提供了制备水溶性含硒糖蛋白的方法（例如经由从富硒酵母中提取含硒糖蛋白）、经由将水溶性含硒糖蛋白与缺硒组合物掺合补充缺硒组合物的方法、包含水溶性含硒糖蛋白的组合物及其施用方法。

说明书

本申请是于2011年3月18日提交的美国专利申请系列号 13/051,646的部分继续申请并且要求其的优先权，所述美国专利申请号 13/051,646要求于2010年3月18日提交的美国临时专利申请系列号 61/315,265的优先权，所述申请各自通过引用在此整体并入。

发明领域

本发明涉及可溶性硒组合物及其生产、分离和纯化方法。特别地， 本发明提供了制备水溶性含硒糖蛋白的方法（例如经由从富硒酵母中提 取含硒糖蛋白）、经由将水溶性含硒糖蛋白与缺硒组合物掺合补充缺硒 组合物的方法、包含水溶性含硒糖蛋白的组合物及其施用方法。

发明背景

硒是对于人中的适当生理功能重要的微量元素。硒通过可以具有不 同硒含量的饮食摄入。

已知硒在支持生理代谢、生长、生殖健康和免疫中起关键作用。硒 掺入不同有机分子内，包括例如氨基酸例如1-硒代甲硫氨酸、硒代半胱 氨酸和硒代胱氨酸。因此，硒可以是蛋白质的构成部分，所述蛋白质中 的许多对机体具有结构意义。此外，硒是许多酶中的重要成分，所述酶 影响人中的代谢、生殖、癌症预防和免疫防御（参见例如Rayman，M， Lancet356:233-241（2000））。

许多研究已尝试揭示起因于低水平硒摄入的潜在健康利益。例如， 低浓度的无机形式的硒已显示一些潜在的健康利益（参见例如Furnsinn 等人，Int.J of Obesity and Related Metab.Dis.，19，458-463 （1995））。然而，在升高剂量水平时，有利效应逆转并且有害毒性体 现。

经过过去二十年的研究已暗示当以仅超过营养需求5至10倍的剂 量提供给动物时，硒在癌症发生率的减少中是有效的，（参见例如 El-Bayoumy，The role of selenium in cancer prevention， Philadelphia，Lippincott，1-15，1991）。在动物模型系统中使用硒 的化学预防研究已指示这种元素对于大多数（如果并非全部）器官系统 是有效的，并且保护不受致癌效应（参见例如El-Bayoumy，The role of  selenium in cancer prevention，Philadelphia，Lippincott，1-15， 1991。流行病学调查和补充试验也已支持其在降低肝、结肠、前列腺和 肺癌的发生率中的功效（参见例如Yu等人Biol Trace Elem Res，56： 117-124（1997）；Clark等人，J Am Med Assoc，276：1957-1963（1996）； Yoshizawa等人，J Natl Cancer Inst，90：1219-1224,（1998）；Brooks, 等人，J Urol，166：2034-2038,（2001））。其他研究已证实硒减少 对于癌症无有利效应（参见例如Garland等人，J.Am.Coll Nutr.， 12：400-11（1993）；Ghadirian等人，Cancer Detect Prev，24：305-13 （2000））。

已查明了多种形式的硒。这些包括无机硒例如亚硒酸钠和有机来源 包括硒酵母。在无机和有机硒的毒性之间存在显著差异，无机化合物通 常更不有效地被吸收且利用，并且也比有机来源的硒更毒性。

发明概述

本发明涉及可溶性硒组合物及其生产、分离和纯化方法。特别地， 本发明提供了制备水溶性含硒糖蛋白的方法（例如经由从富硒酵母中提 取含硒糖蛋白）、经由将水溶性含硒糖蛋白与缺硒组合物掺合补充缺硒 组合物的方法、包含水溶性含硒糖蛋白的组合物及其施用方法。

相应地，在一些实施方案中，本发明提供了用于制备可溶性含硒糖 蛋白的方法，其包括：提供富硒酵母，使富硒酵母暴露于酸性条件随后 离心，以生成i）包含酸不溶性材料的团块；和ii）包含在酸性条件下 可溶的富硒酵母提取物的液相；经由升高液相的pH从包含在酸性条件 下可溶的富硒酵母提取物的液相中沉淀含硒糖蛋白，和（d）从液相中 分离沉淀的含硒糖蛋白。在一些实施方案中，使富硒酵母暴露于酸性条 件在大于室温的温度（例如大于约20-25℃）下发生。本发明并不受在 其下富硒酵母暴露于酸性条件的大于室温的温度限制。事实上，可以使 用多个温度，包括但不限于约30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、90、95、97、99℃或更热）。类似地，本发明并不受 富硒酵母暴露于其下的酸性条件限制。在一些实施方案中，使富硒酵母 暴露于其中pH是约6.5、约6、约5.5、约5、约4.5、约4、约3.5、 约3、约2.5、约2、约1.5、约1或更低的条件。在优选实施方案中， 使富硒酵母暴露于酸性条件包括使富硒酵母暴露于pH1.5。在一些实施 方案中，使富硒酵母暴露于酸性条件发生一定时间段。本发明并不受在 其下使富硒酵母暴露于酸性条件的时间量限制。在一些实施方案中，使 富硒酵母暴露于酸性条件约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 14、16、18、20、22、24或更多小时。在一些实施方案中，使富硒酵母 暴露于酸性条件一至二十四小时。在一些实施方案中，使富硒酵母暴露 于酸性条件五至十小时。在优选实施方案中，使富硒酵母暴露于酸性条 件约八小时。在一些实施方案中，利用酸性缓冲液和/或酸的添加产生 和/或维持酸性条件。本发明并不受利用的酸的类型限制。事实上，可 以使用任何酸。在一些实施方案中，酸是盐酸，尽管可以使用任何酸。 在一些实施方案中，含硒糖蛋白经由升高液相的pH从包含在酸性条件 下可溶的富硒酵母提取物的液相中沉淀。在一些实施方案中，经由离心 使沉淀的含硒糖蛋白与液相分离，以形成沉淀的含硒糖蛋白团块，随后 为从液相中去除沉淀的含硒糖蛋白。本发明并不受提取物的pH升高以 便从液相中沉淀含硒糖蛋白的量或程度限制。在一些实施方案中，液相 的pH升高至1.85。在一些实施方案中，液相的pH升高至3.0。在一些 实施方案中，液相的pH升高至4.0。在一些实施方案中，液相的pH升 高至6.0。在一些实施方案中，在多个pH条件下使含硒糖蛋白从液相中 沉淀且分离，以生成可溶性含硒糖蛋白的多个pH依赖性级分。例如， 在一些实施方案中，包含在酸性条件下可溶的富硒酵母提取物的单个液 相用于产生在第一个pH（例如pH1.85）下沉淀的可溶性含硒糖蛋白的 第一个级分，在第二个pH（例如pH3.0）下沉淀的可溶性含硒糖蛋白 的第二个级分，在第三个pH（例如pH4.0）下沉淀的可溶性含硒糖蛋 白的第三个级分，和在第四个pH（例如pH6.0）下沉淀的可溶性含硒 糖蛋白的第四个级分。在一些实施方案中，经由升高液相的pH从液相 中沉淀含硒糖蛋白包括液相的多个顺次pH依赖性沉淀反应。在一些实 施方案中，包含可溶性含硒糖蛋白的组合物仅含有含硒糖蛋白的单个pH 依赖性级分（例如来自包含在酸性条件下可溶的富硒酵母提取物的液相 的可溶性含硒糖蛋白在pH4.0下沉淀）。在一些实施方案中，包含可 溶性含硒糖蛋白的组合物含有含硒糖蛋白的两个或更多pH依赖性级分 （例如来自包含在酸性条件下可溶的富硒酵母提取物的液相的可溶性 含硒糖蛋白在两个或更多不同pH值下沉淀）。

在一些实施方案中，富硒酵母是干燥的、不能存活的含有2%或更少 的无机硒的富硒酵母。

本发明还提供了根据本发明制备的可溶性含硒糖蛋白的组合物。例 如，在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明的可溶性含硒糖蛋白 的缺硒组合物。在一些实施方案中，将本发明的可溶性含硒糖蛋白加入 缺硒组合物中和/或与缺硒组合物混合。本发明并不受本发明的可溶性 含硒糖蛋白加入其中或与其混合的缺硒组合物或材料的类型限制，此类 组合物或材料包括但不限于饮食补充剂、药物、药剂、粮食、动物饲料 和其他类型的材料。在一些实施方案中，加入或混合（例如掺合）含硒 糖蛋白包括将含硒糖蛋白和一个或多个其他类型的硒掺合到组合物内。 在一些实施方案中，将本发明的可溶性含硒糖蛋白加入组合物中和/或 与组合物混合，所述组合物含有硒（例如以增加和/或补充硒的总量）。

本发明还提供了包含可溶性含硒糖蛋白和载体的组合物。在一些实 施方案中，含硒糖蛋白是含硒糖蛋白的特异性pH依赖性级分。本发明 并不受利用的载体类型限制。事实上，可以使用多种载体，包括但不限 于树枝状聚合物、聚合物泡囊（polymerosomes）、纳米颗粒、缓慢释 放聚合物、纳米胶囊和/或分子印迹聚合物。在一个优选实施方案中， 载体是缓慢释放聚合物。在另一个优选实施方案中，载体是分子印迹聚 合物。在另外一个优选实施方案中，载体是用于封装含硒糖蛋白的聚合 物泡囊（polymerosome）。本发明并不受使用的聚合物泡囊类型限制。 事实上，可以利用本领域已知的任何聚合物泡囊。在一些实施方案中， 聚合物泡囊包含聚（环氧乙烷）（PEO）嵌段共聚物。然而，本发明并 不受此限制。可以利用任何已知的嵌段共聚物，包括例如聚（乙基乙烯） （PEE）、聚（丁二烯）（PB或PBD）、聚（苯乙烯）（PS）和聚（异 戊二烯）（PI）。在一些实施方案中，聚合物包含聚（ε-己内酯）（PCL） 二嵌段共聚物。在一些实施方案中，聚合物泡囊包含基于聚（环氧乙烷） -嵌段-聚（ε-己内酯）（PEO-b-PCL）的二嵌段共聚物。在一些实施方 案中，聚合物泡囊包含其为三嵌段、四嵌段、五嵌段或至少六嵌段共聚 物的嵌段共聚物。在一些实施方案中，聚合物泡囊衍生自聚（乳酸）、 聚（乙交酯）、聚（乳酸共乙醇酸）和/或聚（3-羟基丁酸酯）与PEO 的偶联。本发明并不受聚合物泡囊封装的含硒糖蛋白的大小限制。多个 尺寸在本发明的组合物和方法中有用，包括但不限于其为直径约 50-300nm的聚合物泡囊封装的含硒糖蛋白，尽管可以使用更大（例如约 350nm、400nm、500nm或更大）和更小（例如约40nm、30nm、20nm 或更小）的聚合物泡囊封装的含硒糖蛋白。

附图简述

图1显示了通过本发明的实施方案的酸提取和后续沉淀来自 SEL-PLEX的可溶性含硒糖蛋白（SGPs）的顺次制备。

图2显示了本发明的实施方案的含硒糖蛋白的pH依赖性沉淀的过 程。

图3显示了相对于基本对照，代表实施例3的表3和4中所述的不 同硒补充处理对鸡胸骨骼肌中的基因表达水平的作用的热图。

图4显示了SGP级分pH4.0和SEL-PLEX对胸肌中概况分析的基因 表达的不同作用的文氏图（Venn diagram）。

图5显示了鉴定为通过亚硒酸钠（SS）、SEL-PLEX（SP）和含硒糖 蛋白（SGP）级分pH4.0共同调节的示例性基因。

图6显示了鉴定为通过SEL-PLEX（SP）和含硒糖蛋白（SGP）级分 pH4.0共同调节而不是通过亚硒酸钠（SS）调节的示例性基因。

图7显示了鉴定为通过含硒糖蛋白（SGP）级分pH4.0独特调节而 不是通过亚硒酸钠（SS）或SEL-PLEX（SP）调节的示例性基因。

图8显示了鉴定为通常通过含硒糖蛋白（SGP）级分pH4.0独特调 节而不是通过亚硒酸钠（SS）或SEL-PLEX（SP）调节的示例性基因。

图9显示了鉴定为通常通过含硒糖蛋白（SGP）级分pH4.0独特调 节而不是通过亚硒酸钠（SS）或SEL-PLEX（SP）调节的示例性基因。

图10显示了鉴定为通常通过含硒糖蛋白（SGP）级分pH4.0独特 调节而不是通过亚硒酸钠（SS）或SEL-PLEX（SP）调节的示例性基因。

图11显示了相对于基本对照，代表实施例3的表3和4中所述的 不同硒补充处理对肝组织中的基因表达水平的作用的热图。

图12描述了经过两周时期在pH5.1和pH7.4时来自纳米胶囊的 SGP释放。

图13显示了在pH7.4时聚合物泡囊封装的含硒糖蛋白的致冷透穿 隧式显微镜术（cryo-TEM）图像。

定义

为了促进本发明的理解，下文定义了许多术语和短语。

如本文使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”都指通过共价 “肽键”连接的氨基酸的基本序列。一般而言，肽由少数氨基酸一般为 2-50个氨基酸组成，并且短于蛋白质。术语“多肽”包含肽和蛋白质。

术语“糖蛋白”或“糖肽”指含有共价附着至多肽链的一个或多个 碳水化合物残基的蛋白质或肽。术语“含硒蛋白质”或“含硒肽”指含 有一个或多个硒原子的蛋白质或肽。一般地，将硒原子掺入蛋白质内的 含硒氨基酸包括硒代半胱氨酸和硒代甲硫氨酸内。

术语“含硒糖蛋白”、“含硒糖肽”或“SGP（s）”指掺入一个或 多个硒原子的糖蛋白或糖肽。一般地，“含硒糖蛋白”包含一种或多种 含硒氨基酸。“含硒糖蛋白”可以包括以任何数目的不同形式的许多碳 水化合物。

术语“样品”和“样本”以其最广泛含义使用并且包含得自任何来 源的样品或样本。如本文使用的，术语“样品”用于指得自动物（包括 人）的生物样品，并且包含液体、固体和组织。在本发明的一些实施方 案中，生物样品包括脑脊髓液（CSF）、浆液、尿和唾液、血液和血液 产品例如血浆、血清等。然而，这些例子不应解释为限制与本发明有用 的样品类型。

如本文使用的，术语“酵母”和“酵母细胞”指在真菌界中分类的 真核微生物，具有细胞壁、细胞膜和细胞内组分。酵母不形成特定分类 学或系统发育分组。目前已知约1,500个物种；估计所有酵母物种中的 仅1%已得到描述。术语“酵母”通常视为酿酒酵母（S.cerevisiae） 的同义词，但酵母的系统发育多样性通过其在分界子囊菌纲和担子菌纲 中的放置显示。术语“酵母”包含啤酒酵母、蒸馏酵母和面包酵母。芽 殖酵母（“真酵母”）分类在糖霉菌目中。大多数酵母物种通过芽殖无 性繁殖，尽管一些通过二分裂繁殖。酵母是单细胞的，尽管一些物种通 过一串连接的芽殖细胞（称为假菌丝或假的菌丝）的形成而变成多细胞 的。酵母大小可以取决于物种而极大变化，一般测量为直径3-4μm，尽 管一些酵母可以达到超过40μm。

如本文使用的，术语“富硒酵母”和“硒化酵母”指在含有无机硒 盐的培养基中培养的任何酵母（例如酿酒酵母）。本发明并不受使用的 硒盐限制。事实上，多种硒盐考虑在本发明中是有用的，包括但不限于 亚硒酸钠或硒酸钠。游离硒代甲硫氨酸（例如不与细胞或酵母结合）也 可以用作富硒酵母的硒来源，因为酵母不掺入这种形式的硒。在培养过 程中，由于在硒和硫之间的化学相似性，酵母在通常为细胞内的含硫有 机化合物中掺入硒代替硫。在此类酵母制剂中的含硒化合物是掺入多肽 /蛋白质内的硒代甲硫氨酸。以硒代甲硫氨酸的形式存在于此类制剂中 的总细胞硒量将改变，但可以是10-100%、20-60%、50-75%和60-75%。 硒化酵母制剂中剩余部分的有机硒占优势地由在用于硒代甲硫氨酸生 物合成的途径中的中间产物构成。这些包括但不限于硒代半胱氨酸、胱 硒醚、硒代高半胱氨酸和硒代腺苷硒代甲硫氨酸。在成品中的残留无机 硒量一般相当低（例如<2%）。

如本文使用的，术语“SEL-PLEX”指在分批补料发酵中培养的干燥 的、不能存活的富硒酵母（登记号CNCM I-3060的酿酒酵母，Collection  Nationale De Cultures De Microorganismes（CNCM），Institut  Pasteur，Paris，法国），所述分批补料发酵提供增加量的甘蔗糖蜜和 硒盐，其方式使硒盐对酵母生长率的有害作用降到最低且允许无机硒最 佳掺入细胞有机材料内。消除残留无机硒（例如使用严格洗涤过程）且 不超过总含硒量的2%。

如本文使用的，术语“有机硒”指其中硒原子直接连接至碳原子的 任何有机化合物。

如本文使用的，术语“无机硒”一般指其中硒处于-2、+4和+6氧 化状态的任何硒盐（例如亚硒酸钠、硒酸钠）。

如本文使用的，术语“宿主”、“受试者”和“患者”指研究、分 析、测试、诊断或处理的任何动物，包括但不限于人和动物（例如灵长 类动物、犬、猫、牛、马、绵羊、家禽、鱼、甲壳类动物等）。如本文 使用的，术语“宿主”、“受试者”和“患者”可互换使用，除非另 有说明。

如本文使用的，术语“w/w”（“重量/重量”）指在重量基础上在 组合物中给定物质的量。例如，包含0.02%w/w饮食饲料补充剂的动物 饲料意指饮食饲料补充剂的质量是动物饲料总质量的0.02%（例如在 999,800克动物饲料中的200克饮食饲料补充组合物）。

如本文使用的，术语“纯化的”或“纯化”指从样品中去除组分。 例如，酵母细胞壁通过去除非酵母细胞壁组分（例如质膜和/或酵母细 胞内组分）进行纯化；它们还通过去除除了酵母细胞壁外的污染物或其 他试剂进行纯化。非酵母细胞壁组分和/或非酵母细胞壁污染物的去除 导致样品中酵母细胞壁或其组分的百分比的增加。

如本文使用的，术语“有效量”指足以实现有利或所需结果的组合 物（例如包含本发明的含硒糖蛋白）量。有效量可以在一次或多次施用、 应用或剂量中施用，并且不预期限制于具体制剂或施用途径。

如本文使用的，术语“生物利用度”指对于生物体可获得或达到大 循环的分子或组分的部分。当分子或组分静脉内施用时，它的生物利用 度是相当高的。然而，当分子或组分经由其他途径（例如经口）施用时， 它的生物利用度降低（由于不完全吸收和首过代谢）。在营养设置中， 生物利用度指营养素的吸收和利用率。不同形式的相同营养素例如可以 具有不同生物利用度。

如本文使用的，术语“饲料”、“粮食”、“动物饲料”和“饲料” 指由动物消耗且对动物的饮食贡献能量和/或营养素的材料。例子包括 但不限于全混合日粮（TMR）、草料、小球、浓缩剂、预混合料、副产 品、谷类、蒸馏谷类、糖蜜、纤维、粗饲料、草、干草、去壳谷粒、叶、 膳食、可溶物和补充剂。

如本文使用的，术语“食物补充剂”、“饮食补充剂”、“饮食补 充组合物”等指配制为饮食或营养补充剂的食物产品，以用作人或动物 饮食的部分，例如作为动物饲料的附加物。

如本文使用的，术语“施用”指对受试者（例如受试者或体内、体 外或离体细胞、组织和器官）给予药物、前体药物或其他试剂或治疗处 理（例如本发明的组合物）的动作。对人体的示例性施用途径可以是通 过眼睛（眼）、口（经口）、皮肤（局部或经皮）、鼻（经鼻）、肺（吸 入）、口腔粘膜（颊）、耳、直肠、阴道、通过注射（例如静脉内、皮 下、肿瘤内、腹膜内等）等。

如本文使用的，术语“共施用”指给受试者施用至少两种试剂（例 如包含本发明的含硒糖蛋白和一种或多种其他试剂例如抗生素、治疗剂 （例如药物或药剂）或其他生物活性化合物的组合物）或治疗。在一些 实施方案中，两种或多种试剂或治疗的共施用是同时的。在其他实施方 案中，第一种试剂/治疗在第二种试剂/治疗前施用。本领域技术人员应 当理解使用的多种试剂或治疗的制剂和/或施用途径可以改变。用于共 施用的合适剂量可以通过本领域技术人员容易地决定。在一些实施方案 中，当试剂或治疗共施用时，各自试剂或治疗以低于对于其单独施用合 适的剂量施用。因此，在其中试剂或治疗的共施用降低潜在有害（例如 毒性）试剂的必要剂量的实施方案中，和/或当两种或多种试剂的共施 用导致受试者经由其他试剂的共施用对试剂之一的有利效应的致敏作 用时，共施用是尤其希望的。

如本文使用的，术语“治疗”或语法等价物包含疾病（例如神经变 性疾病）症状的改善和/或逆转。当在本发明的筛选方法中使用时，引 起与疾病相关的任何参数中的改善的化合物因此可以鉴定为治疗化合 物。术语“治疗”指治疗处理和预防性或预防措施。例如，可以获益于 用本发明的组合物和方法治疗的那些包括已具有疾病和/或病症（例如 神经变性疾病、糖尿病或认知功能的缺乏或丧失）的那些，以及其中待 预防（例如使用本发明的预防处理）疾病和/或病症的那些。

如本文使用的，术语“处于疾病的危险中”指倾向于经历特定疾病 的受试者（例如人）。这种倾向可以是遗传的（例如经历疾病的特定遗 传趋势，例如可遗传病症），或由于其他因素（例如年龄、重量、环境 条件、暴露于环境中存在的有害化合物等）。因此，不预期本发明限制 于任何特定危险，也不预期本发明限制于任何特定疾病。

如本文使用的，术语“患有疾病”指经历特定疾病的受试者（例如 人）。不预期本发明限制于任何特定体征或症状和疾病。因此，预期本 发明包含经历任何范围的疾病（例如从亚临床表型到成熟疾病）的受试 者，其中受试者显示出与特定疾病相关的至少一些标记（例如体征和症 状）。

如本文使用的，术语“疾病”和“病理状态”可互换使用，以描述 与活动物或其任何器官或组织的正常状态的任何损害相关的状态、体征 和/或症状，其中断或修饰正常功能的性能，并且可以是针对环境因素 （例如辐射、营养不良、工业危害或气候）、特定传染源（例如蠕虫、 细菌或病毒）、生物体的先天不足（例如多种遗传异常）、或这些及其 他因素的组合的应答。

术语“化合物”指任何化学实体、药剂、药物等，其可以用于治疗 或预防躯体功能的疾病、病、患病或病症。化合物包含已知和潜在的治 疗化合物。通过使用本发明的筛选方法筛选可以将化合物测定为治疗 的。“已知治疗化合物”指已显示（例如通过动物试验或施用于人的先 前经历）在此类治疗中是有效的治疗化合物。换言之，已知治疗化合物 并不限于在疾病（例如癌症、神经变性疾病等）治疗中有效的化合物。

如本文使用的，术语“试剂盒”在提及试剂和其他材料的组合中使 用。考虑试剂盒可以包括试剂例如营养素和药物以及施用装置。不预期 术语“试剂盒”限制于试剂和/或其他材料的特定组合。

如本文使用的，术语“毒性”指与毒物施用前的相同细胞或组织相 比较，对受试者、细胞或组织的任何不利或有害作用。

如本文使用的，术语“药物组合物”指活性剂（例如包含含硒糖蛋 白的组合物）与惰性或活性载体的组合，使得组合物尤其适合于体外、 体内或离体诊断、预防和/或治疗用途。

如本文使用的，术语“药学可接受的”或“药理学可接受的”指当 施用于受试者时，基本上不产生不良反应例如毒性、变应性或免疫反应 的组合物。

如本文使用的，术语“局部”指本发明的组合物应用于皮肤表面以 及粘膜细胞和组织（例如牙槽、颊、舌、咀嚼或鼻粘膜、以及衬里中空 器官或体腔的其他组织和细胞）。

如本文使用的，术语“药学可接受的载体”指任何标准药学载体， 包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂（例如油/水或水/油乳剂）、 和多个类型的湿润剂、任何和所有溶剂、分散介质、包衣、十二烷基硫 酸钠、等渗和吸收延迟剂、崩解剂（例如马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠） 等。组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。载体、稳定剂和佐剂的例子例 如在通过引用合并入本文的Martin，Remington's Pharmaceutical  Sciences，第15版，Mack Publ.Co.，Easton，Pa.（1975）中描述。 在一些实施方案中，粮食（例如饮食材料和/或处理）充当载体（例如 本发明的含硒糖蛋白组合物的）。

如本文使用的，术语“药学可接受的盐”指本发明的化合物的任何 盐（例如通过与酸或碱反应获得），其在靶受试者（例如哺乳动物受试 者、和/或体内或离体细胞、组织或器官）中是生理学耐受的。本发明 的化合物的“盐”可以衍生自无机或有机酸和碱。酸的例子包括但不限 于盐酸、氢溴酸、硫酸、延胡索酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水 杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、 甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其他酸例如草酸虽然 自身不是药学可接受的，也可以在盐的制备中用作获得本发明的化合物 及其药学可接受的酸加成盐中的中间产物。碱的例子包括但不限于碱金 属（例如钠）氢氧化物、碱土金属（例如镁）氢氧化物、铵和式NW₄⁺的 化合物，其中W是C_1-4烷基等。盐的例子包括但不限于：乙酸盐、己二 酸盐、海藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸 盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、 十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、氟代庚酸盐、甘油磷酸盐、 半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、2-羟基乙磺酸 盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、扑 酸盐、果胶酸盐、苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸 盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐等。盐的其他例子包 括由合适阳离子例如Na⁺、NH₄⁺和NW₄⁺（其中W是C_1-4烷基）等化合的本 发明化合物的阴离子。对于治疗用途，本发明的化合物的盐考虑为药学 可接受的。然而，并非药学可接受的酸和碱的盐也可以例如在药学可接 受的化合物的制备或纯化中有用。对于治疗用途，本发明的化合物的盐 考虑为药学可接受的。然而，并非药学可接受的酸和碱的盐也可以例如 在药学可接受的化合物的制备或纯化中有用。

如本文使用的，术语“干燥”指喷雾干燥、冷冻干燥、风干、真空 干燥或任何其他种类的过程，其减少或消除物质中的液体。

如本文使用的，术语“喷雾干燥”指使用热气体蒸发液体来干燥含 有液体的物质的常用方法，以减少或消除物质中的液体。换言之，材料 经由喷雾或雾化成加热干空气的气流（draft）进行干燥。

如本文使用的，术语“冷冻干燥”和术语“冻干”和术语“冷冻干 燥”指通过升华去除以冻结状态的物质中的溶剂。这通过冷冻材料以在 低于其低共熔点下干燥且随后提供升华潜热来完成。真空和供热的精确 控制允许来自冻结状态的干燥，而不产生回融。在实际应用中，该过程 在减压条件下是加速且精确控制的。

如本文使用的，术语“干燥自由流动粉末”指自由流动的干粉，例 如可以从容器、袋、器皿等中倾倒的粉末，而无大块的阻碍。

如本文使用的，术语“研磨”指通过冲击、剪切或磨损减少粒子大 小。

如本文使用的，术语“洗涤”指可以清除或去除制剂（例如酵母细 胞壁）中杂质或可溶性不需要的组分（例如使用任何类型的溶质（例如 蒸馏水、缓冲液或溶剂）或混合物），以从样品中去除非酵母细胞壁组 分）。

如本文使用的，术语“聚合物泡囊”指在水溶液（例如其可以用于 封装材料）中由合成聚合物装配的囊泡。聚合物泡囊可以使用两性合成 嵌段共聚物制备，以形成囊泡膜，并且具有范围为50nm至5μm或更 多的半径。大多数聚合物泡囊在其核心中含有水溶液，并且用于封装且 保护敏感分子例如药物、酶、其他蛋白质和肽以及DNA和RNA片段。聚 合物泡囊膜提供了使被封装的材料与外部材料分离的物理障碍，例如在 生物系统中发现的那些。在本发明的实施方案中有用的聚合物泡囊的例 子及其合成可以例如在美国专利号7,867,512、7,682,603和6,835,394 中发现，所述专利各自在此通过引用整体合并。

如本文使用的，术语“废物”指不需要或无用的材料。

如本文使用的，术语“废水”是在质量方面通过人为影响不利地受 累的任何水。

发明详述

I.前言

硒是通过与躯体的谷胱甘肽（GSH）及其主要含Se抗氧化剂酶，谷 胱甘肽过氧化酶（GPX）和硫氧还蛋白还原酶相互作用，参与所有活组 织中的抗氧化防御机制的调节方面的微量元素（参见例如Goehring等 人，J.Anim.Sci.59，725-732（1984）；Gerloff等人，J.Anim.Sci. 70，3934-3940（1992）；通过引用整体合并入本文）。谷胱甘肽和GPX 具有通过消灭能够起始且传播脂质氧化的自由基攻击来保护膜磷脂的 不饱和键的完整性的能力（参见例如Meister和Anderson，Annu.Rev. Biochem.52，711-760（1983）；Deleve和Kaplowitz，Pharm.Ther. 52，287-305（1991）；Palmer和Paulson，Nutr.Rev.55，353-361 （1997）；通过引用整体合并入本文）。

硒还与几个流行病学研究中减少的癌症危险相关（参见例如 Salonen等人，Am.J.Epidemiol.120：342-349（1984）；Willett 等人，Lancet2：130-134（1983）；Virtamo等人，Cancer60：145-148 （1987）；通过引用整体合并入本文）。天然和合成起源的多种硒化合 物已显示以广泛范围剂量抑制动物研究中的肿瘤发展（参见例如Ip,.J. Nutr.128：1845-1854（1998）；通过引用整体合并入本文）。尽管大 多数动物研究已采用癌症化学预防中的药理学剂量的硒（>2mg/kg）（参 见例如J.Nutr.128：1845-1854（1998）），但硒缺乏也已显示增强 乳房癌（参见例如Ip和Daniel，Cancer Res.45：61-65（1985）；通 过引用整体合并入本文）和UVB诱导的皮肤癌症形成（参见例如Pence 等人，102：759-761（1994）；通过引用整体合并入本文）。

酵母细胞壁蛋白质通过化学键连接至细胞壁多糖，并且为了将酵母 细胞壁蛋白质释放到溶液内，这些键需要被破坏。用于来自酵母细胞壁 的蛋白质提取的标准实践是在离心前使用碱水解（pH11.5，80℃）破 坏键，以从在水中不可溶的葡聚糖多糖中分离蛋白质。

在本发明的实施方案的发展过程中进行的实验在使用碱水解的标 准实践提取含硒糖蛋白的尝试中执行。使用碱水解从酵母细胞壁中提取 含硒糖蛋白的这些尝试失败。以后学习到使用碱水解从酵母细胞壁中提 取含硒糖蛋白的失败是由于含硒糖蛋白的破坏。提取含硒糖蛋白的以后 尝试使用修饰的碱水解程序（pH11.5，60℃）进行。这些尝试也未能 从酵母细胞壁中提取含硒糖蛋白。当尝试从酵母中提取含硒糖蛋白时， 一般的碱性酵母蛋白质提取方法不起作用。因此，另外的实验在本发明 的实施方案的发展过程中进行，其尝试使用酸提取（pH5，80℃）来提 取含硒糖蛋白。如本文描述的，酸提取方法是成功的；含硒糖蛋白未被 破坏并且提取是可能的。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了用于获得含硒糖蛋白 （SGPs）、含硒糖蛋白（SGP）组合物（例如使用酸提取方法获得的（例 如pH依赖性含硒糖蛋白级分））、包含封装的含硒糖蛋白（SGP’s） 的组合物的方法，和给受试者（例如人、动物等））使用其的方法（例 如提供体内利益（例如基因表达概况中的变化）。特别地，在本发明的 实施方案的发展过程中进行的实验证实本发明的组合物（例如包含SGP （例如经由本发明的方法分离的））和方法可以用于给受试者提供生物 学可用的硒（例如从而增加受试者内的组织和/或肌肉的含硒量（例如 从而导致受试者健康的稳定和/或增加）））。在一些实施方案中，本 发明提供了用于获得SGP’s的方法、包含封装的（例如聚合物泡囊封 装的）SGP’s的组合物和使用其改变细胞功能的方法（例如从而为受试 者的系统（例如包括但不限于肌肉骨骼系统、神经学系统、神经系统、 内分泌系统、代谢系统和/或免疫系统）提供有利效应。本发明还提供 了使用单独或与一种或多种其他活性剂组合的SGP’s用于治疗或预防 疾病（例如癌症生长和/或转移）的方法。本发明还提供了使用SGPs增 强动物（例如家畜）健康的方法。在一些实施方案中，本发明的组合物 用于补充、改善和/或增强食物产品（例如肉、乳制品、蛋等）的健康 和/或营养价值。在一些实施方案中，本发明提供了包含SGPs的组合物 和使用其作为治疗、营养补充剂和/或预防治疗的方法（例如用于一般 健康、用于加强免疫系统、用于神经变性疾病、用于增强认知功能、用 于治疗或预防癌症、肿瘤生长和/或转移等），以及制备、生产、纯化、 分离、提取和/或表征其的方法。本发明还提供了SGPs和使用SGPs用 于喂养动物和/或补充动物饲料的方法。

本发明还提供了可溶性硒组合物（例如SGPs）及其使用、生产和纯 化方法。例如，在一些实施方案中，本发明提供了可溶性SGPs（参见例 如描述pH依赖性SGP级分的生成（例如分离和表征）的实施例1-2）、 和组合物及其施用方法（参见例如，实施例3-4）。在一些实施方案中， 本发明提供了以可溶形式的硒（例如有机硒（例如SEL-PLEX或其他富 硒酵母的pH依赖性SGP级分）），其通过多个途径（例如经口、局部、 静脉内等）施用于受试者。在一些实施方案中，本发明提供了低纤维可 溶性硒（例如有机硒）组合物。在一些实施方案中，本发明提供了用于 可溶性有机硒递送系统（例如聚合物泡囊封装的含硒糖蛋白、纳米胶囊、 聚合物等）的组合物和方法。

在含硒（例如无机硒（例如亚硒酸钠（Na₂SeO₃）））培养基中生长 的酵母（例如酿酒酵母）代谢硒（例如无机硒）且将硒代替硫掺入半胱 氨酸和甲硫氨酸内，获得含有硒代氨基酸（SeCys和SeMet）的蛋白质 （Demirci等人J.Agric.Food Chem.47，2496-2500（1999）.，Demirci &Pometto.J.Agric.Food Chem.47，2491-2495（1999），Ouerdane &Mester.J.Agric.Food Chem.56,11792-11799,（2008），各自通 过引用整体合并入本文）。ALLTECH，Inc.（Nicholsville，KY，USA） 生产含有“有机硒”，在SEL-PLEX的名称下作为饲料和食物营养补充 剂出售的喷雾干燥的富硒酵母（参见例如通过引用整体合并入本文的 Korhola等人Res.18，65-68,（1986））。在SEL-PLEX中硒的最低限 度浓度是1500ppm，并且蛋白质是其的唯一载体（参见例如通过引用整 体合并入本文的Surai.Nottingham University Press2002，234-236 （2002），Kelly&Power.J.Dairy Sci.78，237-242（1995），McSheehy 等人Analyst130，35-37（2005））。在酵母中存在两个蛋白质库；存 在于酵母细胞内的蛋白质和与酵母细胞壁甘露聚糖结合的蛋白质（参见 例如通过引用整体合并入本文的Sedmak美国专利申请公开号：US 2006/0263415）。约17.0重量%的商业SEL-PLEX在水中是可溶的，并 且这种材料含有存在于SEL-PLEX中的小于6.5%的总硒。其中SEL-PLEX 和亚硒酸钠用作硒来源的鸡喂养研究指示硒通过SEL-PLEX更好地转移 到鸡胸肌内。发现多种生物活性用于SEL-PLEX的经口施用（参见例如 通过引用整体合并入本文的Rayman.The Lancet356，233-241（2000）， McKenzie Trends in Immunology19，342-345（1998），Tapiero. Biomedicine&Pharmacotherapy57，134-144（2003），Combs&Grey  Pharmacol.Ther.79，179-192（1998），Clark等人J.Am.Med.Assoc. 276，1957-1963（1996））。

在一些实施方案中，本发明提供了来自含硒（例如无机硒（例如亚 硒酸钠））培养基中生长的酵母的可溶性含硒糖蛋白（SGP’s）的分离、 以及物理和化学表征，及其通过给受试者饲养补充有或另外含有本发明 的SGP’s的食物（例如饲料）（参见例如，实施例1-4），在“有机硒” 递送至组织（例如人、动物、鸡等）中的主动参与。本发明提供了活性、 可溶性硒组分（例如富硒酵母（例如SEL-PLEX）的pH依赖性SGP级分） 的组织靶向的、静脉内、经口和/或经皮递送。在一些实施方案中，本 发明提供了缓慢释放形式的“有机硒”递送系统（例如纳米胶囊、聚合 物球体和聚合物泡囊封装的SGPs）（参见例如，实施例5-9）。在一些 实施方案中，本发明提供了包含聚合物泡囊封装的SGP’s的组合物。 在一些实施方案中，通过在基于聚（环氧乙烷）-嵌段-聚（ε-己内酯） （PEO-b-PCL）的聚合物泡囊内封装SGP’s，本发明提供了SGP’s的增 强递送和改善生物分布。

通过从酵母细胞的细胞内组分中提取细胞壁的多种酵母细胞组分 分离已得到描述（参见例如通过引用整体合并入本文的Otero等人J. Chem.Tech.Biotechnol.66，67-71（1996））。这些分离技术仍未 应用于喷雾干燥的硒酵母的提取。在本领域中用于从酵母中提取糖蛋白 的常规、碱性条件（pH9.0-14.0）（参见例如通过引用整体合并入本 文的Roberge等人J.Agric.Food Chem.51，4191-4197（2003））失 败是因为SeH或SeMe取代物从硒代胱氨酸或硒代甲硫氨酸氨基酸中消 除。换言之，当应用于含硒蛋白质的酵母提取时（参见例如实施例8的 表12），所需取代物分解并且因此存在于原始SGP’s中的硒在碱性条 件中尝试的提取过程中丧失。

相应地，在一些实施方案中，本发明提供了含硒糖蛋白组合物（例 如包含本文描述的含硒糖蛋白的pH依赖性级分）及其使用方法。在一 些实施方案中，本发明提供了生产、纯化、分离、提取、分开、沉淀和 /或表征含硒糖蛋白（例如从富硒酵母中）的方法。在一些实施方案中， 本发明提供了用于给受试者递送可溶性硒组合物（例如SGPs（例如pH 依赖性SGP级分））的组合物和方法，包括饮食补充组合物（例如包含 SGPs（例如药物、营养素、补充剂、粮食等））。在一些实施方案中， 本发明提供了用于增强硒（例如SGPs（例如聚合物泡囊、纳米胶囊、纳 米颗粒、聚合物等））递送（例如直接递送、限时释放递送等）的组合 物和方法。本发明的组合物和方法在多种应用中有用，包括但不限于饮 食（例如与饲料掺合或另外喂养给动物）、预防、治疗以及研究应用。 相应地，在一些实施方案中，本发明提供了动物饲料组合物（例如包含 SGPs（例如可溶性SGPs（例如可溶性有机硒）））、制造组合物的方法 和给动物提供营养（例如包含SGPs（例如可溶性SGPs（例如可溶性有 机硒）））的方法，其包括给动物提供组合物。

II.提取、分离、纯化和使用

在本发明的一些实施方案中，可溶性硒以含硒糖蛋白（SGPs）的形 式获得。在一些实施方案中，SGPs从含硒蛋白质的一般来源（例如富硒 酵母（例如SEL-PLEX））中提取。在一些实施方案中，SGPs的提取和/ 或纯化包含一个或多个pH依赖性提取/沉淀步骤（例如如实施例1和2 中描述的）。在一些实施方案中，SGPs的提取和/或纯化包含一个或多 个pH依赖性分级步骤。在一些实施方案中，本发明提供了富硒酵母（例 如SEL-PLEX）的酸提取，以溶解SGP’s（例如无需变性和/或破坏SGPs）。 在一些实施方案中，本发明提供了来自酸提取的SGPs的pH依赖性沉淀 （例如如实施例1-2中描述的）产生增加含量的含硒糖蛋白、减少含量 的无法消化的纤维和高浓度的硒（例如高于SEL-PLEX中存在的那种的 硒浓度）。因此，在一些实施方案中，本发明提供了从富硒酵母中提取 的SGP，其中SGP的含硒量大于SGP由其提取的材料的含硒量（例如以 重量/重量%、ppm等）。在一些实施方案中，本发明提供了以富硒酵母 （例如SEL-PLEX）的pH依赖性SGP级分（例如pH4.0或pH6.0级分） 形式的硒，当施用于受试者时，与来自富硒酵母（例如SEL-PLEX）亲本 来源的硒的生物利用度相比较，所述硒展示相同或更高的相似水平的生 物利用度（参见例如实施例3，表5）。

在一些实施方案中，SGPs从含硒蛋白质的一般来源（例如富硒酵母 细胞（例如SEL-PLEX））提取。在一些实施方案中，在含硒蛋白质来源 中的含硒蛋白质部分包含SGPs（例如0.1%...0.2%...0.5%...1.0%... 2.0%...5.0%...10%...20%...50%或更多SGPs）。在一些实施方案 中，含硒蛋白质来源包含已在含Se培养基（例如富Se培养基）的存在 下生长的细胞（例如酵母细胞）。在一些实施方案中，加工含Se细胞 （例如酵母细胞），以提取、分离和/或纯化含硒蛋白质，导致含硒蛋 白质来源或富含含硒蛋白质的组合物（例如富含SGP的组合物）。在一 些实施方案中，包含含硒蛋白质和SGPs的样品就SGPs进行富集。

在一些实施方案中，对含硒蛋白质来源或富含含硒蛋白质的组合物 （例如富硒酵母来源（例如SEL-PLEX））实施一个或多个步骤，以获得 分离、纯化、分离和/或提取的SGPs。在一些实施方案中，将含硒蛋白 质来源混合（例如在液体载体（例如水、缓冲液、盐等）中），以产生 蛋白质浆、混合物、裂解产物和/或溶液。在一些实施方案中，将含硒 蛋白质来源（例如富硒酵母来源（例如SEL-PLEX））在高温（例如超过 冷冻、超过室温、30℃…40℃…50℃…60℃…70℃…80℃…90℃ 或更高）下混合。在一些实施方案中，将含硒蛋白质来源（例如富硒酵 母来源（例如SEL-PLEX））在低pH（例如酸性条件（例如pH约0.5、 约1.0、约1.5、约2.0、约3.0、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约 6.0或约6.5）下混合。在一些实施方案中，将含硒蛋白质来源（例如 富硒酵母来源（例如SEL-PLEX））轻轻混合、快速混合、充分混合、剧 烈混合等。在一些实施方案中，将含硒蛋白质来源（例如富硒酵母来源 （例如SEL-PLEX））在低pH（例如酸性条件（例如pH约0.5、约1.0、 约1.5、约2.0、约3.0、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0或约 6.5）和高温（例如超过冷冻、超过室温、30℃…40℃…50℃…60℃… 70℃…80℃…90℃或更高）下混合。在一些实施方案中，混合物的pH 通过酸或碱的添加得到维持。

在一些实施方案中，将含有含硒蛋白质的混合物离心，以分离液/ 可溶和固/不可溶相。在一些实施方案中，选择足以分离相的离心速度。 在一些实施方案中，液相包含可溶性SGPs。在一些实施方案中，调节（例 如升高）液相的pH以沉淀SGPs的部分。在一些实施方案中，液体级分 的pH轻微至中等升高（例如pH升高约0.1…0.2…0.5…1.0…2.0）， 以沉淀在原始pH下可溶但在升高pH下不可溶的SGPs。在一些实施方案 中，液体级分的pH显著升高（例如pH升高约1.0…2.0…3.0…4.0… 5.0…6.0），以沉淀在原始pH下可溶的大部分SGPs。在一些实施方案 中，在多个pH条件下使含硒糖蛋白从液相中沉淀且分离，以生成可溶 性含硒糖蛋白的多个pH依赖性级分。例如，在一些实施方案中，包含 在酸性条件下可溶的富硒酵母提取物的单个液相用于产生在第一个pH （例如pH1.85）下沉淀的可溶性含硒糖蛋白的第一个级分，在第二个 pH（例如pH3.0）下沉淀的可溶性含硒糖蛋白的第二个级分，在第三个 pH（例如pH4.0）下沉淀的可溶性含硒糖蛋白的第三个级分，和在第四 个pH（例如pH6.0）下沉淀的可溶性含硒糖蛋白的第四个级分。在一 些实施方案中，经由升高液相的pH从液相中沉淀含硒糖蛋白包括液相 的多个顺次pH依赖性沉淀反应。

在一些实施方案中，沉淀的SGPs通过离心从pH调节的液体级分中 分离（例如以足以产生分离的液相和固相的速度）。在一些实施方案中， 将已从液相中分离的SGPs冷冻干燥，以获得固体SGP级分。在一些实 施方案中，重复升高液相的pH且离心以分离SGP级分的过程，以产生 不同溶解度的SGP级分（例如在pH1.5下可溶的…在pH2下可溶的… 在pH3下可溶的…在pH4下可溶的…在pH5下可溶的…在pH6下可 溶的等）。在一些实施方案中，执行单个pH调节和离心步骤，以产生 含有所需溶解度的SGPs的一个级分（例如在pH1.5下可溶的…在pH2 下可溶的…在pH3下可溶的…在pH4下可溶的…在pH5下可溶的… 在pH6下可溶的等）。在一些实施方案中，在最终SGP级分去除后保 留的液相作为用于在含硒蛋白质或SGPs的进一步生产中使用的细胞的 生长培养基的组分有用。在一些实施方案中，包含可溶性含硒糖蛋白的 组合物仅含有含硒糖蛋白的单个pH依赖性级分（例如来自包含在酸性 条件下可溶的富硒酵母提取物的液相的可溶性含硒糖蛋白在pH4.0下 沉淀）。在一些实施方案中，包含可溶性含硒糖蛋白的组合物含有含硒 糖蛋白的两个或更多pH依赖性级分（例如来自包含在酸性条件下可溶 的富硒酵母提取物的液相的可溶性含硒糖蛋白在两个或更多不同pH值 下沉淀）。

在优选实施方案中，来自含硒蛋白质来源（例如富硒酵母（例如 SEL-PLEX））的SGP提取和SGP’s混合物的pH依赖性分级过程（参见 例如图2和3）包含两个阶段（参见例如实施例1-2，图1和2）。在第 一个阶段，将富硒酵母在0.3N HCl（pH1.5）中的悬浮液搅拌且在80℃ 下加热8小时。通过在提取的第一个小时过程中添加浓缩HCl，将混合 物的pH维持在pH1.5。在八小时后，将混合物离心，并且分离液相。通 过添加2.0N NaOH将溶液的pH调节至1.85，并且在这个pH下具有有限 溶解度的SGP’s从溶液中沉淀，并且通过第二次离心从液体（pH1.85） 中分离，并且随后冷冻干燥，以获得pH1.85的固体SGP级分。在一些 实施方案中，将液体（pH1.85）与来自第一次离心的固体（pH1.5） 混合，这导致混合物的pH至pH1.6的变化。将在pH1.6下可溶的大 多数SGP’s转移到液相内，而不增加在这个过程阶段内产生的废物流 的体积。来自这个过程阶段的大多数副产物是来自第二次离心的固体。 废渣流构成对于提取获得的约56.5重量%的富硒酵母，并且含有有价值 的硒酵母细胞壁材料，其包含：38.91%的蛋白质和2477ppm的硒。在一 些实施方案中，这些固体利用（例如单独或与其他材料（例如富硒酵母） 组合）作为动物饮食中的环境友好的营养补充剂。在第二个阶段（参见 例如图3），将来自第二次离心的液相（pH1.6）（参见图2）转移至 混合器，并且通过添加2.0N NaOH将pH调节至pH3.0，并且在这个pH 下具有有限溶解度的SGP’s从溶液中沉淀，并且通过第三次离心从液 体（pH3.0）中分离，并且随后冷冻干燥，以获得pH3.0的固体SGP 级分（参见例如实施例1-2以及图2和3）。将来自第三次离心的液相 （pH3.0）转移至混合器，并且通过添加2.0N NaOH将pH调节至pH4.0， 并且在这个pH下具有有限溶解度的SGP’s从溶液中沉淀，并且通过第 四次离心从液体（pH4.0）中分离，并且最后冷冻干燥，以获得pH4.0 的固体SGP级分。将来自第四次离心的液相（pH4.0）转移至混合器， 并且通过添加2.0N NaOH将pH调节至pH6.0，并且在这个pH下具有有 限溶解度的SGP’s从溶液中沉淀，并且通过第五次离心从液体（pH6.0） 中分离，并且随后冷冻干燥，以获得pH6.0的固体SGP级分。在第二 个过程阶段时产生的唯一废物流是废水流，含有13.4重量%的固体（与 提取中使用的富硒酵母重量相比较），其中蛋白质级分构成约13.3重 量%，氯化钠3.6重量%，并且葡萄糖和甘露糖单糖和寡糖构成超过80 重量%。这个pH6.0的“废水”流和242ppm的硒浓度可以再循环或另 外再使用，以制备新的一批硒酵母（例如在生长培养基中利用）。

在一些实施方案中，在pH4.0下沉淀的SGP’s显示出与富硒酵母 （例如SEL-PLEX）相比较优良的硒递送（例如对于肌肉组织），并且当 与无机形式的硒（例如亚硒酸钠）相比较时优良得多的递送（参见例如 实施例3）。另外，pH依赖性含硒糖蛋白级分（例如pH6.0）在组成上 不同于富硒酵母（例如SEL-PLEX），并且允许递送相似量的硒，同时需 要少得多的原材料（例如富硒酵母）。

在一些实施方案中，SGP提取程序包括上文程序的4个或更少的pH 调节和离心步骤（例如1个pH调节和离心步骤，2个pH调节和离心步 骤，3个pH调节和离心步骤，4个pH调节和离心步骤）。

III.动物饲料

动物饲料指用于喂养驯养家畜（例如牛、山羊、绵羊、马、家禽、 水牛、羊驼、美洲驼、驴、骡、兔、鸡、鹅、火鸡或猪）的任何粮食。 动物饲料通常包括干草、稻草、青贮饲料、压缩且形成团块的饲料、油 和混合口粮、以及发芽谷粒和豆类。全世界的动物饲料工业在2006年 消耗635,000,000吨饲料，伴随约2%的每年增长率。农业土地种植饲料 而不是人食物的使用可以是有争论的；一些类型的饲料例如玉米（玉蜀 黍）也可以充当人食物，而其他的例如草则不能。除了给动物提供能源 外，动物饲料还提供由躯体利用的营养素（例如硒）。

在一些实施方案中，本发明提供了营养组合物（例如允许生成含有 硒（例如超过标准饲料组合物的升高浓度的硒）的动物饲料组合物的可 溶性硒组合物（例如SGPs）），与常规动物饲料相比较，其降低总成本， 增加饲料转换且维持和/或改善衍生自接受其的家畜的畜产品（例如肉、 蛋、乳制品等）的质量。

例如，在一些实施方案中，本发明提供了包含SGPs的饮食补充组 合物，其可以与动物饲料组合和/或掺入动物饲料内，并且施用于（例 如喂养给）动物，以对动物中的生长行为提供相等或优良的作用（例如 与具有其他形式的补充硒（例如富硒酵母（例如SEL-PLEX）的动物饲料 饮食相比较））。在一些实施方案中，本发明的饮食补充组合物增加接 受该组合物的受试者（例如人或动物）中的循环硒量（例如位于血液和 /或血清中）。在一些实施方案中，更大比例的施用硒在本发明的可溶 性硒组合物（例如SGPs）中比其他硒制剂（例如亚硒酸钠或富硒酵母（例 如SEL-PLEX））中是生物可利用的。即，在一些实施方案中，本发明提 供了包含含硒糖蛋白的组合物，与其他形式的硒（例如富硒酵母）相比 较，其含有致使对于受试者可用的（例如生物可用的）更高比例和/或 比的硒，意指需要更少量的包含本发明的含硒糖蛋白的组合物（例如以 获得相似的生物利用度量）。在一些实施方案中，本发明的饮食补充组 合物（例如包含本发明的SGPs）增加接受该组合物的受试者（例如人或 动物）中的硒量（例如位于肌肉或其他组织中）。在一些实施方案中， SGPs和/或可溶性硒施用导致对于血清、脂肪组织、肌肉组织等增加的 硒生物利用度。

在一些实施方案中，本发明提供了增加动物通过其利用喂养给动物 的饮食中的营养素的效率的方法，其包括给动物提供包含本发明的饮食 补充组合物的饮食，其中所述补充组合物增强动物加工且利用饮食中存 在的营养素的能力。在一些实施方案中，本发明的饮食补充组合物增加 接受该组合物的受试者中的循环抗氧化剂（例如位于血液或血清中的 硒）量。在一些实施方案中，本发明的饮食补充组合物增加接受该组合 物的受试者中的抗氧化剂（例如位于脂肪组织、肌肉等中的硒）量。

IV.药物、营养物和补充剂

营养硒水平已由FDA确定（参见21C.F.R.101.9（c）（8）（iv）， 1994年1月）。人和动物可以安全地代谢有限量的无机和有机形式的硒， 并且可以将非甲基化的硒转换为单或二或三甲基化衍生物，其中单甲基 化的衍生物是最毒性的。（参见例如Bedwal，R.S.,等人，Medical  Hypotheses，41（2）:150-159（1993年8月））。FDA已采用对于哺 乳女性对于硒70微克的每日参考摄入量（RDIs），和对于非哺乳成人 55微克的RDI。600微克/天的硒剂量已报道为安全的。（参见例如Ferris  G.M.Lloyd,等人，App.Clin.Biochem.,26:83-88（1989）。在大约 这个剂量时，酶谷胱甘肽还原酶的正常活性在肝和红细胞中将硒代谷胱 甘肽安全地转换为硒化氢，并且最后被排泄。因此，在此类更低剂量时， 躯体能够安全地代谢且排泄以游离金属形式存在的硒。然而，与许多微 量元素（例如硒）一样，在更高剂量水平或浓度时，有利效应逆转，并 且有害毒性体现。（参见例如，Furnsinn，C.等人，Internat'l J.of  Obesity and Related Metab.Dis.，19（7）:458-463（1995））。

以天然形式的硒的施用涉及科学和医学权衡，因为当以相对低浓度 施用时，硒提供有利的健康效应，然而，在更高浓度时，硒显示出显著 毒性，使得潜在的健康利益丧失并且毒性成为主要关注。

如上所述，本发明提供了为受试者提供有利效应的特定形式的硒 （例如SGPs、水溶性硒）。证据已显示有机形式的硒（例如硒代甲硫氨 酸和富硒酵母）可以是比无机形式更少毒性且更好吸收（参见例如 Mahan，Proceedings of the 15th Annual Symposium Nottingham  University Press，Nottingham，UK，第523-535页（1999）。然而， 在一些实施方案中，多重形式的硒彼此组合使用（例如为受试者提供有 利的健康效应）。硒的天然来源包括但不限于富硒（例如硒化）酵母。 使用的酵母菌株并不受限制。

在本发明的特定优选实施方案中，SGPs（例如衍生自富硒酵母（例 如SEL-PLEX），如实施例1-2中描述的）是选择用于本发明的制剂和组 合物的硒形式。在一些实施方案中，与其他形式的硒相比较，包含水溶 性硒和/或SGPs的组合物提供更多生物学可用形式的硒。然而，其他形 式的硒也可以在本发明中有用，包括水溶性硒和/或SGPs的衍生物或修 饰、SEL-PLEX或其他形式的富硒酵母、硒代甲硫氨酸、硒代半胱氨酸、 硒化合物、硒酸盐化合物或其衍生物、盐或修饰。因此，在一些优选实 施方案中，这些形式的硒各自可以用作制剂的组分。备选地，上述形式 的硒各自可以连接（例如化学或物理）至药物或治疗剂，以形成硒-药 物衍生物。另外，组合物和制剂并不限于一种形式的硒。事实上，组合 物或制剂可以包含多重形式的硒（例如SGPs和SEL-PLEX、或Sod-sel 和水溶性硒）。

在本发明的多个实施方案中有用的其他形式的硒在通过引用整体 合并入本文的美国专利号6,911,550 6,197,295、5,221,545、6和 6,576,233，以及美国专利申请号20010043925、20050069594、 20050089530和20080107755中描述。

相应地，本发明提供了药物、营养物和/或补充组合物（例如粮食 和/或饮食组合物或处理），其包含一种或多种形式的硒（例如SGPs、 可溶性硒（例如水溶性硒）等），单独或与至少一种其他试剂例如稳定 化合物、其他治疗剂、营养素和/或矿物质组合；并且可以在任何无菌、 生物相容性载体中施用，包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水等。

本发明的方法在治疗（例如预防或治疗）疾病（例如神经变性疾病、 癌症等）或改变生理学状态中有用。硒（例如可溶性硒（例如水溶性硒）、 SGPs）））可以在药学可接受的载体例如生理盐水中静脉内施用于受试 者（例如患者）。可以使用用于化合物的细胞内递送的标准方法（例如 经由脂质体递送）。此类方法是本领域普通技术人员众所周知的。本发 明的制剂对于肠胃外施用例如静脉内、皮下、肌内和腹膜内是有用的。 在一些实施方案中，经口施用组合物（例如SGPs和/或包含其的药物制 剂）。

如医学领域中众所周知的，关于任何一个受试者的剂量可以依赖许 多因素，包括患者的大小、体表面积、能量、待施用的具体化合物、性 别、施用时间和途径、总体健康状况、和与同时施用的其他药物的相互 作用。

相应地，在一些实施方案中，将包含硒（例如可溶性硒（例如水溶 性硒）、SGPs等）的组合物和/或制剂单独或与其他形式的硒、药物、 小分子组合或在药物组合物中施用于受试者，在所述药物组合物中它与 赋形剂或其他药学可接受的载体混合。在一些实施方案中，药学可接受 的载体是药学惰性的。在其他实施方案中，将包含硒（例如可溶性硒（例 如水溶性硒）、SGPs等）的组合物单独施用于患有疾病或状况的个别受 试者。在本发明的其他实施方案中，将包含硒（例如可溶性硒（例如水 溶性硒）、SGPs等）的组合物单独施用于个别受试者用于促进总体健康 或身体系统的健康。包含单独或与一种或多种其他形式的硒组合的硒 （例如可溶性硒（例如水溶性硒）、SGPs等）的组合物可以加入营养饮 料或食物（例如ENSURE、POWERBAR等）、多种维生素、营养产品、食 物产品等用于每日消耗。

取决于寻求通过治疗改变的靶（例如与衰老相关的基因表达、和/ 或与癌症和/或肿瘤生长或转移相关的基因表达的调节），这些药物、 补充剂和/或营养组合物被配制且全身或局部施用。用于配制和施用的 技术可以在最新版本的"Remington's Pharmaceutical Sciences"（Mack  Publishing Co，Easton Pa.）中找到。合适途径可以例如包括经口或 经粘膜施用；以及肠胃外递送，包括肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、 静脉内、腹膜内或鼻内施用。

对于注射，含有硒（例如可溶性硒（例如水溶性硒）、SGPs等）的 组合物在水溶液中配制，优选在生理学相容的缓冲液例如汉克氏溶液、 林格氏溶液、或生理学缓冲盐水中。对于组织或细胞施用，对于待穿透 的具体障碍合适的穿透剂用于制剂中。此类穿透剂是本领域通常已知 的。

在其他实施方案中，含有硒（例如可溶性硒（例如水溶性硒），SGPs 等）的组合物使用本领域众所周知的药学可接受的载体以适合于经口施 用的剂量进行配制。此类载体致使含有硒（例如可溶性硒（例如水溶性 硒）、SGPs等）的组合物配制为片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆 剂、浆、悬浮液等，用于被待治疗的患者经口或鼻摄入。

适合于在本发明中使用的药物组合物包括这样的组合物，其中活性 成分（例如含有硒（例如可溶性硒（例如水溶性硒）、SGPs等）的组合 物）以有效量包含以达到预期用途。例如，药物试剂的有效量可以是改 变特定基因（例如KTLG、GRB2、DNAJ3、TGFB1、MAPK8、C1R、UBE4A、 SMPX、USP22和/或PTP4A1）的表达的那种量。有效量的测定完全在本 领域技术人员的能力内。

本发明还提供了pH依赖性SGPs和包含其的组合物用于在癌症的预 防和/或治疗处理（例如以预防或减慢癌症/肿瘤进展和/或转移）中使 用。例如，在优选实施方案中，将富硒酵母（例如SEL-PLEX）的pH依 赖性SGP级分施用于受试者，以调节与癌症生长和/或转移相关的基因 的表达（例如以所需方式）。如本文描述的，已鉴定特定可溶性SGP级 分，其具有可溶性SGP级分由其衍生的亲本材料（例如富硒酵母（例如 SEL-PLEX））不具有的生物性质（例如调节基因表达的能力）（参见例 如实施例4和图7-11）。在优选实施方案中，富硒酵母（例如SEL-PLEX） 的pH依赖性SGP级分是pH4.0依赖性级分，尽管其他级分（例如pH3.0、 pH6.0等）也在本发明的组合物和方法中有用。

除了活性成分外，这些含有硒（例如可溶性硒（例如水溶性硒）、 SGPs等）的药物组合物还可以含有包含赋形剂和助剂的合适的药学可接 受的载体，所述赋形剂和助剂促进活性化合物加工成可以药学使用的制 剂。配制用于经口施用的制剂可以以片剂、锭剂、胶囊或溶液的形式。

本发明的药物组合物可以以自身已知的方式（例如借助于常规混 合、溶解、粒化、锭剂制备、研碎、乳化、封装、截留或冻干过程）进 行制造。

用于肠胃外施用的药物制剂包括以水溶性形式的活性化合物的水 溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备为适当的油性注射悬浮液。 合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油例如芝麻油、或合成脂肪酸酯例如 油酸乙酯或甘油三酯、或脂质体。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液 粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。任选地，悬 浮液还可以含有合适稳定剂或增加化合物的溶解度的试剂，以允许制备 高度浓缩的溶液。

用于经口使用的药物制剂可以通过下述获得：将活性化合物与固体 赋形剂组合，任选研磨所得到的混合物，并且在需要时加入合适助剂后， 加工颗粒的混合物，以获得片剂或锭剂核心。合适的赋形剂是碳水化合 物或蛋白质填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；来 自玉米、小麦、稻、马铃薯等的淀粉；纤维素例如甲基纤维素、羟丙基 甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；和胶质包括阿拉伯胶和黄蓍胶；和蛋白 质例如明胶和胶原。需要时，可以加入崩解剂或增溶剂，例如交联聚乙 烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐例如海藻酸钠。

锭剂核心与合适的包衣例如浓缩糖溶液一起提供，所述包衣还可以 含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇和/ 或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可以 加入片剂或锭剂包衣用于产品鉴定或表征活性化合物的数量（即剂量）。

可以经口使用的药物制剂包括由明胶制成的推入配合的胶囊，以及 由明胶和包衣例如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊。推入配合的胶囊 可以含有与填充剂或粘合剂例如乳糖或淀粉、润滑剂例如滑石或硬脂酸 镁和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以溶解 或悬浮于合适液体例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇（连同或不连 同稳定剂）中。

可以制备在药学可接受的载体中配制的包含本发明化合物的组合 物，将其置于合适容器中，并且标记用于指示状况的治疗。对于包含硒 的组合物或制剂，在标签上指示的状况可以包括与疾病或状况（例如癌 症、神经变性疾病和/或认知功能）的预防或治疗处理有关的状况治疗。

药物组合物可以作为盐提供或可以用许多酸形成，包括但不限于盐 酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐趋于在水或其 他质子溶剂中更可溶，其为相应的游离碱形式。在其他情况下，优选制 剂可以是在4.5-5.5的pH范围中的在1mM-50mM组氨酸、0.1%-2% 蔗糖、2%-7%甘露糖醇中的冻干粉末，其在使用前与缓冲液组合。

对于在本发明的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以最初 由细胞培养测定法进行估计。随后，优选地，剂量可以在动物模型（特 别是鼠模型）中形成，以达到希望的循环浓度范围。

治疗有效剂量指改善或预防疾病状态或状况（例如通过改变基因表 达）的症状的那个量。此类化合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养 或实验动物中例如用于测定LD₅₀（对50%群体致命的剂量）和ED₅₀（在 50%群体中治疗有效的剂量）的标准药学程序进行测定。在毒性和疗效 之间的剂量比是治疗指数，并且它可以表示为比LD₅₀/ED₅₀。显示出大治 疗指数的化合物是优选的。得自这些细胞培养测定法和另外的动物研究 的数据可以用于配制一系列剂量用于人使用。此类化合物的剂量优选位 于包括ED₅₀的循环浓度的范围内，具有很少的毒性或无毒性。剂量在这 个范围内改变，取决于采用的剂型、患者的敏感性和施用途径。

确切剂量可以通过受试者或医生考虑到待治疗的患者加以选择。调 节剂量和施用，以提供足够水平的活性部分或维持所需效应（例如受试 者中的基因表达的改变）。可以加以考虑的另外因素包括疾病状态的严 重性；患者的年龄、重量和性别；饮食、施用时间和频率、药物组合、 反应敏感性和对治疗的耐受/应答。长效药物组合物可以每3-4天、 每周或每两周一次或每月一次施用，取决于特定制剂的半衰期和清除 率。

在一些实施方案中，硒（例如可溶性硒、水溶性硒、SGPs等）以 25-600μg/天的日剂量施用（例如可溶性硒、水溶性硒和/或SGP以 这样的方式施用于受试者，以便每天为受试者提供25-600μg硒）。 在优选实施方案中，硒以50-200μg/天的日剂量施用。在其他优选 实施方案中，硒以100-200μg/天的日剂量施用。可以使用在25-600 μg外的剂量。在一些实施方案中，单个剂量的硒（例如可溶性硒、水 溶性硒、SGPs等）每天施用一次。在其他实施方案中，每天施用2、3、 4个或更多剂量（例如早晨一次和晚上一次，或每4-6小时一次）。 例如，在一些实施方案中，硒（例如可溶性硒、水溶性硒、SGPs等）在 三个分开、超过三个分开、两个分开或小于两个分开剂量中施用于受试 者。在一些优选实施方案中，日剂量在限时释放胶囊中施用。在一些优 选实施方案中，日剂量是25-75μg硒（例如可溶性硒、水溶性硒、SGPs 等）。在其他优选实施方案中，日剂量是200μg硒（例如有机硒、硒 化酵母、SEL-PLEX、可溶性硒、水溶性硒、SGPs等）。

本发明的药物组合物可以以许多方式施用，取决于是希望局部还是 全身治疗以及待治疗的区域。施用可以是局部（包括眼和粘膜包括阴道 和直肠递送）、肺（例如通过粉末或气溶胶的吸入或吹入，包括通过喷 雾器；气管内、鼻内、表皮和经皮）、经口或肠胃外。肠胃外施用包括 静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内例如鞘内或 心室内施用。包含硒的组合物和制剂被认为对于经口施用是特别有用 的。

用于局部施用的含有硒（例如含有SGP）的药物、营养和/或补充组 合物和制剂可以包括经皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、 喷雾剂、液体和粉末。常规药学载体、水性、粉末或油性基、增稠剂等 可以是必需或希望的。

用于经口施用的组合物和制剂包括粉末或颗粒剂、在水或非水介质 中的悬浮液或溶液、胶囊、囊剂或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳 化剂、分散助剂或粘合剂可以是希望的。

用于肠胃外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可以包括无菌水溶 液，其还可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂，例如但不限于 穿透促进剂、载体化合物和其他药学可接受的载体或赋形剂。

因此，在一些实施方案中，本发明的药物、营养和/或补充组合物 包括但不限于溶液、乳状液和含脂质体制剂。这些组合物可以由多种组 分生成，所述多种组分包括但不限于形成的液体、半乳化固体和自乳化 半固体。

可以方便地以单位剂型呈现的本发明的药物、营养和/或补充组合 物可以根据制药工业中众所周知的常规技术进行制备。此类技术包括使 活性成分与药学载体或赋形剂结合的步骤。一般而言，制剂通过下述进 行制备：使活性成分与液体载体或精细分开的固体载体或两者均匀且紧 密地结合，和随后需要时使产物成形。

在一些实施方案中，本发明的含有硒（例如可溶性硒、水溶性硒、 SGP）的组合物可以配制成许多可能剂型中的任何，例如但不限于片剂、 胶囊、液体糖浆剂、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物还可以配 制为限时释放纳米颗粒（例如纳米胶囊）、囊泡、脂质体、聚合物（例 如分子印迹聚合物（MIPs）、生物可降解的缓慢释放聚合物、聚阳离子 聚合物等。本发明的组合物还可以配制为在水、非水或混合介质中的悬 浮液。水悬浮液可以进一步含有增加悬浮液的粘度的物质，包括例如羧 甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或右旋糖酐。悬浮液还可以含有稳定剂。 在本发明的一个实施方案中，药物和/或补充组合物可以配制且用作泡 沫。泡沫包括制剂例如但不限于乳剂、微乳剂、乳膏、凝胶剂和脂质体。 虽然在性质中基本相似，但这些制剂在最终产物的组分和一致性中不 同。

本发明的含有硒（例如可溶性硒、水溶性硒、SGP等）的组合物可 以另外含有在药物组合物中照常规发现的其他辅助组分。因此，例如， 组合物可以含有另外的相容的药学活性的材料，例如止痒药、收敛剂、 局部麻醉药或抗炎剂，或可以含有在物理配制本发明的组合物的多个剂 型中有用的另外材料，例如染剂、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、 增稠剂和稳定剂。然而，此类材料在加入时应不会不适当地干扰本发明 组合物的组分的生物活性。制剂可以是灭菌的，并且需要时，与辅助试 剂混合，所述辅助试剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、 用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味料和/或芳香族物质等， 其不会有害地与制剂的核酸相互作用。

在一些实施方案中，本发明提供了药物、营养和/或补充组合物， 其含有（a）一种或多种形式的硒（例如SGP（例如pH依赖性SGP级分）、 可溶性硒、水溶性硒、SEL-PLEX）和（b）一种或多种其他试剂（例如 营养素、矿物质、治疗剂等）。

本发明还包括涉及本文描述的包含硒（例如可溶性硒、水溶性硒、 SGP等）的化合物与一种或多种另外的活性剂（例如治疗剂（例如癌症 治疗剂、阿尔茨海默氏病治疗剂）、抗氧化剂等）的共施用的方法。事 实上，本发明的进一步方面是通过共施用本发明的包含硒（例如可溶性 硒、水溶性硒、SGP（例如pH依赖性SGP级分）等）的组合物与预防或 治疗药物组合物、营养物和/或补充剂，提供用于增强治疗和/或药物、 营养和/或补充组合物的方法。在共施用程序中，试剂可以同时或顺次 施用。在一个实施方案中，本文描述的化合物在其他活性剂前施用。制 剂和施用方式可以是上文描述的那些中的任何。此外，两种或多种共施 用试剂可以各自使用不同模式或不同制剂施用。在一些实施方案中，本 发明的组合物与癌症治疗共施用。

相应地，在一些实施方案中，将含有一种或多种形式的硒（例如SGP （例如pH依赖性SGP级分）、可溶性硒、水溶性硒、SEL-PLEX）的组 合物全身或局部施用，以抑制肿瘤细胞增殖和血管生成，和/或诱导癌 症患者中的肿瘤细胞死亡。例如，在一些实施方案中，将包含富硒酵母 （例如SEL-PLEX）的pH依赖性SGP级分（pH4.0）的组合物在这样的 条件下施用于受试者，使得与癌症/肿瘤生长和/或转移相关的一种或多 种基因的表达在受试者中以有利方式得到调节（例如上调或下调）（参 见例如实施例4）。组合物可以静脉内、鞘内、腹膜内以及经口施用。 此外，它们可以单独或与抗增殖药物组合施用。

当考虑组合时，不预期本发明受组合的特定性质限制。本发明考虑 了作为简单混合物以及化学杂交物的组合。后者的例子是其中含有一种 或多种形式的硒的组合物共价连接至靶向载体或活性药物。共价结合可 以通过许多商购可得的交联化合物中的任何一种完成。

不预期本发明受治疗制剂的特定性质限制。例如，此类组合物可以 连同生理学耐受的液体、凝胶或固体载体、稀释剂、佐剂和赋形剂一起 提供。

这些治疗制剂可以施用于哺乳动物用于兽医学用途，例如对于驯养 或农场饲养的动物，和以类似于其他治疗剂的方式在人中的临床用途。 一般而言，治疗功效所需的剂量将根据使用类型和施用方式，以及个别 宿主的详细需求而改变。

此类组合物一般制备为液体溶液或悬浮液、或以固体形式。用于癌 症的经口制剂通常包括此类通常采用的添加剂，例如粘合剂、填充剂、 载体、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂和赋形剂，如例如药物级别的 甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些 组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末的 形式，并且一般含有1%-95%的活性成分，优选2%-70%。

组合物还制备为可注射物，作为液体溶液或悬浮液；还可以制备适 合于在注射前在液体中溶解或悬浮的固体形式。

本发明的组合物通常与生理学耐受和相容的稀释剂或赋形剂混合。 合适的稀释剂和赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油等及其组合。此 外，需要时，组合物可以含有少量辅助物质例如湿润剂或乳化试剂，稳 定剂或pH缓冲剂。

广泛范围的治疗剂在本发明中有用。例如，可以与本发明的含有一 种或多种形式的硒的组合物共施用的任何治疗剂适合于在本发明中使 用。

本发明的一些实施方案提供了给受试者施用有效量的含有一种或 多种形式的硒和至少一种抗癌剂（例如常规抗癌剂，例如化学治疗药物 和/或放射疗法）的组合物。

适合于与本发明一起使用的抗癌剂机制包括但不限于诱导细胞凋 亡的试剂，诱导/引起核酸损害的试剂，抑制核酸合成的试剂，影响微 管形成的试剂，和影响蛋白质合成或稳定性的试剂。

适合于在本发明的组合物和方法中使用的抗癌剂种类包括但不限 于：1）生物碱，包括微管抑制剂（例如长春新碱、长春碱和长春地辛 等），微管稳定剂（例如紫杉醇（泰素）和多西他赛等），和染色质功 能抑制剂包括拓扑异构酶抑制剂例如表鬼臼毒素（例如依托泊苷 （VP-16）和替尼泊苷（VM-26）等），和靶向拓扑异构酶I的试剂（例 如喜树碱和依立替康（Isirinotecan）（CPT-11）等）；2）共价DNA 结合剂（烷化剂），包括氮芥（例如氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异 环磷酰胺和白消安（马利兰）等）、亚硝基脲（例如卡莫司汀、罗莫司 汀和司莫司汀等）、和其他烷化剂（例如达卡巴嗪、羟甲基蜜胺、噻替 派和丝裂霉素（Mitocycin）等）；3）非共价DNA结合剂（抗肿瘤抗生 素），包括核酸抑制剂（例如更生霉素（放线菌素D）等）、蒽环（例 如柔红霉素（道诺霉素和正定霉素）、多柔比星（阿霉素）、和伊达比 星（依达比星）等）、蒽二酮（例如蒽环类似物，例如（米托蒽醌）等）、 博来霉素（硫酸博来霉素）等和普卡霉素（光辉霉素）等；4）抗代谢 药包括抗叶酸剂（例如氨甲蝶呤、Folex和氨甲蝶呤钠等）、嘌呤抗代 谢药（例如6-巯嘌呤（6-MP，巯基嘌呤）、6-硫鸟嘌呤（6-TG）、硫唑 嘌呤、阿昔洛韦、更昔洛韦、氯脱氧腺苷、2-氯脱氧腺苷（CdA）和2'- 脱氧肋间型霉素（喷司他丁）等）、嘧啶拮抗剂（例如氟嘧啶（例如5- 氟尿嘧啶（Adrucil）、5-氟脱氧尿苷（FdUrd）（氟尿苷））等）、和 阿糖胞苷（例如赛德萨（ara-C）和氟达拉滨等）；5）酶包括L-天冬酰 胺酶和羟基脲等；6）激素包括糖皮质激素例如抗雌激素（例如它莫西 芬等）、非类固醇抗雄激素（例如氟他胺等）和芳香酶抑制剂（例如阿 那曲唑（瑞宁得）等）；7）铂化合物（例如顺铂和卡铂等）；8）与抗 癌药、毒素和/或放射性核素等缀合的单克隆抗体；9）生物应答修饰剂 （例如干扰素（例如IFN-α等）和白细胞介素（例如IL-2等）等）； 10）过继免疫疗法；11）造血生长因子；12）诱导肿瘤细胞分化的试剂 （例如全反式视黄酸等）；13）基因治疗技术；14）反义治疗技术；15） 肿瘤疫苗；16）针对肿瘤转移的治疗（例如Batimistat等）；和17） 其他血管生成抑制剂。

在优选实施方案中，本发明提供了给受试者施用有效量的组合物， 所述组合物含有本发明的一种或多种形式的硒和诱导细胞凋亡和/或预 防癌细胞增殖的至少一种常规抗癌剂。在一些优选实施方案中，受试者 具有特征在于转移的疾病。在另外其他实施方案中，本发明提供了给具 有特征在于Bcl-2家族蛋白质（例如Bcl-2和/或Bcl-X_L）的过表达的 疾病的受试者施用有效量的组合物，所述组合物含有一种或多种形式的 硒和紫杉烷（例如多西他赛）。

紫杉烷（例如多西他赛）是有效种类的抗癌化学治疗剂。（参见例 如K.D.Miller和G.W.Sledge，Jr.Cancer Investigation， 17:121-136（1999））。虽然本发明不预期限制于任何特定机制，但紫 杉烷诱导的细胞死亡被认为通过细胞内微管稳定和细胞凋亡途径的后 续诱导进行。（参见例如S.Haldar等人，Cancer Research，57:229-233 （1997））。在一些其他实施方案中，顺铂和泰素特别考虑用于与本发 明的含有一种或多种形式的硒的组合物一起使用。在一些实施方案中， 在癌症治疗背景中常规使用的任何药物在本发明中有用。适合于与公开 的含有一种或多种形式的硒的组合物一起施用的常规抗癌剂包括但不 限于阿霉素、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、喜树碱、氨甲蝶呤、放线菌素 -D、丝裂霉素C或更优选地顺铂。在本发明的一些实施方案中，治疗处 理进一步包含直接交联核酸（例如DNA）以促进DNA损害的一种或多种 试剂，导致本发明的协同抗肿瘤药。例如，可以使用试剂例如顺铂和其 他DNA烷化剂。损害DNA的试剂还包括干扰DNA复制、有丝分裂和染色 体分离的化合物。此类化学治疗化合物包括但不限于阿霉素也称为多柔 比星、依托泊苷、维拉帕米、鬼臼毒素等。这些化合物广泛用于临床设 置中用于治疗赘生物，并且通过弹丸注射对于阿霉素以21天间隔以范 围为25-75M/²的剂量静脉内施用，对于依托泊苷静脉内35-50Mg/M²或经口加倍静脉内剂量。

破坏核酸前体和亚基的合成和保真度的试剂还导致DNA损害并且作 为化学治疗剂在本发明中有用。许多核酸前体已得到开发。特别有用的 是已经历广泛测试且可容易获得的试剂。像这样，试剂例如5-氟尿嘧啶 （5-FU）优先通过赘生物组织使用，使得这种试剂对于靶向赘生物细胞 特别有用。递送的剂量可以范围为3-15mg/kg/天，尽管其他剂量可 以根据多种因素相当大地改变，所述因素包括疾病阶段、细胞对治疗的 顺应性、对试剂的抗性量等。

在优选实施方案中，在本发明中使用的抗癌剂（例如本文讨论的抗 血管生成因子）是可顺应于与含有一种或多种形式的硒的组合物共施 用，或另外与含有一种或多种形式的硒的组合物结合，使得它们可以递 送到受试者、组织或细胞内，而无抗癌效应的保真度的丧失。关于癌症 治疗剂的更详细描述，所述癌症治疗剂例如铂络合物、维拉帕米、鬼臼 毒素、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法 仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、阿霉素、更生霉素、柔红霉素、 多柔比星、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、依托泊苷（VP16）、它莫 西芬、泰素、反铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和氨甲蝶呤和其他 相似的抗癌剂，本领域技术人员参考任何数目的指导手册，包括但不限 于医生的案头参考和Goodman和Gilman's"Pharmaceutical Basis of  Therapeutics"第九版，编辑Hardman等人，1996。

V.抗氧化剂

在本发明的一些实施方案中，抗氧化剂与本发明的组合物或制剂共 施用。本发明并不受利用的抗氧化剂类型限制。事实上，多种抗氧化剂 考虑在本发明中是有用的，包括但不限于烷基化二苯胺、N-烷基化苯二 胺、苯基-α-萘胺、烷基化苯基-α-萘胺、二甲基喹啉、三甲基二氢喹 啉和由其衍生的寡聚组合物、受阻酚、烷基化氢醌、羟基化硫代二苯醚、 次烷基双酚、硫代丙酸酯、金属二硫代甲氨酸酯、1,3,4-二巯基噻二唑 和衍生物、油溶性铜化合物等、Naugalube.RTM.438、Naugalube438L、 Naugalube640、Naugalube635、Naugalube680、Naugalube AMS、 Naugalube APAN、Naugard PANA、Naugalube TMQ、Naugalube531、 Naugalube431、Naugard BHT、Naugalube403和Naugalube420、抗 坏血酸、生育酚包括α-生育酚、水溶性抗氧化剂例如巯基化合物及其 衍生物（例如偏亚硫酸氢钠和N-乙酰-半胱氨酸）、硫辛酸和二氢硫辛 酸、白藜芦醇、乳铁蛋白、抗坏血酸衍生物（例如抗坏血酸棕榈酸酯和 抗坏血酸多肽）、丁基化羟苯、类视黄醇（例如视黄醇和棕榈酸视黄酯）、 生育三烯酚、泛醌、含有黄酮和异黄酮及其衍生物（例如染料木黄酮和 大豆黄素）的提取物、含有白藜芦醇的提取物等、葡萄籽、绿茶、松树 皮、蜂胶、Irganox1010、1035、1076、1222（由Ciba Specialty Chemicals Co.，Ltd.制造）、Antigene P、3C、FR、Sumilizer GA-80（由Sumitomo  Chemical Industries Co.，Ltd.制造）、β-胡萝卜素、番茄红素、维 生素C、E和A，及其他物质。

尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何 特定作用机制，但在一些实施方案中，给受试者施用含有硒的组合物（例 如可溶性硒、SGP）改变受试者中的基因表达概况（例如TGFB1、MAPK8、 C1R、UBE4A、SMPX、USP22和PTP4A1）。在一些实施方案中，给受试者 施用含有硒的组合物（例如可溶性硒、SGP）减少受试者的DNA损害水 平（例如在脑组织（例如新皮质）、肌肉组织、脂肪组织等中）。

在一些实施方案中，本发明提供了减少细胞对H₂O₂细胞毒性的敏感 性的方法，其包括给细胞施用含有硒的组合物（例如可溶性硒、水溶性 硒、SGP、SEL-PLEX等）。

本发明进一步提供了减少受试者中（例如经历氧化性应激的受试者 中）的超氧化物原子团的方法，其包括给受试者施用包含硒（例如可溶 性硒、水溶性硒、SGP、SEL-PLEX等）的组合物（例如营养补充剂）。 此外，在一些实施方案中，本发明提供了接受包含硒（例如可溶性硒、 水溶性硒、SGP、SEL-PLEX等）的特定组合物的受试者具有增强的处理 氧化性应激的能力。尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发 明并不限于任何特定作用机制，但在一些实施方案中，由于选择形式的 硒（例如可溶性硒、水溶性硒、SGP、SEL-PLEX等）改变（例如减少） 受试者中的超氧化物原子团水平的能力，接受包含硒的组合物（例如包 含硒（例如可溶性硒、水溶性硒、SGP、SEL-PLEX等）的饮食补充剂） 的受试者具有增强的应付氧化性应激的能力。

考虑本发明的组合物和方法在多个设置包括但不限于研究和临床 诊断学中有用。

VI.载体

在一些实施方案中，本发明提供了经由一种或多种载体的硒（例如 含硒糖蛋白）递送，所述载体包括但不限于纳米颗粒（例如纳米胶囊）、 囊泡、脂质体、聚合物（例如分子印迹聚合物（MIPs）、缓慢释放聚合 物、聚阳离子聚合物和/或聚合物泡囊。在一些实施方案中，硒载体提 供了含有硒的化合物（例如水溶性硒、SGP）在受试者（例如人或动物） 中的施用、靶向和/或限时释放。在一些实施方案中，载体（例如缓慢 释放聚合物、纳米胶囊、MIP、聚合物泡囊等）增强含有硒的化合物（例 如有机硒、可溶性硒、水溶性硒、SGP、SEL-PLEX等）对受试者的递送。 在一些实施方案中，载体（例如缓慢释放聚合物、纳米胶囊、MIP、聚 合物泡囊等）增加含有硒的化合物（例如有机硒、可溶性硒、水溶性硒、 SGP、SEL-PLEX等）对受试者的生物利用度。

本发明并不受利用的载体类型限制。事实上，可以使用多种载体， 包括但不限于树枝状聚合物、聚合物泡囊（polymerosomes）、纳米颗 粒、缓慢释放聚合物、纳米胶囊、分子印迹聚合物和/或其他类型的载 体（例如本文描述的任何一种载体）。在一个优选实施方案中，载体是 缓慢释放聚合物。在另一个优选实施方案中，载体是分子印迹聚合物。 在另外一个优选实施方案中，载体是用于封装含硒糖蛋白的聚合物泡 囊。本发明并不受使用的聚合物泡囊类型限制。事实上，可以利用本领 域已知的任何聚合物泡囊。在一些实施方案中，聚合物泡囊包含聚（环 氧乙烷）（PEO）嵌段共聚物。然而，本发明并不受此限制。可以利用 任何已知的嵌段共聚物，包括例如聚（乙基乙烯）（PEE）、聚（丁二 烯）（PB或PBD）、聚（苯乙烯）（PS）和聚（异戊二烯）（PI）。在 一些实施方案中，聚合物包含聚（ε-己内酯）（PCL）二嵌段共聚物。 在一些实施方案中，聚合物泡囊包含基于聚（环氧乙烷）-嵌段-聚（ε -己内酯）（PEO-b-PCL）的二嵌段共聚物。在一些实施方案中，聚合物 泡囊包含其为三嵌段、四嵌段、五嵌段或至少六嵌段共聚物的嵌段共聚 物。在一些实施方案中，聚合物泡囊衍生自聚（乳酸）、聚（乙交酯）、 聚（乳酸共乙醇酸）和/或聚（3-羟基丁酸酯）与PEO的偶联。本发明 并不受聚合物泡囊封装的含硒糖蛋白的大小限制。多个尺寸在本发明的 组合物和方法中有用，包括但不限于其为直径约50-300nm的聚合物泡 囊封装的含硒糖蛋白，尽管可以使用更大（例如约350nm、400nm、500 nm或更大）和更小（例如约40nm、30nm、20nm或更小）的聚合物泡 囊封装的含硒糖蛋白。

在一些实施方案中，本发明包含SGP控制释放纳米胶囊和MIP球体， 以与其他形式的硒（例如富硒酵母、SEL-PLEX或无机硒单一剂量胶囊或 丸剂）相比较，提供有机硒（例如分子印迹聚合物（MIPs）、缓慢释放 聚合物等）的稳定和安全供应。在一些实施方案中，水溶性、可溶性和 /或SGPs用于通过本文的先进递送方法（例如纳米颗粒（例如纳米胶囊）、 囊泡、聚合物（例如分子印迹聚合物（MIPs）、缓慢释放聚合物等）和 /或聚合物泡囊）的硒的有效封装和递送。在一些实施方案中，本文的 先进递送方法增强封装的硒（例如SGPs或可溶性硒）的生物利用度。 在一些实施方案中，本文的先进递送方法提供了硒缓慢释放（例如12 小时、24小时、2天、1周、2周、3周、10周等）到溶液、受试者、 血清等内。

在一些实施方案中，本发明提供了缓慢释放聚合物作为用于本发明 的含有硒的组合物（例如有机硒、可溶性硒、水溶性硒、SGP等）的载 体。缓慢释放聚合物例如聚（乳酸共乙醇酸）（PLGA）或聚阳离子聚合 物例如聚乙烯亚胺（PEI）可以用作载体。在一些实施方案中，缓慢释 放聚合物提供含有硒的组合物（例如有机硒、可溶性硒、水溶性硒、SGP、 SEL-PLEX等）的控制递送。在一些实施方案中，当无论是天然还是合成 的聚合物（例如PEI）与含有硒的组合物（例如有机硒、可溶性硒、水 溶性硒、SGP、SEL-PLEX等）和任选的其他活性剂或无活性试剂以这样 的方式慎重组合，使得含有硒的组合物（例如有机硒、可溶性硒、水溶 性硒、SGP、SEL-PLEX等）以预先设计的方式从材料中释放时，控制递 送发生。含有硒的组合物（例如有机硒、可溶性硒、水溶性硒、SGP、 SEL-PLEX等）的释放可以是经过长时期恒定的，它可以是经过长时期循 环的，或它可以是通过环境或其他外部事件触发的。在一些实施方案中， 控制递送提供更有效的治疗。在一些实施方案中，控制递送消除关于给 药不足和给药过量的可能性。使用控制递送系统的其他优点可以包括硒 水平维持在所需范围内，关于更少施用的需要，和增加的患者顺应性。

在一些实施方案中，本发明提供了聚合物泡囊作为本发明的含有硒 的组合物（例如有机硒、可溶性硒、水溶性硒、SGP、SEL-PLEX等）的 载体。在一些实施方案中，聚合物泡囊使用两性合成嵌段共聚物制备， 以形成囊泡膜，并且具有范围为约50nm至约10μm或更多的半径（参 见例如通过引用整体合并入本文的Discher等人Journal of Physical  Chemistry B（2002），106（11），2848-2854））。在一些实施方案 中，聚合物泡囊在其核心中含有水溶液，并且用于封装且保护分子，例 如含有硒的组合物（例如有机硒、可溶性硒、水溶性硒、SGP、SEL-PLEX 等）和任选的药物、酶、其他蛋白质和肽以及DNA和RNA片段中的一种 或多种。在一些实施方案中，聚合物泡囊膜提供了使封装材料与外部材 料分离的物理障碍，例如在生物系统中发现的那些。在一些实施方案中， 聚合物泡囊允许在其核心内的内容物的限时释放（例如含有硒的组合物 （例如有机硒、可溶性硒、水溶性硒、SGP、SEL-PLEX等））。在一些 实施方案中，使用合成聚合物构建聚合物泡囊致使设计者操纵膜的特 征，并且因此控制渗透性、释放速率、稳定性和其他性质。

在一个实施方案中，本发明的含有硒（例如可溶性硒、水溶性硒、 SGP）的组合物可以封装在基于聚（环氧乙烷）-嵌段-聚（ε-己内酯） （PEO-b-PCL）的聚合物泡囊内。尽管机制的理解不是实践本发明必需 的，并且本发明并不限于任何特定作用机制，但在一些实施方案中，PEO 提供所得的载体改善的体外化学和机械稳定性、增强的体内生物利用度 和延长的血液循环半衰期。PCL，众所周知的可植入生物材料，形成聚 合物泡囊膜，并且通过其酯键的水解促进所得到的产物的完全和安全的 体内降解。

在另一个实施方案中，本发明的含有硒的组合物（例如含硒糖蛋白） 可以封装在由其他生物可降解的嵌段聚合物的掺合物或纯衍生物合成 的聚合物泡囊中，所述嵌段聚合物衍生自聚（乳酸）、聚（乙交酯）、 聚（乳酸共乙醇酸）或聚（3-羟基丁酸酯）与PEO的偶联。

在一些实施方案中，本发明提供了纳米胶囊（通过引用整体合并入 本文的Couvreur等人Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.2002；19 （2）:99-134）作为本发明的含有硒的组合物（例如有机硒、可溶性硒、 水溶性硒、SGP、SEL-PLEX等）的载体（参见例如通过引用整体合并入 本文的美国专利号7,498,045）。在一些实施方案中，纳米胶囊在纳米 胶囊的生物降解后提供了含有硒的组合物（例如有机硒、可溶性硒、水 溶性硒、SGP、SEL-PLEX等）的控制释放。在一些实施方案中，纳米胶 囊具有约2-约100个小时（例如约2小时…4小时…6小时…12小时… 24小时…48小时…96小时等）的生物降解半衰期。在一些实施方案 中，本发明的生物可降解的纳米胶囊适合于含有硒的组合物（例如有机 硒、可溶性硒、水溶性硒、SGP、SEL-PLEX等）和任选的多种其他封装 的治疗剂（包括大分子）在对其施用后控制释放到受试者的体内循环内。 本发明的纳米胶囊组合物进一步适合于封装治疗有效浓度的含有硒的 组合物（例如有机硒、可溶性硒、水溶性硒、SGP等），并且将其递送 到接受者的体内循环内。在一些实施方案中，纳米胶囊封装含有硒的组 合物（例如有机硒、可溶性硒、水溶性硒、SGP、SEL-PLEX等）是膜， 其包含例如聚乳酸聚合物和聚乙二醇的共聚物。在一些实施方案中，通 过单体的界面聚合或预先形成的聚合物的界面纳米沉积形成纳米胶囊。

在一些实施方案中，本发明提供了分子印迹聚合物作为本发明的含 有硒的组合物（例如有机硒、可溶性硒、水溶性硒、SGP、SEL-PLEX等） 的载体（Mosbach.Trends in Biochemical Sciences，第7卷，第92-96 页，1994.，Wulff.Trends in Biotechnology，第11卷，第85-87页， 1993.，Andersson,等人，Molecular Interactions in Bioseparations （Ngo.T.T.编辑），第383-394页），美国专利号5,959,050，通过 引用整体合并入本文。

实验

提供下述实施例以便证实且进一步举例说明本发明的特定优选实 施方案和方面，并且不预期解释为限制其范围。

实施例1

A.通过酸提取和后续沉淀由SEL-PLEX顺次制备可溶性含硒糖蛋白

将配备机械搅拌器、温度计和电热毯的4L三颈反应器（提取器#1， 参见图1）装满3L去离子H₂O和50ml0.3N HCl。将反应器加热至超 过50℃，并且在搅拌的同时分份加入以1600ppm的600g SEL-PLEX。在 约一小时后，温度达到80℃并且混合物的pH是2.23。通过添加13.5mL 0.3N HCl使pH减少至1.5。反应容器伴随加热和搅拌维持7小时。大 约每小时检查混合物的pH，以确保pH水平维持在1.5。将酸性反应后 混合物（pH1.5）分配到4个1L离心罐内，并且在8℃以4000RCF离 心（离心机#1，参见图1）20分钟。收集上清液（pH1.5）和固体团块。 将上清液加入冰浴（4℃）中的3L3颈反应器（混合器#1，参见图1）， 并且配备含有2N NaOH的滴液漏斗、机械搅拌器和pH电极。在搅拌的 同时将2N NaOH逐滴加入溶液中，直至混合物的pH达到1.85。在NaOH 添加过程中，形成白色沉淀物。搅拌继续30分钟，并且将混合物再次 离心（离心机#2，参见图1），形成上清液和含硒糖蛋白团块。将含硒 糖蛋白团块收集且冷冻干燥（冷冻干燥机#1，参见图1），获得1.635g 白色沉淀物。将以pH1.85的上清液和在pH1.5下形成的团块加入反 应容器（混合器#2，参见图1）中，并且置于冰浴（4℃）中。将混合物 搅拌30分钟，并且随后离心（离心机#3，参见图1和图2），形成湿残 渣固体和以pH1.6的上清液，以后通过后续pH依赖性沉淀用于生成 SGPs（例如如下所述的pH3.0、pH4.0和pH6.0SGP级分）。

B.含硒糖蛋白的pH依赖性沉淀

将pH1.6的上清液置于反应器（混合器#3，参见图2）中，并且在 搅拌的同时将2N NaOH加入溶液中，直至混合物的pH达到3.0。搅拌再 继续30分钟，并且将混合物离心（离心机#4，参见图2），形成上清液 和含硒糖蛋白团块。将以pH3.0的含硒糖蛋白团块（SGP pH3.0）收集 且冷冻干燥（冷冻干燥机#2，参见图2），获得淡灰色沉淀物。将pH3.0 的上清液置于反应器（混合器#4，参见图2）中，并且将2N NaOH加入 溶液中，直至溶液的pH增至4.0。搅拌再继续30分钟，并且将混合物 离心（离心机#5，参见图2），形成上清液和含硒糖蛋白团块。将以pH4.0 的含硒糖蛋白团块（SGP pH4.0）收集且冷冻干燥（冷冻干燥机#3，参 见图2），获得淡灰色沉淀物。将pH4.0的上清液置于反应器（混合器 #5，参见图2）中，并且将2N NaOH加入溶液中，直至溶液的pH增至 6.0。搅拌再继续30分钟，并且将混合物离心（离心机#6，参见图2）， 形成上清液和含硒糖蛋白团块。将以pH6.0的含硒糖蛋白团块（SGP pH 6.0）收集且冷冻干燥（冷冻干燥机#4，参见图2），获得淡灰色沉淀物。 通过离心收集已形成的后续沉淀物。来自末次离心的pH6.0的废水流 含有一些含硒肽、甘露糖和葡萄糖寡糖（例如其可以在酵母生长培养基 或其他营养物质的制备中使用）。该过程不产生毒性废物并且是环境友 好的。

实施例2

可溶性SGP分离和表征

通过SEL-PLEX的酸提取形成的含有以pH1.5的固体残渣的团块用 来自第二次提取的以pH1.85的上清液（参见实施例1）洗涤，以减少 在该过程中使用的水体积，并且溶解在团块内截留的大多数SGP’s。以 pH1.6的在第三次离心后的固体残渣含有显著量的硒，并且可以在喷雾 干燥前与新鲜批的硒酵母掺和，完全利用用于提取的材料。

每个SGP级分的总硒、蛋白质浓度百分比和重量在来自SEL-PLEX 的三次后续提取后求平均值（参见表1）。经提取的SGP级分构成2.0- 2.5重量%的SEL-PLEX和4.3-5.75%的在提取前的SEL-PLEX中存在的 总硒。

在SGP级分的pH和蛋白质重量之间存在正相关，相反对于总硒浓 度则相反（参见表1）。

关于SGP级分的平均蛋白质重量范围为约65-90%重量，并且关于 相同组级分的硒浓度范围为约2900ppm-4900ppm范围。SGP级分含有 4-37重量%的碳水化合物组分。

表1.来自600g SEL-PLEX的三次后续提取的平均结果

通过SEL-PLEX的酸提取形成的以pH1.5的SGP级分的凝胶电泳揭 示不存在对应于高分子量蛋白质或携带大碳水化合物组分的蛋白质的 条带。使用毛细管电泳检测到类似的大小分布，其中低分子量级分占优 势，并且5.1kDa-12.2kDa的低分子量蛋白质包含超过90%的混合物。

在BIO-RAD P10凝胶（直到6小时的保留时间）和BIO-RAD P30凝 胶（小于一小时保留时间）上的以pH3.0、4.0和6.0的三个SGP级分 的尺寸排阻色谱法导致具有保留时间5-10分钟的早期峰和具有保留时 间35-60分钟的宽的晚期峰。早期峰含有显著更多的蛋白质：64.74- 75.24%，和显著更高的硒浓度：2972-4252ppm。在晚期峰中的蛋白质 含量低得多：31.66-54.95%，并且硒浓度显著更低：1193-1858ppm。 这个类型的色谱法可以获得来自粗级分的具有高Se含量的SGP’s，并 且证实这些混合物中的碳水化合物组分的低同质性。

使用来自SEL-PLEX的胰蛋白酶消化的多种肽的0.1M AcONH4（pH 7.5），在SUPERDEX肽10/300GL树脂（AMERSHAM Biosciences；分级 范围7.0-100kDa）上的尺寸排阻色谱法已产生对于SGP样品（10-100kDa 和>100kDa）相似的峰组和对于SEL-PLEX样品完全不同的洗脱模式。仅 具有低于20分钟的洗脱时间的“早期”峰含有硒。将含有硒的洗脱物 收集，冻干且使用SEC ICP MS、MALDI TOF MS和纳米ESI MS/MS技术 分析。结果是互补的并且允许包含硒的肽的检测、鉴定和测序。检测到 的蛋白质的鉴定通过SwissProt数据库检索获得（参见表2）。

表2.来自SEL-PLEX提取物的胰蛋白酶消化的经鉴定的含硒肽和 含硒蛋白质

这种方法最令人惊讶的性质是根据已应用的电泳方法（凝胶电泳和 毛细管电泳），通过来自pH依赖性沉淀的不同SGP级分的色谱分离（例 如离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法）获得的多个级分的蛋白质组成是 相同或非常相似的。如本文描述的，从富硒酵母中提取含硒糖蛋白在低 pH（例如1.5）下是成功的。尽管机制的理解不是实践本发明必需的， 并且本发明并不限于任何特定作用机制，但在一些实施方案中，在用于 SGP提取的酸性条件下，蛋白质核心未显著水解并且主要以其原始形式 存活。在一些实施方案中，生成SEL-PLEX的pH依赖性含硒糖蛋白级分 （例如SGP pH3.0、SGP pH4.0、SGP pH6.0），并且施用（例如单独 或与另一种试剂组合）于受试者（例如，以对受试者递送有机硒（例如 经由经口途径））。

实施例3

生物利用度比较

鸡用七个不同的饮食处理喂养十八天（参见表3和4），以通过测 量鸡胸肌中的含硒量比较来自SEL-PLEX酸提取的SGP’s的pH依赖性 沉淀的硒的生物利用度：

表3.基础饮食的组成和营养素规格

表4.饮食处理

如表5中所示，与喂养SEL-PLEX（SP）补充的饮食的鸡相比较，喂 养补充有SGP级分pH4.0或pH6.0的饮食的鸡在胸肌组织中累积几乎 相同数量的硒沉积物。与对照相比较，喂养SP饮食的鸡和用SGP级分 pH4.0或pH6.0补充的饮食喂养的那些中的组织Se水平超过接受补充 有亚硒酸钠的饲料的鸡两倍。因此，在一些实施方案中，本发明提供了 当施用于受试者时，SP以及SP子代SGP级分（例如pH4.0和pH6.0） 是生物可用的（例如在一些实施方案中，当施用于受试者时（例如如通 过硒对受试者的组织的递送证明的），SP、SGP pH4.0或SGP pH6.0 比无机硒（例如亚硒酸钠）是更多（例如两倍或更多）生物可用的）。

处理 Se，ppm 1-对照 98.9^e2-SS 137.3^d3-SP 327.6^a4-pH1.85 214.8^c5-pH3.0 257.7^b6-pH4.0 326.6^a7-pH6.0 305.4^a

表5.饮食Se来源对肌肉Se浓度的作用

*具有不同字母的值指示结果是统计上显著的（P<0.05）。

实施例4

A.不同饮食硒来源对烤子鸡（broiler）的胸肌中的基因表达概况 的作用

来自实施例3中提及的鸡的胸肌组织用于评估通过下述饮食处理引 起的基因表达概况中的相似性和差异：处理1-基础（对照）；处理2-对 照+0.3ppm亚硒酸钠（SS）；处理3-对照+0.3ppm SEL-PLEX； 处理6-0.3ppm在pH4.0下从SEL-PLEX（SP）中提取的SGP级分。分 析SGP级分pH4.0是因为与用SP获得的那种相比较，它导致在乳腺组 织中几乎等同水平的硒沉积（参见表5）。像这样，在本发明的实施方 案的发展过程中进行实验，以便测定接受SGP级分pH4.0的动物是否 经历在SP喂养的动物中观察到的相似的体内效应（例如基因表达变化）， 或是否存在显著的可测量差异。

动物和组织取样：

在18日龄时，随机选择来自每个处理组（上文以及表3和4中所 述的那些）的五只鸡并且通过氩窒息实施安乐死，随后为颈椎脱位。快 速取出胸肌组织的样品（1克）并且在液氮中速冻。将样品贮存于-80℃ 直至分析时。

微阵列分析：

使用TRIZOL试剂（INVITROGEN，Carlsbad，CA）根据制造商的方 案从冷冻组织中分离总RNA，并且使用RNEASY试剂盒（QIAGEN， Valencia，CA）纯化。通过在260nm处的吸光度定量总RNA，并且通过 琼脂糖凝胶电泳和28S和18S条带的溴化乙啶染色证实完整性。

使用AFFYMETRIX（Santa Clara，CA）Genechip Chicken Genome Array 根据制造商建议的方案执行微阵列概况分析。

使用AFFYMETRIX MAS5.0表达概括算法，基于信噪比强度处理数据 并且将每个探针组标记为P（存在的）、M（边缘的）或A（不存在的）。

生物信息学分析：

GeneSpring GX10.0（Silicon Genetics，Redwood，CA）用于定 量且标准化微阵列数据，并且执行统计和基因表达模式分析。

为了使易误解发现的概率降到最低，排除具有低信号强度的探针组 （通过MAS5.0算法标记为‘不存在的’）进行进一步分析。随后对过 滤的基因表达概况实施单向ANOVA用于鉴定在组间差异表达的探针组， 随后为事后检验，以测定当与对照相比较时，通过硒处理显著改变的基 因。仅不同于对照（P≤0.05）且具有相对应的信号强度倍数变化（FC） ≥1.2的基因视为改变的。

为了在视觉上表示饮食处理对胸肌组织中的基因表达概况的作用， 基于阵列和基因对鉴定为差异表达（ANOVA，P<0.05）的693种基因实 施无监督的分层聚类。如上文详细描述的，SGP级分pH4.0直接衍生自 SP，并且接受SP或SGP级分pH4.0的饮食处理组展示在鸡胸肌组织几 乎等同水平的硒沉积（生物利用度）（参见上表5）。因此，预期硒处 理组（SP和SGP级分pH4.0）将展示等同或高度相似的基因表达变化。 然而且相当令人惊讶的是，在两个处理组之间观察到对基因表达概况的 明确饮食作用（参见图3）。具体地，与SGP级分pH4.0处理组相比较， 在SP处理组的基因表达概况之间观察到显著差异，其中分析的大多数 基因对两个处理组不同响应。与SGP级分pH4.0处理组相比较，通过 SP处理达到的基因表达概况中的这个极大变动是完全出乎意料的，并且 提供关于微量元素生物学的迄今不能利用的见识。

例如，基于阵列和基因对693种差异调节的基因（P<0.05，ANOVA） 实施无监督的分层聚类。在图3中所示的热图中，标准化的基因表达概 况以颜色显示，其反映与每种基因的平均值相比较的表达变化；白色、 黑色或灰色分别代表表达强度水平的减少的变化、增加的变化或无变 化。在热图上的树状图反映处理间的表达概况的相似性程度，而在左侧 上的树状图代表跨越所有处理的个别基因的表达模式的差异。图3中所 示的树状图的长度对应于聚类叶之间的不同性水平（短树状图指示更高 水平的相似性）。

如图4中所示的文氏图表示的，通过比较由SGP级分pH4.0（pH4）、 SP和亚硒酸钠（SS）显著改变的基因数目（P<0.05，FC>1.2）进一步 分析SGP级分pH4.0和SP对胸肌中的基因表达概况的不同作用。分别 存在通过SP、pH4和SS显著改变的198、173和283种基因。仅存在通 过所有三个Se处理组共同调节的21种基因，和通过SP和SGP级分pH 4.0共同调节的46种。分别存在通过SP或SGP级分pH4.0独特改变的 152和127种基因。

例如，鉴定为由于多个硒处理在鸡胸肌组织差异或共同调节的几种 基因显示于图5-7中。

β诱导的转化生长因子（TGFBI68kDa）被认为涉及细胞-基质相 互作用、细胞粘附、迁移和分化。这种基因的突变已关联几种形式的角 膜营养不良。丝裂原活化蛋白质激酶8（MAPK8，也称为JNK1）是MAP 激酶家族的成员。MAP激酶充当多种生物化学信号的整合点，并且涉及 广泛多样的细胞过程例如增殖、分化、转录调节和发育。MAPK8还在细 胞氧化性应激应答、免疫应答以及通过胰岛素发信号途径的碳水化合物 和蛋白质代谢中起重要作用。已知MAPK8的过度活化可以诱导通过胰岛 素受体底物1（IRS1）的磷酸化的胰岛素抗性。

图5提供了通过SS、SP和SGP级分pH4.0共同调节的基因的例子 （例如TGFBI和MAPK8）。图6提供了通过SP和SGP级分pH4.0共同 调节而不是通过SS调节的基因的例子（例如补体成分1R（C1R）和遍在 因子E4A（UBE4A））。补体成分1R（C1R）是涉及先天性免疫系统的补 体级联和病原体去除的蛋白质。用遍在蛋白的蛋白质修饰是用于靶向异 常或短寿命蛋白质用于降解的重要细胞机制。UBE4A编码描述为E4遍在 蛋白因子的U-型盒型遍在蛋白连接酶。UBE4A被认为在除了遍在蛋白化 外的不同生物化学过程（包括生长和/或分化）中具有作用。

图7提供了通过SGP级分pH4.0独特调节的基因的例子（例如X 连锁小肌肉蛋白质（SMPX）和遍在蛋白特异性肽酶（USP22））。X连锁 小肌肉蛋白质（SMPX）是在横纹肌中特异性表达的小蛋白质并且在肌肉 收缩中起重要作用。遍在蛋白特异性肽酶22（USP22）是涉及遍在蛋白 依赖性蛋白质分解过程的基因。USP22已显示是肿瘤生长的正调节物。 增加的USP22表达与癌症进展相关。减少或击倒USP22表达的能力可以 提供肿瘤生长和/或癌症进展的抑制。例如，减少USP22的表达可以下 调Mdm2和细胞周期蛋白E的表达，导致p53和p21的上调表达，导致 人膀胱肿瘤细胞增殖的细胞周期停滞和抑制。

在肌肉组织中通过pH4.0级分引起的独特基因表达模式的进一步 检查获得这种级分中化学形式的硒的潜在治疗用途的另外证据（例如以 预防或减慢肿瘤进展和/或转移）。

例如，KITLG（c-KIT配体）基因编码酪氨酸激酶受体的配体，其是 在生殖细胞和神经细胞发育和造血作用中在子宫中起作用的多效因子； 被认为反映在细胞迁移中的作用的过程。近来，已发现KITLG基因中的 变异，其被认为与睾丸癌的危险增加相关（Kanetsky等人，2009）。此 外，KITLG的同源受体，KIT癌基因基因产物的过表达已在嫌色性肾细 胞癌中得到证明，并且KITLG和KIT的表达已知涉及NIH3T3成纤维细 胞的转化和小细胞肺癌的肿瘤生成（Yamazaki等人，2003）。

令人惊讶的是，观察到来自施用pH4.0级分的受试者的肌肉组织显 著下调KITLG基因，但它的表达水平不受其他硒处理包括SP（关于pH4.0 级分的亲本材料）影响（参见例如图8）。

转移是大多数人癌症中的主因并且是多步过程，其中来自原发性肿 瘤的细胞通过细胞外基质迁移，通过新近形成的血管（肿瘤血管生成） 进入循环且播散至远侧部位（外渗），在其中增殖再次开始。

生长因子受体结合蛋白质2（Grb2）是细胞内信号转导中的关键分 子。它对于细胞周期进展和基于肌动蛋白的运动性是关键的，并且因此 对于更复杂的过程例如上皮形态发生、血管发生和脉管发生是关键的。 这些重要功能使得Grb2成为设计为预防实体瘤通过局部侵袭和转移扩 展的策略的治疗靶。事实上，许多努力目前针对发现阻断或拮抗Grb2 的方法，因为感觉这可以代表有效的抗转移策略（Giubellino，Burke 和Bottaro，2008）。

如图9中所示，Grb2在pH4.0处理的动物与对照和其他硒处理相 比较中是显著下调的，所述其他硒处理包括亚硒酸钠和关于pH4.0的 亲本硒材料；Sel-Plex。

pH4.0级分的潜在抗致癌活性并不限于重要的癌相关基因的下调。 例如，减少乳腺癌细胞中的DNAJA3表达已观察到通过允许白细胞介素 -8的水平增加来增强其迁移（Kim等人，2005）。这个和其他结果强烈 暗示增强癌细胞中的Tid1（DNAJA3）水平负调节其运动性和转移的能力。

DNAJA3在响应pH4.0硒的实验中在肌肉组织中是强烈上调的（图 10），但相对于对照条件，在来自接受其他硒来源的动物的肌肉组织中 保持无应答的。

B.不同硒处理对烤子鸡的肝脏基因表达概况的作用

在进一步表征SP和SGP级分pH4.0的出乎意料的差异基因表达作 用且测定表达的调节是否扩展至其他组织的努力中，如上文实施例4（a） 中所述执行基因表达研究。代替胸肌组织，从实施例3中提及的相同鸡 中收集肝组织并分析。除了SS、SP和SGP级分pH4.0添加的处理组外， 还表征来自另外处理组（SGP级分pH1.85（pH1.85）、SGP级分pH3.0 （pH3）和SGP级分pH6.0（pH6）的鸡的肝脏基因表达概况且与对照处 理组相比较。

根据实施例4（A）中提及的相同实验方案，来自每个处理组的受试 者的肝脏基因表达概况分析鉴定通过不同饮食处理显著改变的1520种 基因（P<0.01，ANOVA）。这些基因的无监督的分层聚类分析显示于 图11中，并且提供了用不同硒来源的处理引起调节基因表达的能力的 大程度变动的另外证据。图11的热图显示了以颜色显示的标准化的基 因表达概况，其反映与每种基因的平均值相比较的表达变化；白色、黑 色或灰色分别代表表达强度水平中减少的变化、增加的变化或无变化。 在热图顶部的树状图反映处理间的表达概况中的相似性程度，而在左侧 上的树状图代表跨越所有处理的个别基因的表达模式的差异。该图中所 示的树状图的长度对应于聚类叶之间的不同性水平（短树状图指示更高 水平的相似性）。

在SP和SGP级分pH4.0之间的差异以及在SGP级分pH3.0和SGP 级分pH6.0之间的差异是显著的，仅少数基因通过用每个硒来源处理 共同调节。一般而言，用SGP级分pH1.85处理对基因表达的作用落入 SP和其他SGP处理组之间（参见图11）。因此，在一些实施方案中， 本发明提供了用SEL-PLEX处理（例如含有的饮食和/或施用）与用从 SEL-PLEX中提取的SGP级分处理（例如含有的饮食和/或施用）相比较 导致不同的生物活性，即使不同硒来源显示在硒生物利用度方面的相似 效应。

实施例5

含硒糖蛋白的聚合物泡囊封装

将在pH4.0和6.0下沉淀的SGPs的1:1混合物（参见例如实施例 1和2）封装到聚合物泡囊内。混合物的硒浓度是3,054ppm并且含有 79.96%蛋白质重量。

为了生成含硒糖蛋白封装的聚合物泡囊，将混合物溶解于pH5.1、 6.2和7.4的水性缓冲液中，并且将悬浮液在振荡平台上混合过夜。通 过离心去除未溶解的SGP。为了制备聚合物泡囊，将基于PEO（2k）-b-PCL （12k）的二嵌段共聚物溶解于有机溶剂（例如二氯甲烷、四氢呋喃或 二甲基亚砜）中，以获得在有机溶液中的1mM PEO-b-PCL聚合物。随 后将溶液沉积到表面粗糙的TEFLON测试条（约1”x1”x1/16”厚） 上，并且置于玻璃小瓶的底部上，粗糙面向上。溶剂在真空下在环境温 度蒸发24-48小时，导致称重1-10mg的共聚物干燥薄膜。

随后将这些薄膜用2-3ml含有以pH4.0和pH6.0的1:1含硒糖 蛋白比的水溶液水合，并且随后在水浴超声处理器中以20-100Hz超声 处理1-2小时。在超声处理完成后，立即将小瓶涡旋1-2分钟，以形成 在基于PEO-b-PCL的聚合物囊泡的水性核心中封装含硒糖蛋白的聚合物 泡囊。聚合物泡囊随后使用LIPOSOFAST挤出机通过所需孔径的聚碳酸 酯膜快速挤出，以获得所需平均直径的聚合物泡囊，在这种情况下，范 围为50-300nm。随后将挤出的聚合物泡囊注入透析盒内用于针对pH7.4 的等渗缓冲液溶液交换24小时，使得所有未封装的含硒糖蛋白被去除。

以pH7.4的聚合物泡囊封装的含硒糖蛋白样品由10mg/ml的起始 含硒糖蛋白浓度制备，并且针对等渗PBS缓冲液透析。这种样品通过 cryo-TEM在21,000x和52,000x的放大率下成像，以获得在聚合物泡囊 内的成功含硒糖蛋白封装的视觉鉴定（参见图13）。Cryo-TEM允许在 致冷温度下的以其天然水合状态的样本成像，从而预防任何不希望有的 构象变化。一般地，在成像样品中观察到约100nm或轻微更小的大小 的均匀球形聚合物泡囊。在一些情况下，除了聚合物泡囊外，还观察到 无定形材料的接近球形的聚集体。这些聚集体可以包含从聚合物泡囊核 心中释放，并且到样品成像时由于从聚合物泡囊的内部到外部的pH差 异进一步沉淀的含硒糖蛋白。

通过测量硒浓度进一步表征以pH5.1、6.2和7.4的聚合物泡囊封 装的含硒糖蛋白（参见表6）。将一ml每种聚合物泡囊封装的含硒糖蛋 白样品冷冻干燥，形成白色粉末沉淀物，其随后称重且在200X放大率 下检查。在100℃-175℃的温度下使用浓酸：高氯酸、硝酸和盐酸溶 解聚合物泡囊封装的含硒糖蛋白的全部量。使用去离子（DI）水将溶液 稀释至50ml，并且使用MILLENIUM EXCALIBUR仪器和方法进行分析。

表6.封装结果

制剂 封装pH 纳米胶囊（mg） Se浓度（ppm）   阴性对照（无硒） 8.0 0.02 1 5.1 4.6 46.5 2 6.2 3.3 39.6 3 7.4 8.4 32.2

实施例6

来自纳米胶囊的含硒糖蛋白释放：

由10mg/ml SGP悬浮液制备且分别针对pH7.4和5.1的缓冲液透 析的，来自上表6的纳米胶囊制剂#1和3的含硒糖蛋白（SGP）释放在 37℃监控经过14天时期。为了监控来自纳米胶囊封装的含硒糖蛋白的 含硒糖蛋白释放，通过膜离心浓缩透析的悬浮液（使用具有300kD的 分子量截断的离心管）。将浓缩的悬浮液等分到等渗缓冲液（pH5.1 或7.4）内，并且维持在37℃，对于每个时间点具有N=2样品。为了 评估来自纳米胶囊的含硒糖蛋白释放%，在每个时间点将样品离心以分 离完整纳米胶囊。为了确定纳米胶囊与含硒糖蛋白样品有效分离，对分 离的囊泡（渗余物）和游离溶液（滤液）执行动态光散射测量，以测量 粒径。游离溶液的UV吸光度在280nm处测量，并且含硒糖蛋白的释放% 计算为（A样品-A起始）/（A最终-A起始），其中A起始是在第0 天时的吸光度，并且A最终是在研究结束时的吸光度，当时样品溶解以 引起完全释放（参见图12）。经过14天时期，约70%的以pH5.1的SGP 以稳态从纳米胶囊中释放；而约50%在pH7.4时释放。在较低pH时SGPs 的起始释放率被认为是由于酸催化的纳米胶囊膜水解，随后为含硒糖蛋 白跨越纳米胶囊膜的稳态扩散。这些释放概况显著类似于封装在基于 PEO-b-PCL的聚合物泡囊内的癌症治疗剂多柔比星的那些（参见例如 Ghoroghchian等人Macromolecules，2006，39（5），1673-1675）。 这些数据证实即使以相对高负荷浓度的含硒糖蛋白封装也不以负面方 式影响释放模式。

实施例7

含硒糖蛋白（SGP）缓慢释放聚合物的制备

聚合物A的合成。在pH4.0和6.0下沉淀的SGPs的1:1混合物（参 见实施例5）用于SGP缓慢释放聚合物的制备中。将150mg SGP溶解于 2ml甲基丙烯酸和1ml DI水中。应用一些加热以加速溶解。将0.5ml 溶液的样品置于含有10mg AIBN的5ml小瓶中，涡旋1分钟，并且在 真空下去除管内的空气并且置换为氮。通过将管置于加热至70℃的实验 室烘箱内2小时使管的内容物聚合。将管破坏并且将聚合物切成薄切片 且在高真空下干燥。

聚合物B的合成。将0.064ml甲基丙烯酸、0.091ml2-羟乙基-甲 基丙烯酸酯、1.427ml乙二醇二甲基丙烯酸酯和10mg AIBN的混合物置 于5ml小瓶中，并且用磁性搅拌棒搅拌，随后为溶解于1.5ml乙酸和 0.75ml DI水的混合物中的75mg SGP。将小瓶中的空气替换为氮，并且 将小瓶密封且置于70℃的油浴中四小时。将小瓶破坏并且将聚合物单块 在瓷研钵中压碎成粉末。在高真空下从聚合物中去除挥发物。

SGP限时释放。相同的SGP缓慢释放方案应用于每种聚合物（A和B）。 将333.7±0.1mg聚合物置于含有5ml柠檬酸缓冲液（pH5.0）的15ml 离心管中，并且将管轻轻振荡四小时。随后将管离心且收集上清液，同 时用两个8ml体积的DI水洗涤聚合物团块并且冷冻干燥。从冷冻干燥 样品中取出～21mg用于Se分析。将SGP提取再重复两次。记录样品的 重量。所有样品在这些处理过程中丧失重量（参见表8和9）。

表8

表9

为了估计释放的SGP的浓度，测量上清液在280nm处的UV吸光度 且与相同缓冲液中制备的SGP校准曲线相比较（参见表10）。

表10.

应用原子吸收光谱学（使用EXCALIBUR方法和仪器），以测量缓慢 释放聚合物中的残留Se浓度（参见表11）。

表11.

根据残留团块中的Se浓度的测量，在三重4小时（总共12小时） 洗涤后，36.08%SGP从聚合物A中释放。在相同处理过程中，30.11%SGP 从聚合物B中释放。

实施例8

细胞内酵母蛋白质的碱提取

将200.0g SEL-PLEX与1L0.1M氢氧化钠在pH11.5下混合且在60℃ 加热8小时。随后将混合物以14,000x g/10分钟/10℃离心，形成上清 液和团块。将团块用400ml DI水洗涤两次，并且冷冻干燥，导致54.5g 的重量（参见表12）。将以pH11.5的上清液和使用的洗涤液混合在一 起。使用浓盐酸通过中和使pH减少至6.6。在中和过程中形成小痕量的 沉淀物和澄清的上清液。通过离心分离沉淀物并且使用AMICON10kDa 超滤装置浓缩上清液。将浓缩物用两个100ml部分的DI水洗涤并且冷 冻干燥，获得64.0g褐色固体。合并剩余滤液（总体积21）且分析硒浓 度。分离的沉淀物就硒和氮/蛋白质进行分析（参见表12）。

表12：碱提取

滤液分析指示40.7%的质量丧失和48.7%的硒丧失，其通过超滤经 由10kDa膜未得到回收。来自含硒肽的这些官能团的MeSe-1和HSe-1 和氧化形式的β-亲核/热消除导致SGP’s的原始化学结构的降解以及 质量和硒进入滤液内的丧失。本领域通常实践的生产过程产生增加的体 积和滤液中升高浓度的硒，其导致可能具有有害或具有不利效应的废物 流（例如对环境有害）。相比之下，本发明的方法提供了来自富硒酵母 的SGPs的酸提取和pH依赖性分级（例如在大规模商业过程中）。在不 同温度的条件下，发现使用碱水解的传统/常规技术在来自酵母细胞的 含硒糖蛋白提取中不起作用。如本文描述的，发现使用酸提取从酵母细 胞中提取SGP’s是成功的。

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下述参考文献通过引用整体合并入本文，如同它在本文中完全阐述 一样。

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