皮肤特异表达绵羊β-catenin基因的表达盒、重组质粒以及它们的应用

摘要

本发明公开了一种皮肤特异表达绵羊β-catenin基因的表达盒、重组质粒以及它们的应用。本发明提供了一种DNA分子，自上游至下游依次包括人皮肤特异性启动子K14和β-catenin基因。所述β-catenin基因编码序列表的序列2所示的β-catenin蛋白。所述人皮肤特异性启动子K14具体可如序列表的序列1自5’末端第12至2011位核苷酸所示。本发明提供了相应的表达盒和重组质粒，能够在动物皮肤中特异驱动β-catenin基因表达，促进皮肤毛囊生长，在不损害个体正常生长的前提下提高动物的产毛量和产毛品质。

说明书

技术领域

本发明涉及一种皮肤特异表达绵羊β-catenin基因的表达盒、重组质粒以及它们 的应用。

背景技术

毛囊是控制毛发生长的一个复杂的皮肤附属结构，在胚胎期形成，主要由毛乳头、 毛母质、内根鞘、外根鞘、隆突区和毛干等结构组成。毛囊形态发生的信号起源于真 皮，随后一系列的信号分子穿梭于上皮细胞和真皮细胞之间，介导这两个细胞群体之 间的相互作用，促使上皮细胞和真皮细胞的增殖、分化、迁移及其之间相互连接的一 系列活动，最终形成完整的毛囊。毛发的生长是一个周期性过程，分为生长期、退行 期和静止期。各个时期的发动和持续时间因绵羊品种而异，毛囊干细胞的分化在毛囊 周期性变化过程中起了重要作用。毛囊的各性状决定了羊毛的产量和品质，毛囊的周 期性变化引起了绵羊羊毛的脱落，因此了解毛囊的性状及其周期性变化规律是提高羊 毛产量和品质的重要基础。

Catenins是与钙黏着蛋白结合形成复合物的一种蛋白家族，分为α、β、δ、γ4 个亚型。其中β-catenin是一种具有双重功能的蛋白，最早是由德国细胞生物学家 Walt Birchmeier发现。β-catenin既可以作为一种黏附分子参与细胞之间的黏附连 接，又可以经由WNT信号通路参与调节基因的转录。在没有WNT配体存在的情况下， 大部分的β-catenin与钙黏着蛋白结合参与细胞间的黏附连接，少部分的β-catenin 与Axin、APC、CKI和GSK-3β结合形成复合物。CKI首先引起β-catenin第45位残 基磷酸化，此反应又进一步催化GSK-3β对β-catenin33、37、41位残基发生磷酸化 作用，被磷酸化标记的β-catenin被泛素连接酶β-Trcp蛋白识别进而泛肽化，最终 进入泛素降解途径降解，胞浆中游离的β-catenin水平极低；WNT信号传入时，WNT 蛋白与FRZ胞外结合，在LRP协同作用下，Dvl被募集至细胞膜附近，Dvl促使GSK-3 β磷酸化，使其从Axin复合物上脱落，从而避免进入泛素降解途径。脱落的β-catenin 在胞浆中聚集，达到一定浓度时，通过核孔进入细胞核。在细胞核内，β-catenin与 Tcf/Lef结合，促进靶基因的激活转录。实验表明β-catenin作为信号分子穿梭于上 皮细胞和表皮细胞之间，介导二者之间的相互作用，在毛囊形成过程中扮演重要的角 色。胚胎期干扰β-catenin基因的表达，将不会形成正常的毛囊结构；在出生后干扰 β-catenin基因的表达则导致在第一个毛发周期之后毛发脱落，不会进入下一个生长 周期；敲除掉β-catenin基因之后，毛囊干细胞也不会分化形成毛囊细胞。反之，在 胚胎期增加β-catenin的表达水平能够引起毛囊数目的增加，而且会诱导毛发由静止 期提前进入生长期。然而，β-catenin在毛囊形成和周期性变化过程中的作用方式和 作用机理还不是很明确。

发明内容

本发明的目的是提供一种皮肤特异表达绵羊β-catenin基因的表达盒、重组质粒 以及它们的应用。

本发明提供了一种DNA分子，自上游至下游依次包括人皮肤特异性启动子K14和 β-catenin基因。

所述β-catenin基因编码序列表的序列2所示的β-catenin蛋白。

所述β-catenin基因具体可如序列表的序列1自5’末端第2226至4571位核苷 酸所示。

所述人皮肤特异性启动子K14具体可如序列表的序列1自5’末端第12至2011 位核苷酸所示。

所述DNA分子具体可如序列表的序列2自5’末端第12至4728位核苷酸所示。

所述DNA分子中，在所述β-catenin基因的下游还可具有IRES序列和荧光标记 基因。

所述IRES序列具体可如序列表的序列1自5’末端第4735至5319位核苷酸所示。

所述荧光标记基因具体可为序列表的序列1自5’末端第5323至6039位核苷酸 所示的EGFP基因。

所述DNA分子具体可如序列表的序列2自5’末端第12至6039位核苷酸所示。

含有以上任一所述DNA分子的质粒也属于本发明的保护范围。所述质粒具体可为 序列表的序列1所示的质粒。序列1中自5’末端第12至2011位核苷酸为人皮肤特 异性启动子K14，第2217至2225位核苷酸为Kozak序列，第2226至4571位核苷酸 为β-catenin基因，第4572至4728位核苷酸为β-catenin基因的3’UTR区域，第 4735至5319位核苷酸为IRES序列，第5323至6039位核苷酸为EGFP基因。

本发明还保护以上任一所述DNA分子或所述质粒的应用；所述应用为如下（a）或 （b）或（c）或（d）：（a）表达β-catenin基因；（b）制备用于促进动物皮肤毛囊进 入生长期的产品；（c）促进动物皮肤毛囊进入生长期；（d）制备在动物皮肤中表达 β-catenin基因的产品。所述动物具体可为C57BL/6J小鼠或绵羊（具体可为细毛羊， 如敖汉细毛羊）。所述表达β-catenin基因具体可为在动物皮肤中特异表达 β-catenin基因。所述β-catenin基因编码序列表的序列2所示的β-catenin蛋白。 所述β-catenin基因具体可如序列表的序列1自5’末端第2226至4571位核苷酸所 示。

启动子是基因表达调控中最为关键的一个调控因子，决定了基因的转录与否。启 动子的种类有很多，组织特异性启动子除了具备启动子的基本元件之外还有一些调控 特异表达的序列。在特异性表达启动子的调控下，外源基因能够只在特定的组织表达。 本发明提供了相应的表达盒和重组质粒，能够在动物皮肤中特异驱动β-catenin基因 表达，促进皮肤毛囊生长，在不损害个体正常生长的前提下提高动物的产毛量和产毛 品质。

附图说明

图1为pIRES2-EGFP质粒的结构示意图。

图2为实施例1的步骤一的2中PCR扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳图；M为分子 量标记，1至4为PCR扩增产物。

图3为实施例1的步骤一的7中PCR扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳图；M为分子 量标记，1至5为PCR扩增产物。

图4为重组质粒K14-β-catenin-IRES-EGFP的结构示意图。

图5为β-catenin基因的在不同组织中的相对表达量（部分结果）。

图6为溶解曲线。

图7为阳性鼠59-2荧光下观察的结果。

图8为阳性鼠59-2和非阳性鼠石蜡切片和HE染色后的照片。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。pIRES2-EGFP质粒（结构示意图见图1）：北京天恩泽基因科技有限 公司，CAT#:80501-2。C57BL/6J小鼠：上海南方模式生物科技发展有限公司。

实施例1、质粒的构建和应用

一、皮肤特异表达绵羊β-catenin基因的重组质粒的构建

1、提取人血液组织的基因组DNA。

2、以步骤1的基因组DNA为模板，用K14F和K14R组成的引物对进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物。

K14F：5′-CATTAATATCCCTGCAGAAGAAGGAGAC-3′；

K14R：5′-ATAAGCGCTGGCTGAGTGAAGAGAAGG-3′。

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸2min， 30个循环；72℃再延伸10min。

PCR扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳图见图2。可观察到2000bp左右的特异性条带。

3、用限制性内切酶AseI和AfeI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶AseI和AfeI双酶切pIRES2-EGFP质粒，回收约4700bp的载 体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒K14-IRES-EGFP。 重组质粒K14-IRES-EGFP中，人皮肤特异性启动子K14取代了pIRES2-EGFP质粒原有 的CMV启动子（组成型启动子）。

6、提取敖汉细毛羊皮肤的总RNA并反转录为cDNA。

7、以步骤6的cDNA为模板，用JDF和JDR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物。

JDF：5′-CGGAGACGGAGCAAGGT-3′；

JDR：5′-GCAAGCAAAGTCAGTACCAT-3′。

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸2min40s， 33个循环；72℃再延伸10min。

PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图见图3，可观察到2700bp左右的特异性条带。

8、以步骤7的PCR扩增产物为模板，用F和R组成的引物对进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物。

F：5′-TCCCCGCGGCGGAGACGGAGCAAGGT-3′；

R：5′-CGCGGATCCGCAAGCAAAGTCAGTACCAT-3′。

9、用限制性内切酶SacII和BamHI双酶切步骤8的PCR扩增产物，回收酶切产物。

10、用限制性内切酶SacII和BamHI双酶切重组质粒K14-IRES-EGFP，回收约 6700bp的载体骨架。

11、将步骤9的酶切产物和步骤10的载体骨架连接，得到重组质粒 K14-β-catenin-IRES-EGFP。

重组质粒K14-β-catenin-IRES-EGFP的测序结果见序列表的序列1。序列1中自 5’末端第12至2011位核苷酸为人皮肤特异性启动子K14，第2217至2225位核苷酸 为Kozak序列，第2226至4571位核苷酸为β-catenin基因，第4572至4728位核苷 酸为β-catenin基因的3’UTR区域，第4735至5319位核苷酸为IRES序列，第5323 至6039位核苷酸为EGFP基因。

重组质粒K14-β-catenin-IRES-EGFP的结构示意图见图4。

重组质粒K14-β-catenin-IRES-EGFP导入动物后，在人皮肤特异性启动子K14 的驱动下，β-catenin基因在皮肤组织中特异表达，由于IRES序列的存在，EGFP基 因同时表达（EGFP是一种突变型的GFP，产生的荧光是普通GFP的35倍，可在多种异 源生物中表达且无细胞毒性）。本发明提供的重组质粒，可以通过原核注射方法制备转 基因动物，能够得到皮肤特异性高表达的动物家系。

二、应用步骤一制备的重组质粒在小鼠皮肤中特异表达绵羊β-catenin基因

1、用限制性内切酶Ase1酶切重组质粒K14-β-catenin-IRES-EGFP，得到线性化 质粒。

2、取C57BL/6J小鼠（雄）和C57BL/6J小鼠（雌）的受精卵480枚，注射步骤3 得到的线性化质粒，然后移植到24只假孕母鼠的输卵管中（每只假孕母鼠注射20枚 受精卵），11只母鼠怀孕（受精卵的移植成功率为45.83%），共获得93只子代小鼠。

3、分别提取步骤2得到的各个子代小鼠的尾部组织，提取基因组DNA，用JDF和 JDR组成的引物对进行PCR鉴定，然后将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

PCR反应体系：10×PCR Buffer2.5μl，Ex Taq0.3μl，dNTP2.5μl，基因组 DNA1.0μl，JDF0.5μl，JDR0.5μl，ddH2O17.7μl。

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸3min， 35个循环；72℃再延伸10min。

如果显示2800bp左右的特异性条带，该小鼠为阳性小鼠。

93只子代小鼠中，10只为阳性小鼠，阳性率为10.75%。

将阳性小鼠命名为Founder鼠，即首建鼠F0。

4、将性成熟的Founder鼠（8周龄）与8周龄的C57BL/6J小鼠交配，得到的子 代鼠即为F1代鼠。

5、将步骤4得到的F1代鼠（2周龄）剪尾并提取基因组DNA，用JDF和JDR组成 的引物对进行PCR鉴定，如果1%琼脂糖凝胶电泳显示2800bp左右的特异性条带，该 小鼠为阳性小鼠。F1代小鼠中共获得38只F1代阳性鼠。

6、分别取步骤5得到的各个F1代阳性鼠的皮肤、肌肉和肺脏组织，提取总RNA 并反转录为cDNA，通过荧光定量PCR检测各个组织中绵羊β-catenin基因的表达量。

用于检测β-catenin基因的引物对如下：

β-catenin-F：5′-AGCGTCGTACATCTATGGG-3′；

β-catenin-R：5′-ATAATCCTGTGGCTTGACC-3′。

用于检测持家基因Actin引物如下：

Actin-F：5′-TTGCTGACAGGATGCAGAAGGAGA-3′；

Actin-R：5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATCT-3′。

荧光定量PCR反应体系（20μl）：Real Master Mix(SYBR^TM Green I)10μl， 上游引物和下游引物各1μl，cDNA1μl，ddH2O7μl。各个试剂购自加拿大新产业科 技公司。

PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性10s、58℃退火10s、72℃延伸30s， Plate Read，40个循环；95℃10s、65℃5s、95℃5s，Plate Read。

38只F1代阳性鼠的肌肉组织和肺脏组织中均未检测到β-catenin基因的表达。 38只F1代阳性鼠的皮肤组织中均可以检测到β-catenin基因的表达。

β-catenin基因的在不同组织中的相对表达量（部分结果）见图5。

溶解曲线见图6。

7、分别剪取步骤5得到的各个F1代阳性鼠的尾部组织，放入1.5ml离心管中， 置于荧光下观察。

38只F1代阳性鼠均可观察到小鼠尾部发出绿色荧光。阳性鼠59-2的结果见图7 （Wt为C57BL/6J小鼠）。

8、分别取阳性鼠59-2和同窝出生的非阳性鼠的背部皮肤，进行石蜡切片和HE 染色，照片见图8（A为阳性鼠59-2，B为非阳性鼠）。阳性鼠59-2的毛囊已经开始进 入生长期，而非阳性鼠的毛囊大部分处于静止期。