骨骼肌特异表达卵泡抑制素基因转基因绵羊研究

摘要

体细胞核移植技术和转基因技术的发展为转基因动物新品种的培育提供了新的技术平台。卵泡抑制素(follistatin,FST)具有促进肌肉生长和增加肌肉力量的功能,是近几年高产肉量家畜研究和治疗肌肉萎缩的热点基因。本研究通过将体细胞核移植技术和转基因技术相结合,定向培育高产肉量转FST基因绵羊。实验构建了骨骼肌特异表达卵泡抑制素基因真核表达载体,得到其稳定转染的蒙古绵羊胎儿成纤维细胞系,以稳定转染外源基因的细胞为核供体,以成熟的绵羊卵母细胞为受体,通过体细胞核移植技术制备转基因胚胎,经胚胎移植制备转基因蒙古绵羊。
　　 1.骨骼肌特异表达卵泡抑制素真核表达载体的构建
　　 通过RT-PCR方法克隆得到FST基因cDNA序列。酶切含有猪α-actin5’端调控区的骨骼肌特异启动子骨架载体,得到pCCDS,连接FST cDNA和pCCDS,构建成骨骼肌特异表达FST的真核表达载体pCFCDS,酶切和PCR鉴定构建的载体；连接FST基因cDNA与人工合成肌肉特异启动子SP片段,得到中间载体p19T-SPF,酶切p19T-SPF得到目的片段SPF,连接SPF片段与骨架载体pCDsReD2,构建成骨骼肌特异表达FST基因真核表达载体pSPFCDS,酶切及PCR鉴定载体。
　　 2.表达载体转染绵羊胎儿成纤维细胞
　　 利用脂质体介导法分别将骨骼肌特异表达载体pCFCDS和pSPFCDS转入蒙古绵羊胎儿成纤维细胞中,通过G418和红色荧光蛋白双筛选标记筛选得到稳定转染外源基因的转基因细胞克隆。扩大培养转基因细胞后,对其进行外源基因PCR鉴定,选取阳性克隆绘制生长曲线并分析其染色体数目。经鉴定,筛选出的细胞稳定表达目的基因,生长曲线与染色体数目基本正常,可以作为后续工作中体细胞核移植的核供体细胞。
　　 3.转基因胚胎的制备与转基因绵羊的生产
　　 绵羊卵母细胞经体外成熟培养后,通过显微操作去除其细胞核与第一极体,注射入稳定转染pCFCDS或pSPFCDS载体的转基因细胞,电融合后经5μMIA231875min+2mM6-DMAP4hr激活方法激活重构胚,重构胚在体外发育到4-8细胞期时通过胚胎移植方法移入同期发情的受体母羊输卵管。绵羊卵母细胞体外培养成熟率为67％,融合率为78.2％,重构胚卵裂率为68.6％,八细胞率为83.9％,囊胚率发育为22％。
　　 实验共移植87只受体母羊,怀孕14只,怀孕率为16.1％,顺利出生5只,经PCR鉴定5只均有外源目的基因的整合,RT-PCR结果表明外源目的基因在转基因蒙古绵羊骨骼肌中特异转录。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

第一部分 实验研究

第一章 骨骼肌特异表达FST基因载体的构建

摘要

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第二章 绵羊转基因细胞系的建立

摘要

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献:

第三章 转基因胚胎的制备与转基因绵羊的生产

摘要

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

结论

图版一

图版二

图版三

图版四

图版五

第二部分 文献综述

参考文献

致谢

硕士期间论文发表情况