一种表达IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白重组火鸡疱疹病毒

摘要

本发明涉及一种表达IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白重组火鸡疱疹病毒，属于基因工程和生物制品研究领域。将10拷贝法氏囊素三肽（BS10）嵌合IBDV VP2基因表达盒与火鸡疱疹病毒（HVT）结合在一起，获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒（rHVT-BS10-VP2），该病毒同时也是一种马立克氏病和鸡传染性法氏囊病的二联重组疫苗。本发明的二联重组疫苗，不仅可以对鸡MD起到良好的免疫保护作用，而且在具有高IBDV母源抗体水平的商品化鸡群中可以诱导抗IBDV的持久保护性免疫，与现有的鸡传染性法氏囊病病毒火鸡疱疹病毒载体活疫苗(vHVT-013-69株)相比，rHVT-BS10-VP2免疫组的保护率（100％)高于rHVT-VP2免疫组的保护率(93.3％)。

说明书

一、技术领域

   本发明属于基因工程和生物制品研究领域。具体涉及一种表达IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白的重组火鸡疱疹病毒。

二、背景技术

鸡马立克氏病(Marek’s disease，MD) 和鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal

disease，IBD) 是两种影响家禽生产最常见的免疫抑制性疾病。其中IBD 是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV) 引起，主要危害3 周龄～12 周龄青年鸡的急性、高度接触性传染病。变异株和超强毒株（vvIBDV）的出现使该病的防控难度加大，IBD免疫预防失败已成为禽病防控中的重要问题。

目前商品化的传染性法氏囊病活毒疫苗分为弱毒、中毒和强毒三类。弱毒活疫苗

对SPF 鸡安全，但对有母源抗体鸡群的免疫保护力很差。中等毒力和强毒疫苗的免疫保护

力虽然要高很多，但由于具有一定的致病力而损伤法氏囊。同时，由于母源抗体的干扰以及IBDV 的特点，在实际应用中传统疫苗可形成不可避免的免疫空白期。因此，在当前IBD防控实际工作中，急需免疫效力强、生物安全性高新型IBD 疫苗。

MD 是由马立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV) 引起的鸡淋巴组织增生性疾病，以外周神经、虹膜、皮肤、肌肉和内脏器官的淋巴样细胞浸润，增生和肿瘤形成为特征。MDV 疫苗株可作为活病毒载体来表达外源基因，对其分子生物学的研究表明，MDV基因组较大，并已经确定了多处病毒复制非必需区，其本身是优良的病毒表达载体。相较于其它病毒载体，MDV 作为载体具有独特的优势，MDV为严格的细胞结合型，可以突破母源抗体的干扰，适合早期免疫，通过鸡胚免疫，操作更方便。并且，一次免疫可诱发终生的细胞和体液免疫应答，节约成本。基于以上特点，以MDV 为载体进行的活疫苗研究倍受青睐，而火鸡疱疹病毒(HVT) 为其中的一种α 疱疹病毒，因其与MDV 抗原相关性，同时又由于HVT 与MDV 有明显区别对鸡无致病性，被广泛用作预防马立克氏病(MD)的活疫苗。

法氏囊(BF)是禽类特有的免疫器官，为B细胞发育、成熟提供微环境，是免疫球蛋白基因转变场所；其免疫活性物质为三肽囊素(Bursin，BS) ，它能诱导家禽和哺乳动物B细胞前体分化；其靶器官是BF，能够拮抗IBD疫苗对BF的损伤，提高ND弱毒疫苗及油苗产生抗体水平。因此如何能够以火鸡疱疹病毒(HVT) 为载体进行鸡传染性法氏囊病(IBD) 的高效活疫苗研究成为一项亟待攻克的难题。

三、发明内容

技术问题

本发明的发明人提供了一种重组火鸡疱疹病毒(rHVT-BS10-VP2)，不仅可以对鸡MD 起到良好的免疫保护作用，而且在具有高IBDV 母源抗体水平商品化鸡群中可以诱导抗IBDV 的持久保护性免疫。

技术方案  

一种表达IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白的重组火鸡疱疹病毒rHVT- BS10-VP2，其特征在于：其携带在启动子序列控制下的10拷贝法氏囊素三肽（BS10）嵌合IBDV VP2基因表达盒的基因序列如SEQ ID NO.1 所示。

所述的表达IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白的重组火鸡疱疹病毒rHVT- BS10-VP2，其制备方法如下：

1) 10拷贝法氏囊素三肽BS10寡核苷酸的合成：选用编码赖氨酸Lys、组氨酸His和甘氨酸Gly的常用密码子按顺序排列成BS基因：5'-AAGCATGGC-3’，连续合成l0个BS，BS 串连基因单链及其反向互补链，通过退火使其复性成双链；

2) 含IBDV VP2 和BS10 嵌合基因表达盒的火鸡疱疹病毒HVT转移载体的构建: 根据已注册的GenBank NO .X00221.1的gpt基因序列设计引物，以E.coliDH₅α DNA为模板采用PCR方法扩增gpt基因，用其作为外源筛选基因，与质粒pEGFP中的CMV启动子及poly(A)连接构建gpt表达盒CMV-gpt-poly A，经酶切测序验证后，插入到含有火鸡疱疹病毒HVT非必需区US10、SORF3两侧基因的同源臂克隆质粒pUAB中，构建带有筛选基因表达盒的克隆质粒pUAB-gpt；将BS10-VP2 嵌合基因插入到pUAB-gpt中，获得重组火鸡疱疹病毒转移载体pUAB-gpt-BS10-VP2 ，大小为10100bp；

3) 表达嵌合蛋白的重组火鸡疱疹病毒的制备: 采用脂质体介导法，将重组转移载体质粒pUAB-gpt-BS10-VP2与HVT-FC126株基因共转染原代鸡胚成纤维细胞CEF，待出现病毒噬斑后，利用霉酚酸MPA阻断核酸代谢途径，经过筛选获得纯化的重组病毒rHVT- BS10-VP2。

所述的重组火鸡疱疹病毒rHVT-BS10-VP2，其在禽类宿主中诱导抗禽类疱疹病毒和鸡传染性法氏囊病毒的保护性免疫的应用，其也可作为疫苗株应用。

有益效果

1）将10拷贝法氏囊素三肽（BS10）嵌合IBDV VP2基因表达盒插入HVT 基因组中的位置位于HVT FC126 基因组(ACCESSION NO.NC_002641) 的非必需区US10基因和SORF3基因之间，更具体的位置为HVT FC126基因组(ACCESSION NO.NC_002641) 的138687bp- 138826bp 位置之间，获得了一种免疫增强型重组火鸡疱疹病毒rHVT-BS10-VP2，该病毒同时也是一种马立克氏病和鸡传染性法氏囊病的二联疫苗，rHVT-BS10-VP2 不仅可以对鸡MD 起到良好的免疫保护作用，而且在具有高IBDV 母源抗体水平商品化鸡群中可以诱导抗IBDV 的持久保护性免疫，与现有的鸡传染性法氏囊病病毒火鸡疱疹病毒载体活疫苗(vHVT-013- 69株)相比， rHVT-BS10-VP2免疫组的保护率（(100％)高于rHVT-VP2免疫组的保护率(93.3％ )。

2) 以gpt为筛选基因构建的rHVT-BS10-VP2重组病毒能够表达gpt，该酶利用外源黄嘌呤完成了鸟嘌呤的外源补救合成，从而使得重组病毒DNA的复制能够正常进行，可经过几轮筛选野生病毒全部死亡，而重组病毒逐渐可得到富集和纯化。

 

四、附图说明

图1 为rHVT-BS10-VP2重组病毒的DNA 序列模式图；

图2 HVT 基因组插入BS10-VP2示意图；

图3 筛选标记基因gpt的表达盒Egpt（CMV-gpt-poly A）扩增结果电泳示意图； 

图4 为BS10-VP2 PCR扩增结果电泳示意图；

图5 为重组质粒pUAB-gpt-BS10-VP2构建过程示意图。

五、具体实施方式

IBDV变异株AH1株（见参考文献：王永山 等. 近期引起免疫失败的传染性法氏囊病病毒VP2基因的分子特征. 中国兽医科学，2008, 38(12): 1013-1019）VP2基因系用RT-PCR方法从2007年12月在安徽引起免疫失败的IBDV变异株（AH1）中克隆，该变异株具有IBDV强毒株全部的标志性氨基酸残基，VP2基因七肽基序为SWSASGS，在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸残基分别是A、Q、I、D、A、I和S，与现行商品疫苗毒株B87的VP2基因序列有较大差异。因此，对当前IBDV的防控更具有针对性和实际意义。

实验材料

1.1载体、菌种及主要试剂  pMD18-T simple vector购自宝生物工程（大连）有限公司；含有绿色荧光蛋白基因的表达质粒pEGFP-N1（刘蒙蒙，杨德成，周国辉等，共表达O型FM DV衣壳蛋白和绿色荧光蛋白重组腺病毒的构建，2012（24）83-86）； E.coli DH5α和E.coli DH10B（购自宝生物工程（大连）有限公司）。AxyPrep质粒小量纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen，X-gal、IPTG、限制性核酸内切酶、T4 DNA Ligase、ATP、dNTP及Taq DNA聚合酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；DMEM培养基购自Invitrogen公司；胰酶购自Thermo公司。      

1.2SPF鸡胚和病毒 9～10日龄SPF鸡胚、火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of turkey，HVT）Fc126株均购自南京天邦生物科技有限公司；传染性法氏囊病毒BC6/85的标准毒株购自中国兽药监察所；

2 实验方法

2.1引物设计与合成

根据GenBank上发表的HVT Fc126株全长基因组序列（AF291866）、gpt序列(X00221.1)以及pEGFP-C1质粒序列设计了以下PCR引物(表1)，引物由Invitrogen公司合成。

表1 重组病毒转移载体的引物构建

2.2同源臂克隆质粒pUAB的构建

以HVT Fc126株感染原代鸡胚成纤维细胞（CEF）病变细胞总DNA为模板，分别以A-F /A-R和B-F/B-R为引物扩增重组病毒转移载体左/右同源臂A/B，回收左/右同源臂A/B的PCR产物，克隆到pMD18-T simple vector，获得阳性克隆质粒pMD-A和pMD-B。用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切分析pMD-A，EcoRⅠ、Sca I 和XbaⅠ三酶切分析pMD-B，进一步测序确认。然后，将pMD-A用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切，pMD-B用EcoRⅠ、Sca I和XbaⅠ三酶切，回收pMD-A载体片段和B片段，T4 DNA Ligase连接，转化DH5α感受态细菌，提取重组质粒， EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定，获得含有HVT左/右同源臂A/B的克隆质粒pUAB。

基因与Egpt基因的扩增

以gpt-F/gpt-R为引物，以E.coli DH5α DNA为模板，采用PCR方法扩增gpt基因，用其作为外源筛选基因，与质粒pEGFP-N1中的CMV启动子及poly(A)连接构建gpt表达盒（CMV-gpt- poly A），经PCR测序验证后，插入到含有火鸡疱疹病毒（HVT）非必需区US10、SORF3两侧基因的同源臂克隆质粒pUAB中，构建带有筛选基因表达盒的克隆质粒pUAB-gpt。

基因的设计与合成

选用编码赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)和甘氨酸(Gly)的常用密码子按顺序排列成BS基因：5'-AAGCATGGC-3’。连续合成l0个BS(BS 串连基因单链（BS-F）及其反向互补链（BS-R），通过退火使其复性成双链，具体序列如下：BS-F ：5-  gtc gac atg aag cat ggc aag cat ggc aag cat ggc aag cat ggc aag cat ggc aag cat ggc aag- 3 (前端添加Sal I酶切位点)；BS-R：5- ttg cag gtt cgc catgcc-atg-ctt gcc atg ctt gcc atg ctt gcc atg- ctt-gcc-atg-ctt-gcc-atg- 3（黑色斜体部分为引物IBDV VP2-F引物互补相反序列，重叠延伸PCR法（SOE法）扩增BS10-VP2嵌合基因）。

重组火鸡疱疹病毒转移载pUAB-gpt-BS10-VP2 的构建

根据注册的 IBDV VP2 序列设计(GenBank NO.AF362747)设计引物，用RT-PCR方法从AH1病毒RNA中扩增完整的IBDV VP2基因。引物序列如下：VP2 -F：5-atg -gcg –aac-ctg-caa-gat –caa-ac-3 ；VP2 -R：5-ggg-aag-ctt-cta -cta-cct-cct-tat- ggc -ccg-gat-tat-gtc-ttt- g-3(前端添加HindIII酶切位点)。采用重叠延伸PCR法（SOE法），以BS10和VP2为模板， BS-F和VP2–R为引物扩增BS10-VP2嵌合基因。将BS10-VP2 嵌合基因插入到pUAB-gpt中，获得重组火鸡疱疹病毒转移载pUAB-gpt-BS10-VP2 ，大小为10100bp。

重组病毒的获得

采用脂质体Lipofectamine2000介导法，将重组转移载体质粒pUAB-gpt-BS10-VP2与HVT-FC126株基因共转染原代鸡胚成纤维细胞（CEF），当细胞病变达到70％左右时，传到新鲜制备的单层CEF上，培养液在1小时前换成加压筛选培养液(含2％血清、1％ S/P，300 ug/mL霉酚酸、60 ug/mL 黄嘌呤和100 ug/mL 次黄嘌呤的DMEM)，每24 h换一次加压筛选培养液。当病变细胞达到70％左右时传到另一新鲜制备的单层CEF上，经过6轮加压筛选获得纯化的重组病毒rHVT-BS10-VP2。

重组病毒rHVT-BS10-VP2的鉴定

2.7.1 PCR鉴定 

在BS10-VP2 表达盒的两侧设计引物，引物序列如下：rHVT -F ：5-atg -aag -cat -ggc- aag -cat –ggc-3；rHVT -R ：5-cta -cta -cct-cct-tat-ggc-3。以上述获得的rHVT- BS10-VP2为模板利用此引物进行扩增，可以扩增出1458bp 的特异性片段，经测序验证，此1458bp 的片段为IBDV-VP2 表达盒序列，可知获得的重组病毒rHVT- BS10-VP2中成功插入了BS10-VP2嵌合基因表达盒；

2.7.2 间接免疫荧光试验（IFA）检测

将100PFU 病毒量的rHVT- BS10-VP2接种于6 孔细胞培养板上。培养4d 出现明显噬斑后，将生长液倒掉，用冷的丙酮∶乙醇(3 ∶ 2) 固定液固定10min，PBS 洗1 次，每个孔中加入0.5mL(1 ∶ 100 稀释)IBDV-VP2 单抗，放置于37℃恒温培养箱中反应1h，用PBS 清洗3次，每孔加上0.5mL FITC 标记抗鼠IgG 荧光抗体，放置于37℃恒温生化培养箱中反应1h，用PBS 洗3 次，在倒置荧光显微镜下观察，rHVT-BS10-VP2感染孔出现了特异性绿色荧光，而HVT感染对照孔无荧光，表明BS10-VP2基因能够良好的正确表达。

重组病毒rHVT-BS10-VP2 应用于含有母源抗体的商品鸡中的免疫实验

120 只1 日龄商品鸡，随机分成4 组，通过ELISA 方法检测其母源抗体为阳性。第

一组接种rHVT-BS10-VP2，免疫剂量为2500PFU/只。第二组接种rHVT-VP2 (鸡传染性法氏囊病病毒火鸡疱疹病毒载体活疫苗vHVT-013- 69株，购自梅里亚动物保健有限公司)，免疫剂量为为2500PFU/ 只。第三组为非免疫攻毒组，第四组为非免疫非攻毒组。35日龄进行IBDV BC6/85强毒攻击，攻击后5d 剖杀，进行肉眼病理观察并取免疫中枢器官法氏囊组织用10％甲醛固定以作组织病理学观察。免疫效果见表1，通过表1 内容可知在含有母源抗体的商品鸡中，rHVT-BS10-VP2 免疫组的保护率达100％，高于rHVT-VP2免疫组的保护率(93.3％ ) 

免疫用重组病毒攻毒用毒株致死率法氏囊损伤rHVT-VP2BC6/850/302/30(6.7%)rHVT-BS10-VP2BC6/850/300/30（0%）-BC6/857/30(23%)30/30(100%)-- 0/30(0%)

  SEQUENCE LISTING

 

 

<110>  江苏省农业科学院

 

 

<120>  表达IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白重组火鸡疱疹病毒

 

 

<130>  0

 

 

<160>  13   

 

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

 

<210>  1

<211>  1458

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  rHVT-BS10-VP2重组病毒的DNA 序列

<222>  (1)..(1458)

<223> 

 

 

 

<400>  1

atgaagcatg gcaagcatgg caagcatggc aagcatggca agcatggcaa gcatggcaag     60

 

catggcaagc atggcaagca tggcaagcat ggcatggcga acctgcaaga tcaaacccaa    120

 

cagattgttc cgttcatacg gagccttctg atgccaacaa ccggaccggc gtccattccg    180

 

gacgacaccc tagagaagca cactctcagg tcagagacct cgacctacaa tttgactgtg    240

 

ggggacacag ggtcagggct aattgtcttt ttccctggtt tccctggctc aattgtgggt    300

 

gctcactaca cactgcagag caatgggaac tacaagttcg atcagatgct cctgactgcc    360

 

cagaacctac cggccagcta caactactgc aggctagtga gtcggagtct cacagtgagg    420

 

tcaagcacac tccctggtgg cgtttatgca ctaaatggca ccataaacgc cgtgaccttc    480

 

cgaggaagcc tgagtgaact gacagatgtt agctacaatg ggttgatgtc tgcaacagcc    540

 

aacatcaacg acaaaatcag gaacgtccta gtgggggaag gggtgaccgt cctcagctta    600

 

cccacatcat atgatcttgg gtatgtgaga ctcggtgacc ccattcccgc tatagggctc    660

 

gacccaaaaa tggtagcaac atgtgacagc agtgacaggc ccagagtcta caccataact    720

 

gcagccgatg attaccaatt ctcatcacag taccaagcag gtggggtaac aatcacactg    780

 

ttctcagcta atatcgatgc catcacaagc ctcagcatcg ggggagaact cgtgtttcaa    840

 

acaagcgtcc aaggcctcat actgggtgct accatctacc ttataggctt tgatgggact    900

 

gcggtaatca cccgagctgt ggccgcagac aatgggctaa cggccggcac tgacaacctt    960

 

atgccattca acattgtgat tccaaccagc gagataaccc agccaatcac atccatcaaa   1020

 

ctggagatag tgacctccaa aagtggtggc caggcggggg atcagatgtc atggtcagca   1080

 

agtgggagcc tagcagtgac gatccacggt ggcaactatc caggggccct ccgtcccgtc   1140

 

acactagtag cctacgaaag agtggcaaca gggtctgtcg ttacggtcgc cggggtaagc   1200

 

aacttcgagc tgatcccaaa tcctgaacta gcaaagaacc tggtcacaga atacggccga   1260

 

tttgacccag gggccatgaa ctacacaaaa ttgatactga gtgagaggga ccgtcttggc   1320

 

atcaagaccg tatggccaac aagggagtac actgactttc gcgagtactt catggaggtg   1380

 

gccgacctca actctcccct gaagattgca ggagcatttg gcttcaaaga cataatccgg   1440

 

gccataagga ggtagtag                                                 1458

 

 

<210>  2

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  A-F

<222>  (1)..(28)

<223> 

 

 

 

<400>  2

cgggatccac atcgggccac gttccgcc                                        28

 

 

<210>  3

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  A-R

<222>  (1)..(42)

<223> 

 

 

 

<400>  3

gctctagagc gtcgaccgga attcgatgag ctgacgtgtg ga                        42

 

 

<210>  4

<211>  41

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  B-F

<222>  (1)..(41)

<223> 

 

 

 

<400>  4

ggaattcaag tcgacggaag cttccactaa tatgggcaca c                         41

 

 

<210>  5

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人

 

 

<220>

<221>  B-R

<222>  (1)..(28)

<223> 

 

 

 

<400>  5

gctctagatg gcccatctag gtgattat                                        28

 

 

<210>  6

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人

 

 

<220>

<221>  gpt-F

<222>  (1)..(30)

<223> 

 

 

 

<400>  6

gcgctagcgt catgagcgaa aaatacatcg                                      30

 

 

<210>  7

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人

 

 

<220>

<221>  gpt-R

<222>  (1)..(29)

<223> 

 

 

 

<400>  7

actggatcct tagcgaccgg agattggcg                                       29

 

 

<210>  8

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人

 

 

<220>

<221>  Egpt-F

<222>  (1)..(39)

<223> 

 

 

 

<400>  8

gcgaattcta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattag                            39

 

 

<210>  9

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人

 

 

<220>

<221>  Egpt-R

<222>  (1)..(36)

<223> 

 

 

 

<400>  9

gcgtcgaccg cgttaagata cattgatgag tttgga                               36

 

 

<210>  10

<211>  66

<212>  DNA

<213>  人

 

 

<220>

<221>  BS-F

<222>  (1)..(66)

<223> 

 

 

 

<400>  10

gtcgacatga agcatggcaa gcatggcaag catggcaagc atggcaagca tggcaagcat     60

 

ggcaag                                                                66

 

 

<210>  11

<211>  66

<212>  DNA

<213>  人

 

 

<220>

<221>  BS-R

<222>  (1)..(66)

<223> 

 

 

 

<400>  11

ttgcaggttc gccatgccat gcttgccatg cttgccatgc ttgccatgct tgccatgctt     60

 

gccatg                                                                66

 

 

<210>  12

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人

 

 

<220>

<221>  VP2 -F

<222>  (1)..(23)

<223> 

 

 

 

<400>  12

atggcgaacc tgcaagatca aac                                             23

 

 

<210>  13

<211>  43

<212>  DNA

<213>  人

 

 

<220>

<221>  VP2 -R

<222>  (1)..(43)

<223> 

 

 

 

<400>  13

gggaagcttc tactacctcc ttatggcccg gattatgtct ttg                       43