表达IBDV VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗的构建及其免疫效力试验

摘要

传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectiousbursal disease virus，IBDV)引起的雏鸡急性、高度接触性疾病。IBDV的感染对雏鸡的法氏囊造成损伤，从而导致免疫抑制，增加了机体对其他疾病的易感性。为了克服弱毒活疫苗和中等毒力活疫苗的缺陷，本研究通过在火鸡疱疹病毒(HVT) FC126毒株的US2复制非必需区，插入IBDV超强毒株的VP2基因，构建表达VP2蛋白的重组HVT疫苗毒株，旨在为研制预防IBD和马立克氏病(MD)的二联基因工程疫苗打下基础。
　　本研究以IBDV XD2010超强毒株为模板，通过RT-PCR扩增其VP2基因，利用HVTFC126疫苗株基因组US2同源序列、CMV启动子和绿色荧光蛋白(EGFP)基因，构建含有VP2基因的转移载体质粒pCMV-EGFP-VP2，以磷酸钙沉淀法将转移载体质粒和HVTFC126基因组DNA共同转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，通过筛选、纯化得到带EGFP标志的重组病毒rHVT-EGFP-VP2。利用Cre重组酶去除rHVT-EGFP-VP2基因组中的EGFP基因，重新转染CEF细胞，经筛选、纯化得到不含EGFP基因的重组病毒rHVT-VP2。经PCR、间接免疫荧光(IFA)和western blot鉴定，重组病毒rHVT-VP2可正确表达VP2蛋白。
　　在重组病毒rHVT-VP2对IBDV超强毒株的免疫保护试验中，设立rHVT-VP2疫苗组、中等毒力疫苗组(N87)、空白对照组和攻毒对照组，从各试验组免疫后的法氏囊重量/体重（囊体比）的变化、发病率、死亡率、攻毒后的增重、抗体水平等方面进行免疫保护效力的评价。结果发现，rHVT-VP2组免疫后法氏囊正常，而N87疫苗组免疫后法氏囊发生了萎缩;rHVT-VP2组及N87疫苗组攻毒后的发病率、死亡率与攻毒对照组相比差异极显著;攻毒后rHVT-VP2组体重增重显著高于N87疫苗组;利用本研究所建立的间接ELISA方法检测IBDV抗体，发现rHVT-VP2能够诱导机体产生较高水平的特异性抗体，并在一定时间内持续升高，抗体水平明显高于N87疫苗组;结合各组临床症状及器官病理变化，得出结论:重组病毒rHVT-VP2有效抵抗IBDV超强毒株的攻击，且免疫保护效力高于N87疫苗组。
　　重组病毒rHVT-VP2对MDV的免疫保护试验中，rHVT-VP2组对MD保护率和HVTFC126疫苗组保护率相当，证明重组病毒rHVT-VP2能使机体产生较高的免疫保护力，足以抵抗MDV RB1B强毒株的攻击。
　　综上所述，本试验所构建的重组病毒rHVT-VP2有效抵抗IBDV超强毒株攻击的同时，又能刺激机体对MDV的侵袭产生较高的免疫保护力，是理想的能够同时抵抗IBDV超强毒株及MDV攻击的新型疫苗。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述 传染性法氏囊病研究进展

1 病原学研究

2 IBD流行病学研究进展

3 疫苗研究

第二章 检测IBDV抗体的间接ELISA方法的建立

1 材料

2 方法

2．1 VP2基因的克隆及序列分析

2．2 表达IBDV VP2蛋白的重组杆状病毒的构建

2．3 重组VP2蛋白的表达与鉴定

2．4 重组VP2蛋白的纯化

2．5 检测IBDV抗体的间接ELISA方法的建立

3 结果

4 讨论

第三章 表达IBDV VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗的构建及其免疫效力试验

1 材料

2 方法

2．1 IBDV超强毒株VP2基因的克隆鉴定

2．2 转移载体pCMV-EGFP-VP2的构建

2．3 重组病毒rHVT-VP2的构建

2．4 重组病毒的免疫效力试验

2．5 试验数据的统计学分析

3 结果

4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

声明