应用双靶标拮抗寡核酸抑制新血管增生疾病的药物

摘要

本发明公开了用于治疗新血管增生疾病的药物，该药物以miRNA-132和miRNA-155为靶点，利用两个特异性拮抗寡核酸antagomir-132、antagomir-155作为药物的基本成分，在病灶中同时敲低上述两个微核酸，可以抑制新生血管的过度增生而达到治疗效果。为确保该药物的有效使用，本发明采用了体内导入载体，如组氨酸-赖氨酸多肽聚合物HKP、 配体靶向型导入纳米颗粒系统RGD-PEG-HKP ，以提升药物导入血管增生部位（眼部或肿瘤部位）的特异性和效率。

说明书

  

技术领域

本发明涉及采用核酸技术来治疗血管增生疾病的药物产品，具体涉及采用至少两种拮抗寡核酸（antagomir）及药物导入载体组成药物，来特异性抑制至少两种与血管增生有关的微核酸（miRNA），从而实现对血管增生类疾病（如眼底视网膜病变，实体肿瘤等）的治疗。antagomir特异性靶向miR-132和miR-155，这两种微核酸参与上调血管新生、肿瘤发生及扩散的病理学过程。

  

背景技术

微核酸（microRNA，miRNA）是一类存在于真核生物的18-24个核苷酸长度的非编码RNA，通过与靶标信使RNA（mRNA）以序列互补的形式结合，引起转录抑制或mRNA的降解，从而抑制基因表达，实现其基因沉默的功能（1,2）。

 miRNA是真核生物中高度保守的一种小分子，是一种重要的功能分子，同时也是进化上很早就出现的遗传调节物质（3-6）。miRNA在发育和成熟组织的动态平衡中对细胞转录组的生理学调控起到重要作用。据估计，人基因组能编码1000种的miRNA（3,4），能够调控多种细胞类型的约60%的哺乳动物基因（5,6）。一方面，在转录水平上抑制基因表达需要miRNA与靶标序列的完全配对，但在植物细胞中不完全配对的结合也可以在转录水平上沉默基因（8）。另一方面，在哺乳动物中，只需要miRNA的5'端2-7位碱基（核心区域）与靶标匹配，就能有效发挥基因表达调控作用。一种miRNA能与一种mRNA的不同位点结合，也可以和不同的mRNA结合。另外一点不同之处是，哺乳动物中miRNA的靶标位点是mRNA分子的3'端非翻译区（3'UTR）。

各类不同的人类疾病中都普遍存在miRNA的异常表达，与正常状态相比，身体异常时，miRNA的表达过量，或者低于正常水平（4,5）。病人体内miRNA异常表达的机制多种多样，包括染色体水平的变化（增加或删除），表观遗传机制，或转录因子调控的改变（5,6）。许多研究阐述了编码异常miRNA的mRNA，它们转录的产物能调节细胞生长和死亡等重要的生物学过程，以及疾病组织的血管新生（4-9）。

血管新生是一种从已有血管生成新血管的生物学过程（3）。在正常的机体中，血管新生对生长、发育和组织修复是必不可少的，起到非常关键的作用。然而，异常的血管新生却是许多疾病的发病机理，这些疾病包括肿瘤、失明（如老年湿性黄斑变性和糖尿病视网膜病变等血管增生疾病）、如风湿性关节炎（RA）之类的慢性炎症及牛皮癣。

血管内皮细胞生长因子（VEGF）是血管内皮细胞的一种有丝分裂原（3），在许多关键性的事件中VEGF的过量表达将导致血管新生。这些病理性血管新生包括肿瘤发生和肿瘤转移，风湿性关节炎血管翳的形成（5），以及慢性炎症的肉芽肿病（6,7）。

 miRNA是一种新型的转录后调节因子，能够调控包括正常和异常的血管新生，如肿瘤和失明中的病理性血管新生在内的各种不同的生物学过程。在疾病的分子病理学方面，Ras是MAPK/ERK通路的关键蛋白，而MAPK/ERK通路是受体酪氨酸激酶RTK信号通路的一种。一旦受激素或细胞因子激活，Ras将介导MAPK/ERK通路的下游信号传导，刺激缺氧诱导因子HIF的表达，进而促进VEGF产生，而VEGF是活性最强的血管新生刺激因子之一，特别是在内皮细胞更是如此。但是在细胞内，RASA1（p120RasGAP）作为MAPK/ERK通路的负面调节因子，通过去磷酸化来抑制Ras活性。因此，RASA1是血管新生的负调节因子和抑制剂，通过抑制Ras和MAPK/ERK信号通路起作用。

 miRNA中的一种，miR-132在血管发生人胚胎干细胞模型、人体肿瘤的内皮细胞和血管瘤的含量均有大幅度提高，但是在正常细胞中无法检测到（4）。研究证实，内皮细胞中所表达的miR-132，通过下调Ras的刹车分子——RASA1（p120RasGAP）——而增强Ras活性和血管发生，促进病理性血管新生。在多个肿瘤模型中，给予抗miR-132的合成拮抗寡核酸（miR-132 antagomir，antagomir-132）处理后，能有效抑制病理性血管新生和肿瘤负荷（3,4）。因此，miR-132作为一种血管新生的刺激因子，通过抑制内皮细胞p120RasGAP的表达，激活Ras而诱导血管生成。采用针对miR-132的拮抗寡核酸antagomir-132可以维持血管静止状态，从而有效抑制血管新生（3）。

体内血管生成是一个复杂的过程，有许多不同的因子参与其中。有大量证据支持血管生成和慢性炎症之间高度相关，这两种过程相互影响和刺激，引起疾病病理发生，包括促进渗透、炎症细胞增殖及血管生长因子和VEGF等的细胞因子的分泌。

在此，另一种miRNA，miR-155通过调节炎症反应而参与血管新生的过程。miR-155在发生像炎症等损伤后，通过调节p53介导的DNA修复机制，参与血管新生（6）。miR-155最初发现在造血过程中起作用，后来研究表明它也参与天然和获得性免疫反应，以及自身免疫紊乱。在预后较差的胰腺癌等实体肿瘤中，miR-155显示了较高的表达水平（5-8）。miR-155参与上述生物学过程的机制为：miR-155参与p53介导的DNA修复，抑制机体对炎症之类的身体应急刺激过程进行抑制，使得炎症得以持续；如果慢性炎症未得到遏制或消除，将增加遗传突变率，促进肿瘤发生（9,10）。miR-155参与炎症过程，而炎症反应与血管发生紧密相关，因此miR-155很自然成为原型治疗靶标，目的在通过控制如肿瘤和失明等许多疾病中病理性的新生血管形成过程，实现对这类疾病的治疗。

血管增生（neovascularization，NV）性疾病包括眼部血管增生病变和各类血管增生引起的肿瘤，例如老年湿性黄斑变性（AMD）、胰腺癌、肝癌和直肠癌等。我们研究发现有一些miRNA，如mi-132等，与血管增生直接相关，如采用antagomir来抑制miRNA的功能，可以有效降低病灶中血管增生程度，从而成功治疗由血管增生引起的各类疾病。

眼部血管增生病变（简称眼部NV病变）是眼内血管异常的增殖和生长，常引起老年黄斑变性或基质角膜炎等眼病。同时，眼部NV也是许多严重眼病的诱发因素，如白内障、青光眼、视网膜病、屈光不正、结膜病等，也是全球范围内引发劳动力人口失明最常见的原因。这类疾病主要通过损害眼部光敏感的视网膜组织的小血管，引起视网膜中央附近即斑点部位的液体泄漏，引发黄斑水肿，黄斑水肿病人视网膜组织膨胀，如不及时治疗将导致失明。目前，治疗眼部NV疾病的方法非常有限，尽管也有新的治疗方法和制剂出现，但对于这些眼部NV病人几乎没有多少可供选择的治疗方法。

由于超强的侵略性和早期转移能力，以及几乎对现存的所有化疗制剂和放射治疗有抗性，胰腺癌成为预后最差的癌症之一，这类疾病也与血管过量增生有关。过去几年，使用gemcitabine（2’,2,-双氟去氧胞苷）能有效改善胰腺癌病人的临床症状，并轻微延长生存期。因此，gemcitabine成为了治疗胰腺癌的一线选择。然而，对gemcitabine化学抗性的增加已经成为临床治疗胰腺癌失败的主要原因，有研究推测抗性主要是对凋亡的抵抗力增加所致。因此，急需诱导凋亡和增强对gemcitabine的敏感性的新型治疗策略。

肝癌（主要是肝细胞癌，HCC）是世界第五大癌症，也是致死率最高的三大肿瘤之一，每年大约新增100万肝癌病例，在亚洲和非洲撒哈拉地区HCC发病率更高。HCC肿瘤对大多数传统化疗制剂具有抗性，因而手术切除肿瘤或者肝脏移植是治疗HCC病人仅有的有效途径。然而，肿瘤的直径大小、多灶性、血管侵袭性和潜在的肝脏疾病（肝硬化）等因素往往使切除手术不能很好执行，只有5%-10%的HCC病人适合外科手术。由于HCC的肿瘤发生与血管生成有密切关联，因此采用抗血管增生药物来对抗这类肿瘤成为一种可供选择的治疗方式。

直肠癌是常见恶性肿瘤之一，在世界范围内其发病率居于恶性肿瘤第三位，在欧美等发达国家为第二位，而亚非等地相对较低。随着我国居民生活水平的不断提高和饮食习惯的日益西方化，我国直肠癌的发病率也逐年增高，已跃居第3-5位。特别是在大城市增幅则更快，如1984-2004二十年间上海地区大肠癌发病率男性已由16/10万增至23.61/10万，女性则由14.26/10万增至20.43/10万（均为标率，数据资料来自上海市疾病预防控制中心）。目前影响大肠癌疗效的因素很多，仍缺乏有效的治疗手段，因此亟需新型的治疗方法。

随着对miRNA在肿瘤发生中的作用的深入理解，以及前期研究已取得的优越的抗血管再生活性结果，我们提出采用至少两种拮抗寡核酸（antagomir）作为一种治疗血管增生疾病的新手段，主要是眼部血管增生疾病（如眼底黄斑变性、基质角膜炎等），同时也可以用于治疗与血管增生有关的实体肿瘤，如胰腺癌、肝癌、直肠癌等，则诞生了本发明。

在本发明中，我们将antagomir-132和antagomir-155包裹进入组氨酸-赖氨酸聚合物（HKP）中，形成平均直径150 nm的纳米颗粒制剂，并在病毒诱导的单纯疱疹性基质角膜炎小鼠模型中检测这一双靶标抑制剂的功效，在所有治疗小鼠中都观察到了这一新兴治疗方法的显著的抗血管生成效果。随着对这些miRNA在胰腺癌肿瘤发生中的作用的深入理解，以及前期研究已取得的优越的抗血管再生活性结果，我们提出采用至少两种拮抗寡核酸（antagomir）作为一种治疗血管增生疾病的新手段，主要是眼部血管增生疾病（如老年黄斑变性、基质角膜炎等），同时也可以用于治疗与血管增生有关的实体肿瘤，如胰腺癌、肝癌、直肠癌等。

开发任何类型的寡聚核苷酸治疗制剂，成功的关键是要将活性药物组分（本发明中的antagomir）有效导入疾病位点。我们的团队在过去15年中，一直致力于DNA和siRNA寡聚物的系统导入来治疗肿瘤的新型疗法的开发。本发明中，我们用HKP将siRNA系统导入小鼠异种移植瘤（11,12），发现具有显著的抗肿瘤活性。由于antagomir与siRNA具有类似的结构，因此我们将进一步采用HKP包裹至少两种antagomir，然后系统导入BxPC-3或 Panc-1胰腺癌细胞系接种的小鼠移植瘤（10-14），同时也在肝癌、直肠癌等细胞移植瘤模型中进行中检测，检测双靶标antagomir药物治疗各类实体肿瘤的效果。

在总结之前的多肽配体靶向纳米颗粒系统导入siRNA治疗癌症（13）经验的基础上，我们开发了一种新型的、用作配体靶向寡聚核苷酸导入的“三功能”纳米颗粒系统。这一系统包含：与内皮细胞表面受体aVβ3和aVβ5（这两种受体在肿瘤新生血管大量表达）结合的的RGD配体；内部包含浓缩的RNA寡聚物的HKP纳米颗粒；中间共价连接了双功能聚乙二醇聚合链，可提高纳米颗粒在血液循环中的稳定性。

  

发明内容

本发明涉及治疗新血管增生疾病的药物组合物，包含至少两种抑制miRNA的拮抗寡核酸分子以及适用于体内导入的载体，拮抗寡核酸分子抑制的miRNA能激活与血管生成、肿瘤发生或促炎症细胞因子有关基因的表达。

本发明中拮抗寡核酸（antagomir）能够与miRNA稳定结合，从而抑制miRNA的生物学功能。发明中主要包括的两种miRNA为miR-132和miR-155，两者都与血管生成和肿瘤发生高度相关。miR-132通过调节内皮细胞增殖和生长，主动参与血管生成过程，特别是成人实体肿瘤发生（如胰腺癌、肝癌等）过程，而miR-155也与血管增生密切相关，是胰腺癌病人诊断的普遍公认的标志物。已有证据证明针对miR-132的antagomir能够抑制p120RasGAP和血管生成。同时，各种癌症中都检测到了miR-155引起的沉默，其中一项研究表明胰腺导管腺癌中，过量表达的miR-155会抑制促凋亡肿瘤蛋白-53诱导的核蛋白1（TP53INP1）。根据上述研究结果，同时使用两种拮抗寡核酸（antagomir-132和 antagomir-155）可进一步强化其抗血管生成的功能，理论上比单独用两种中的一种更有效，从而实现对血管增生性疾病以及实体肿瘤的高效治疗。

如一项具体实施例所示，通过TaqMan qRT-PCR实验检测到HSV感染的小鼠角膜中miR-132表达上升，并可以维持高水平表达至感染后的第14天，这一长时间的高表达与角膜组织中的新生血管生长有关。同时，miR-155也与血管增生疾病高度相关，血管程度高的肝细胞癌中miR-155含量升高。

在另一项具体实施例中，采用antagomir-132治疗HSV-1 RE Tumpey感染眼部的小鼠，可以有效抑制角膜新生血管生成，在感染后第7天效果最明显。

在另一项具体实施例中，经antagomir-132治疗后，小鼠中RasGAP的mRNA和蛋白水平上升，说明敲低（抑制）Ras的表达是antagomir-132抑制血管生成的机制。

在另一项具体实施例中，流式细胞仪分析结果显示，antagomir-132治疗HSV-1 RE感染的小鼠，能有效降低基质角膜炎（SK）的严重程度，同时减小血管生成的分数（分数越高，血管生成越严重）。

在另一项具体实施例中，与只包含antagomir-132或antagomir-155单一靶标的antagomir纳米颗粒制剂相比，提供HKP包裹的antagomir-132和antagomir-155的双靶标antagomir纳米颗粒制剂治疗，可显著减少HSV-1 RE感染小鼠的角膜血管生成。采用miR-155敲除（KO）小鼠重复试验，得到相同的结果。

为确保药物的有效使用，本发明采用了一种生物学可降解的制药载体（辅料）作为药物活性组分（API）导入体内的载体，以提升药物导入血管增生部位的特异性和效率。这类载体可以是多肽，盐水，糖，脂类，乳脂，凝胶，胶囊物质和金属纳米颗粒。

具体来说，载体可以是盐溶液、葡萄糖溶液、多肽聚合物、多聚阳离子结合剂、阳离子脂质体、阳离子胶束、阳离子多肽、亲水性高分子聚合物、非天然阳离子聚合物、阳离子聚缩醛、亲水性高分子聚合醛、配体功能性阳离子聚合物或配体功能亲水聚合物。

譬如说，载体可以是生物可降解的聚酯纤维，如聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸（PGA）、聚（乳酸-乙醇酸）（PLGA）、聚酰胺（PAMAM）树枝状聚合物、聚乙二醇化的聚乙烯亚安（PEG-PEI）。

阳离子脂质体可以是DOTAP，DOPE，DC-Chol/DOPE，DOTMA，DOTMA/DOPE等。

优选的，采用的载体为多肽聚合物，更进一步的优选组氨酸-赖氨酸多肽聚合物（Histidine Lysine co-polymer, HKP）。

在一项实施例中，HKP与antagomir以特定比率混合后，能自组装形成平均直径150 nm的纳米颗粒剂型。混合比例可以是任何特定的比例，优选的，HKP与antagomir的混合比例为氮磷质量比（N/P）为4:1。

如一项具体实施例所示，将与antagomir结构类似的带标记的小核酸（siRNA）装入HKP纳米颗粒中，通过尾静脉系统注射，siRNA分子的大部分富集在肿瘤血管附近，并在HNSCC 1483细胞移植瘤模型中观察到了抑制肿瘤生长的效果。因此，HKP可作为与siRNA结构类似的拮抗寡核酸antagomir的导入的最适载体，用于治疗体内疾病，包括胰腺癌。

在另一项具体实施例中，本发明还设计了一种配体介导的靶向性纳米颗粒载体RGD-PEG-HKP，用于RNA寡聚核苷酸的系统给药。这一系统包含以下三种组分：与内皮细胞表面受体aVβ3和aVβ5（这两种受体在肿瘤新生血管大量表达）结合的的RGD短肽配体；内部包含浓缩的RNA寡聚物的HKP纳米颗粒；中间共价连接了双功能聚乙二醇聚合链，可提高纳米颗粒在血液循环中的稳定性。

在另一项具体实施例中，本发明采用MDA-435-LCC6^Luc细胞异种移植瘤模型，用荧光素酶（luciferase）作为报告基因。经过RGD-PEG-HKP包裹的siRNA_Luc，通过尾静脉注射给药。通过成像系统拍照检测荧光素梅表达或基因沉默活性，比较RGD-PEG-HKP的特异靶向性效率。该模型的研究结果显示，RGD-PEG-HKP可将siRNA分子特异性运输到肿瘤部位。

除了与眼部血管增生相关，miR-132还在胰腺癌等多个实体肿瘤中表达升高，是肿瘤发生的重要因素。同时，miR-155也与抑癌基因p53的功能有关，提高促炎症细胞因子的表达，促进肿瘤发生。

本发明进一步采用双靶标antagomir-132和antagomir-155拮抗寡核酸抑制剂，通过抑制肿瘤血管新生，从而治疗与miR-132和miR-155诱导的血管增生而引起的实体肿瘤。

因此，本发明是用于治疗新生血管增生疾病，包括老年黄斑变性、胰腺癌、肝癌和直肠癌等疾病的药物。这一药物是将能同时抑制miR-132和miR-155的拮抗寡核酸（antagomir）与一种制药学上可用的载体按一定比例混合制成。

这些antagomir是单链的RNA或单链的DNA，长度可以从21个核苷酸到27个核苷酸。

本发明所采用的药物载体是生物可降解性的组氨酸-赖氨酸多肽聚合物（HKP），能与antagomir寡聚核苷酸自组装形成平均直径大约为150 nm的纳米颗粒制剂。在总结之前的siRNA治疗癌症的多肽配体靶向纳米颗粒系统经验的基础上，我们开发了一种新型的、用作配体靶向寡聚核苷酸导入的三功能纳米颗粒系统RGD-PEG-HKP。

  

附图说明

图1. Antagomir核苷酸被HKP聚合物包裹。一种新型结构的组氨酸-赖氨酸共聚物——H3K(+H)4b——的结构如图所示，它能够将浓缩的antagomir包裹住，形成平均直径约150 nm的纳米颗粒。这些包含antagomir-132或antagomir-132/155纳米颗粒已经在HSV感染诱导的单纯疱疹病毒性基质角膜炎（HSK）动物模型中检测了结膜下注射给药的抗血管增生活性。

图2. HSV感染后miR-132的表达。HSV感染后miRNA水平会升高，HSV-1 RE感染野生型小鼠单只眼睛，收集6份角膜进行TaqMan qRT-PCR分析，HSV感染后的不同时间的miR-132（A）和miR-133a（B）表达情况如图所示（n=6只小鼠/组），通过单因素方差分析和Bonferroni事后比较检验计算显著性水平。P ≤ 0.01（**），P ≤ 0.05（*），误差棒表示“平均值±标准差”。所有实验重复三次。

图3. IL-17A和VEGF-A上调角膜中的miR-132。用HSV-1 RE感染野生型小鼠的一只眼睛，收集六份角膜，合并后用TaqMan qPCR分析miR-132水平。感染后第2天，用5 μg的可溶性VEGFR1/同型物处理，其它给药隔天进行，到第6天停止，第7天定量检测miR-132（每组6只小鼠，合并检测）。另一项实验中，5 μg的可溶性VEGFR1（sVR1）/同型物处理持续到第12天，第14天检测miR-132的含量（A，每组6只小鼠，合并检测）。单因素方差分析和Bonferroni事后比较检验计算显著性水平，数据以“平均值±标准差”方式显示。采用抗Ly6G抗体分析中性白细胞耗竭情况，如B所示。采用200 μg的抗Ly6G/同型抗体处理HSV感染的小鼠，在第14天用Western-blot方法分析角膜中的VEGF-A（C），qPCR方法分析miR-132的表达水平（D）（每组6只小鼠，合并检测）。以非配对学生t检测确定显著性水平。HSV-1 RE分别感染野生型（WT）和IL-17R基因敲除（IL-17R KO）小鼠的一只眼睛，在第7天（D7）收集六份角膜合并后分析Ras-GAP的mRNA（E），第14天用TaqMan qPCR方法分析miR-132。在第2、7、14天检测了HSV感染的IL-17R KO小鼠和WT小鼠中的基质角膜炎（SK）病变（F）、血管增生分数（G）和miR-132含量（H）（每组6只小鼠，合并检测）。数据以“平均值±标准差”方式显示，所有实验重复两次，*P ≤ 0.05，**P ≤0.01。

图4. Antagomir-132能抑制小鼠眼部的miR-132的量。（A）不同剂量的antagomir/无序序列纳米颗粒治疗HSV感染的小鼠，2.5 μg的antagomir-132获得最佳的miR-132敲低效果（B）。单因素方差分析和Bonferroni事后比较检验计算显著性水平，*P ≤ 0.05，所有实验重复两次。HSV-1 RE感染野生型小鼠，收集六份角膜，合并后进行qPCR和WB分析。对HSV感染的小鼠实施结膜下注射2.5 μg的antagomir-132或无序序列，分离各组的角膜并定量检测Ras-GAP的mRNA（C，每组6只小鼠，合并检测）。以非配对学生t检测确定显著性水平，***P≤0.001，实验重复两次，数据以“平均值±标准差”方式显示。2.5 μg 的antagomir-132/无序序列处理HSV感染小鼠后，还原性WB检测到Ras-GAP蛋白的含量（D，每组6只小鼠，合并检测）。图中显示的为两次试验中的典型的WB图片。

图5. antagomir-132治疗后，血管生成因子Ras 1活性降低。一只眼睛感染了HSV-1 RE的野生型小鼠，收集六份角膜后合并在一起进行GTP水解酶活性检测。A：antagomir-132或无序序列治疗HSV感染的野生型小鼠。在感染和治疗后的第11天收集角膜，进行Ras下降实验，通过还原性WB分析各组的Ras（B和C）。在感染后的第11天收集角膜，用WB方法测定VEGF水平（D和E）。实验重复两次，图中显示了光密度定量分析条带的结果。单因素方差分析和Bonferroni事后比较检验计算显著性水平，***P≤0.001，数据以“平均值±标准差”方式显示。

图6. 预防性给予antagomir-132治疗，降低角膜血管增生和SK。HSV-1 RE感染野生型小鼠的一只眼睛，收集六份角膜进行流式细胞仪分析。A：2.5 μg的antagomir-132或无序序列纳米颗粒治疗HSV感染的小鼠，antagomir-132治疗明显降低HSV感染小鼠的SK病变（B）和血管增生分数（C）。预防性antagomir-132治疗后，角膜中内皮细胞（CD31细胞）（D和E）、Gr1⁺CD11b（中性白细胞）（F和G）和CD4⁺ T细胞（H和I）的频率和总细胞数量均显著下降（n=6-8只小鼠/组）。以非配对学生t检测确定显著性水平，*P ≤ 0.05，**P ≤0.01，数据以“平均值±标准差”方式显示，所有实验重复两次。SSC：标准柠檬酸盐水。

图7. 提供antagomir-132纳米颗粒治疗减少角膜血管增生和SK。HSV-1 RE感染野生型小鼠的一只眼睛，收集六份角膜进行流式细胞仪分析。2.5 μg的antagomir-132治疗（A）导致HSV感染的动物中SK水平下降（B）和血管增生分数的降低（C）。给予antagomir-132治疗后，角膜中内皮细胞（CD31⁺细胞）（D和E）、Gr1⁺CD11b⁺（中性白细胞）（F和G）和CD4⁺ T细胞（H和I）的频率和总细胞数量均显著下降（n=12-18只小鼠/组）。以非配对学生t检测确定显著性水平，*P ≤ 0.05，**P ≤0.01，数据以“平均值±标准差”方式显示，所有实验重复两次。SSC：标准柠檬酸盐水。sep：序列。

图8. 双靶标antagomir-132/155强力的抗血管增生活性。用HSV-1 RE感染野生型和miR-155敲除小鼠的一只眼睛，在第12天和第15天通过血管增生分数来评估抗血管增生活性。第15天，三组中，双靶标antagomir-132/155显示了最强的活性。以非配对学生t检测确定显著性水平，P ≤0.001（***），P ≤ 0.01（**），P ≤0.05（*），误差棒表示“平均值±标准差”，所有实验重复两次。

图9. H3K(+H)4b在体内诱导细胞因子的能力较弱。静脉注射H3K(+H)4b/siRNA纳米颗粒近如Balb/c小鼠模型体内，收集血液检测细胞因子水平，并与包裹同样siRNA（Raf-1 siRNA）的HK聚合物进行比较。A. 与脂质体、Jet-PEI 及其它HK聚合物相比，H3K(+H)4b/siRNA激活INFa的水平最低；B. 与脂质体、Jet-PEI 及其它HK聚合物相比，H3K(+H)4b/siRNA激活INFg的水平最低；C. 与脂质体、Jet-PEI 及其它HK聚合物相比，H3K(+H)4b/siRNA激活IL-6的水平最低；D. 与脂质体、Jet-PEI 及其它HK聚合物相比，H3K(+H)4b/siRNA激活TNFa的水平最低。

图10. 新型配体靶向纳米颗粒载体的结构，antagomir核苷酸被HK聚合物包裹。一种新型的用于配体靶向寡聚核苷酸导入的三功能纳米颗粒系统RGD-PEG-HKP，RGD多肽作为靶向配体，PEG延长颗粒在血液中的循环时间，而HKP则可以将核苷酸包裹形成纳米颗粒。黄色部分代表特异性与细胞表面受体结合的RGD配体，HKP核心在中间，而PEG介于两者之间。当这种三功能载体与核苷酸水溶液混合后，能自动形成纳米颗粒。采用这种载体包裹siRNA或antagomir，静脉注射小鼠，并评估治疗异种移植瘤的效果。

图11. RGD-PEG-HKP包裹的siRNA在体内实现靶向沉默。采用表达荧光素酶的肿瘤细胞系建立移植肿瘤模型，体内检测静脉注射RGD-PEG-HKP/Luc-siRNA纳米颗粒对靶标的抑制活性。A. 治疗前的肿瘤荧光成像；B. 治疗后48小时的肿瘤肿瘤荧光成像；C. 定量靶标沉默活性，N=5，*表示P<0.05。

图12. RGD-PEG-HKP/siRNA纳米颗粒对小鼠肿瘤的治疗效果。采用肿瘤细胞系（MBA-MD-435）建立移植肿瘤模型，体内检测静脉注射RGD-PEG-HKP/siRNA纳米颗粒的抗肿瘤活性。A. RGD-PEG-HKP/标记siRNA纳米颗粒在肿瘤模型中的检测，与H3K(+H)4b/标记siRNA、裸露的标记siRNA进行比较。每一栏中照片的拍摄时间点依次为静脉注射前及静脉注射后的15分钟、30分钟、60分钟、120分钟，以及静脉注射后4小时、8小时和24小时。GD-PEG-HKP/标记siRNA纳米颗粒在肿瘤部位有明显的信号。B. RGD-PEG-HKP/标记siRNA纳米颗粒提高静脉注射后的药代动力学。C. 每3-4天一次，重复静脉注射RGD-PEG-HKP/Raf-1-siRNA纳米颗粒，有显著的抗肿瘤活性，其中N=6.

具体实施方式

本发明采用一种双靶标拮抗寡核酸（antagomir）制剂来治疗新血管增生疾病，该制剂中两种antagomir（antagomir-132和antagomir-155）分别抑制两种不同的microRNA（miR-132和miR-155）的功能，miR-132和miR-155能激活与血管生成、肿瘤发生或促炎症细胞因子有关基因的表达。

本发明中，我们采用组氨酸-赖氨酸聚合物HKP包裹antagomir-132和antagomir-155，形成平均直径150 nm的纳米颗粒，并在病毒感染引起的小鼠血管增生模型（单纯疱疹病毒性角膜基质炎）中检测双靶标抑制剂的效果。在所有治疗的小鼠中都观察到了这种新型治疗方法的抗血管生成效果，并且，采用双靶标抑制剂的治疗效果明显优于只单独采用antagomir-132或antagomir-155的治疗效果。

采用Lipofectamine 2000体外转染BxPC-3和Panc-1胰腺癌细胞系，我们鉴别和确证了antagomir-132和antagomir-155效果，接着提取总RNA，用miR-132和miR-155特异性引物进行RT-PCR分析，确定靶标被敲低的效果。在此基础上，可以采用antagomir-132和antagomir-155来特异性治疗胰腺癌等实体肿瘤。

 Antagomir序列：所有antagomir序列均委托Ambion公司合成，也可以委托任何具备寡核苷酸合成能力的单位制备。抗miR-132序列antagomir-132为：5-CGACCAUGGCUGUAGACTGUUA-3’，专门与人或小鼠的微核酸（miR-132）结合。antagomir-155的序列在人和小鼠中稍有不同：专门与人体miR-155结合的Human antagomir-155：5’-ACCCCUAUCACGAUUAGCAUUAA-3’；专门与小鼠miR-155结合的Mouse antagomir-155：5’ -CCCCUAUCACAAUUAGCAUUAA-3’。无序的对照寡核酸序列为：5’-GACUCCACUCUUCUAGAAUAAC-3’。

细胞系：人胰腺癌细胞系Panc-1和BxPC-3、肝癌HepG2细胞系以及DLD-1和HT29直肠癌细胞系等从ATCC（Manassas, VA）购得，使用添加了谷氨酰胺L-glutamine（Invitrogen ）和10%胎牛血清（FBS, HyClone）的DMEM（Invitrogen, Carlsbad, Calif）培养基在37℃和适度湿度条件下培养。

小鼠：6-8周大的雌性C57 BL/6鼠购自哈兰史普拉格大白鼠公司（Harlan Sprague Dawley Inc. Indianapolis, Indiana, USA），IL-17Arko的57BL/6小鼠安进公司（Thousand Oaks, A），并饲养在田纳西州诺克斯韦尔大学的美国协会实验动物保护委员会批注的设施里，所有研究都遵循动物保护和使用委员会的指导方针。

病毒：HSV-1 RE Tumpey株在Vero单层细胞（ATCC no: CCL81）中培养繁殖。病毒培养在Vero单层细胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA）中生长，测定效价后，并分成小份储存在-80℃的环境中直至使用。

 Antagomir的转染：每孔2×10⁵个细胞，将Panc-1和BxPC-3细胞接种于六孔板中，吸附24小时。采用Lipofectamine 2000（Invitrogen），按照厂家操作说明将antagomir转染细胞。

定量PCR（QPCR）：总mRNA采用TRIzol LS试剂（Invitrogen, Carlsbad, California, USA）从角膜细胞中分离。用1μg RNA制备的cDNA用于后续的分析。QPCR用采用iQ5实时PCR检测系统（Bio Rad, Hercules, CA, USA）的SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystem, Foster City, CA, USA）进行。采用ΔCt方法，以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参测定基因表达水平，并用2-ΔΔCt公式比较对照组和感染组的相对表达量。实验中所用引物如下：

RasGAPF：5’GAGAAGAAGATCCACACGAAGG3’，

RasGAPR：5’CTCCAGGAGTATTATCTGAGGG3’，

β-actinF：5’CTACCTCATGAAGATCCTGACC3’，

β-actinR：5’GTCTAGAGCAACATAGCACAGC3’。

 TaqMan miRNA Quantitative PCR（TaqMan QPCR）分析：采用mirVana miRNA 分离试剂盒（Ambion, Austin, TX, USA）从细胞中提取miRNA，接着使用TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒（Applied Biosystems, USA）及miR-132和miR-155特异性引物将miRNA逆转录为cDNA，通过荧光定量实时PCR检测系统（Applied Biosystems, USA）进行TaqMan MicroRNA实验（TaqMan MicroRNA），定量分析miR-132和miR-155，亦非编码的小核RNA 202作为内参对照。miR-133a（通常表达于肌细胞中）作为角膜miRNA定量研究的阴性对照。

 Ras活化检测：Ras活性试验根据制厂家操作说明用活性Rsa下调和检测试剂盒（Thermo scientific）检测。简言之，就是将树脂浆添加到收集管的旋转杯中，同时加入含100 μg的GST GGA3-PBD融合蛋白的800 μg 总蛋白（角膜细胞溶解产物）。接着在4℃下孵育1小时，最后加入50 μl还原样品缓冲溶液将GTP--Ras破坏，并随后WB进行分析。以上实验重复两次。

细胞活性实验：antagomirs-132/155同时处理或分别处理的BxPC-3细胞，用标准的MTT方法（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐）检测细胞活性，在96孔板中每孔接种5 ×103个BxPC-3细胞后37℃孵育过夜，在各浓度和不同的时间点测定antagomirs-132/155对细胞增殖的影响，每个药物浓度接种四个孔平行测定四次。在同样的孵育期间内，通过比较药物处理细胞和非处理对照细胞的密度来确定抑制百分比。

细胞侵染实验：用Matrigel 胶包被的transwell 侵染小室技术（孔径为8 μm，BD Biosciences, Bedford, MA, USA）测定PANC-1细胞的侵染能力。转染antagomirs-132/155后48小时，分别收集处理的细胞和未处理的细胞，将5×10⁴个细胞悬浮在350 μl细胞培养基中，加入到上层小室内。在37℃孵育24小时后，用甲醇固定通过膜侵染的细胞，台盼蓝染色后在光学显微镜下计数。

流式细胞术：用Liberase消化角膜后制备角膜单细胞悬浮液，然后将这些角膜细胞悬浮液染色以区分不同的细胞表面分子。简而言之，就是将细胞悬浮液放在冰上用CD45-藻蓝素（30-F11）、CD11b-PerCP（M1/79）、Gr1-PE（1A8）、CD4-藻蓝素（RM4.5）和CD31-FITC（BD Biosciences）培养30分钟。然后，将细胞洗涤3次并用1%多聚甲醛重悬浮。染色样品通过FACS Calibur（BD Biosciences）获得，数据采用FlowJo软件分析。

流式细胞仪分析细胞周期和凋亡：在流式细胞仪上分析antagomirs-132/155处理的PANC-1细胞的循环周期和凋亡情况。简言之，收集胰酶处理消化的细胞，PBS洗涤后在70%的乙醇中固定，用Coulter Epics XL流式细胞器（Beckman Coulter, USA）分析染色的细胞。

测定VEGF和VEGFR2的表达水平：根据我们之前的观察，阻断VEGF活性在体外和体内均能降低miR-132水平，因此，我们将用qRT-PCR 检测antagomirs-132/155处理前后的细胞中VEGF个VEGFR2的表达情况。

 miR-132和miR-155的体外沉默：检测了Panc-1和BxPC-3细胞中miR-132和miR-155的表达后，我们将antagomir-132和antagomir-155转染这两种细胞，接着进行qRT-PCR分析，以这两种miRNA在细胞中特定的沉默情况。在确认了antagomirs-132/155体外的沉默效果后，我们将深入评估其对肿瘤发生活性的沉默效果。

体外评估血管生成活性：为了研究antagomirs-132/155是否能在体外抑制肿瘤血管生成，我们将测定这些antagomirs对ECV304（人脐静脉内皮细胞株）形成毛细血管结构能力的影响。细胞外基质（EC Matrix）是从EHS（Engel breth Holm-Swarm）小鼠肉瘤得来的基底蛋白固体胶层，包含各种促进细胞生长的组分。当在EC Matrix 上生长时，ECV304能快速排列形成管状结构。我们将测定antagomirs处理组细胞的管长度，并与对照组细胞进行比较。

这些研究的数据为我们理解antagomir-132和 antagomir-155在体外的作用提供了基础，我们将进一步测定这两种antagomir对治疗BxPC-3和Panc-1细胞移植瘤的潜在治疗作用。采用组氨酸-赖氨酸聚合物包裹双靶标antagomir，采用尾静脉注射系统给药治疗，通过qRT-PCR和Western-blot分析靶标被抑制的情况，通过免疫组化的CD31、VEGF和VEGFR2染色，凋亡检测和肿瘤增殖/生长抑制实验等多种手段评估antagomir的体内治疗效果。

组氨酸-赖氨酸聚合物（HKP）siRNA纳米颗粒：在Ranin Voyager合成器上（PTI，Tucson，AZ）合成具有理想分支的组氨酸-赖氨酸聚合物HKP（11,12）。聚合物H3K(+H)4b及其它类型的HKP用作本发明中核苷酸寡聚物的载体。H3K(+H)4b分子量为10191，含有四个末端分支结构。这些HKP聚合物的结构为：R-K(R)-K(R)-K(R)，其中H3K4(+H)b的R= KHHHKHHHKHHHKHHHK，而H3K4(+G)b的R= KHHHKHHHKGHHHKHHHG，K=赖氨酸，H=组氨酸，N=天门冬酰胺。HK聚合物的命名规则为：1）H3K4b，其末端主要重复序列为-HHHK-，因此这部分命名为“H3K”，而“4b”代表末端分支的数量；2）H3K(+H)4b，H3K4b的四分支状类似物，在H3K4b末端分支额外插入一个组氨酸。为简便起见，我们将主要以H3K(+H)4b为代表介绍其作为寡聚核苷酸载体的应用。

纳米颗粒制备：HKP的一种，H3K(+H)4b用于包裹antagomirs和对照寡聚核苷酸，以氮磷质量比（N/P）为4:1混合形成纳米颗粒。在按照已有的方法测定了自动形成的HKP-antagomir纳米颗粒的粒径、Zeta电位和对RNA寡聚物的包封能力后，将其用于体内评估治疗效果（15,16）。用N4 Submicron型粒径测定仪（Beckman Coulter，Hialeah，FL）在90度角通过光散射检测微粒直径，使用仪器制造商提供的软件通过单峰分析得到平均直径。每一个数据点测定3次，并以平均值±标准差（mean±SD）的方式表示。未得到包含siRNA的纳米颗粒，将HKP溶液快速加入到siRNA溶液中，使用漩涡振荡器简单混合。室温30分钟静置后，每个250μl通过尾静脉注射入每只鼠中。

 HKP-siRNA纳米颗粒的聚乙二醇化：为了获得更好的药动学/药效学（PK/PD）效果，经常采用工业化学方法通过聚乙二醇化（PEGylation）改变药物容易的物理化学特性。聚乙二醇（PEG）共价连接到目标药物上，可以保护药物免遭机体免疫系统的攻击，减低免疫原性，增加制剂流体力学的大小（在溶液中的粒径），通过减少肾清除率延长循环时间。聚乙二醇化还能增加疏水性药物和蛋白的水溶性。本发明中使用的聚乙二醇购自Sigma公司。

采用RGD等多肽实现靶向功能：适用于本发明的RGD多肽购自APS sciences公司（CA，USA），本发明中其它产品购自Pierce公司：1）产品编号为#28390的BupH MES缓冲盐粉末，加入500 mL去离子水，得到500 mL pH为7.4、含0.9%氯化钠（NaCl）的0.1 M的2-[吗啉]乙磺酸溶液；2）产品编号为# 22980的1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC或EDAC），这是一种零长度的用于偶联羧基和伯氨基连接的水溶性碳二亚胺，用于快速制备多肽偶联物；3）产品编号为#24510 的N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐（Sulfo-NHS），用于促进EDC偶联效率的试剂。

配体靶向型纳米颗粒的制备：RGD-PEG-HKP水溶液和RNA核苷酸水溶液以等体积、N/P质量比为4:1比例混合得到纳米颗粒，配体HK聚合物和RNA核苷酸之间的静电相互作用将促进形成平均分布粒径为100 nm左右的RGD-PEG-HKP/antagomir复合物。用Brookhaven粒径分析仪Plus 90（Brookhaven, NY）测定平均粒径分布和Zeta电位。

用antagomir-132纳米颗粒治疗小鼠：眼部用HSV-1 RE Tumpey进行感染的小鼠被分成两组。Antagomir-132纳米颗粒的处理开始于感染后第2天，隔天给药直至感染后的第13天。另一组实验则感染后第7天开始给药，隔天给药直至感染后的第13天。对照组通过相同的方法在结膜下注射无序序列的纳米颗粒。持续监控所有动物血管生成和基质角膜炎（SK）的发展程度。所有实验重复两次。

结膜下注射：结膜下注射按照已有的报道进行。简而言之，就是将2 cm的32号针头和注射器（Hamilton, Reno, NV）刺入结膜的血管周围，将适量无序序列或antagomir-132纳米颗粒注入结膜下部位。

小鼠异种移植胰腺癌模型：每只重20 g左右、4-6周的BALB/C nu/nu雌性小鼠，在背部侧翼皮下注射接种BxPC-3或Panc-1细胞。一旦出现明显的肿瘤，动物将被随机分成若干组，肿瘤初始大小为100-150 mm³。每组小鼠分别采用antagomirs-132/155两种antagomir同时治疗，或者单独一种antagomir治疗，或者对照寡聚核苷酸治疗，每三天重复给药一次。每周测定两次肿瘤大小，持续检测四周。处死小鼠后，福尔马林固定样本组织，石蜡包埋，或者一些保存到液氮中。苏木精-伊红染色（H&E staining）肿瘤组织，提取总RNA用于RT-PCR分析。

内皮细胞的纯化：HSV感染角膜后内皮细胞的纯化，简而言之，就是合并被切除的角膜并用60 U/ml的释放酶（Liberase）在37℃、含5% CO₂的潮湿环境中对其消化35分钟。单细胞悬浮液制备好后用抗CD31- FITC在冰浴条件下染色30分钟，FITC⁺内皮细胞（CD31⁺）通过FACS分选。纯度达到80-90%，这些分选出来的内皮细胞用于随后的各项研究。

角膜HSV-1感染和评分：老鼠的角膜感染在深度麻醉下进行。用27号针头（27-gauge needle）在老鼠的角膜上轻轻弄一道划痕，然后将含有10⁴个噬菌斑形成单位（PFU）的HSV-1（RE Tumpey株）的3 μl溶液滴在老鼠的一只眼睛内。老鼠眼睛的SK病变程度和血管生成的速度用裂隙灯活组织显微镜（Kowa Company, Nagoya, Japan）来检查。评分标准如下：0，正常角膜；1，轻微的角膜模糊；2，中等角膜不透明；3，严重角膜不透明；4，角膜不透明和溃疡；5，角膜破裂。血管生成程度的记录如前所述。根据这一系统，将角膜分为四个象限（quadrant of the circle）。等级4表示新生血管向角膜中心向心式的生长达1.5 cm。老鼠每个眼睛的四个象限的分数加在一起得到了特定时间点的新生血管衍生指数（范围0.16）。

蛋白质印迹分析（Western-blot，WB）：溶解角膜细胞，上清中的蛋白质用BCA蛋白质检测试剂盒（Thermo scientific, Waltman, MA）定量。样品在Laemmli缓冲液中变性进行SDS-PAGE蛋白电泳，然后将蛋白质转移到PVDF膜上。用含5%的BSA及吐温-20的Tris缓冲液于4℃下封闭过夜，然后依次与特异性的一抗和二抗孵育。使用化学发光HRP底物（Millipore, Billerica, MA）对蛋白条带显色。接着，将膜在再生液（stripping buffer）中孵育10分钟后，用抗β-actin重标记。实验中使用的抗体如下：小鼠Ras（Thermo scientific, USA），抗β-肌动蛋白（C4），抗Ras-GAP（B4F8），羊鼠抗IgG-HRP和驴羊抗IgG-HRP（所有这些抗体均购自Santa Cruz biotechnology）。

利用单克隆抗体中和（抑制）中性粒细胞：眼睛感染HSV-1 RE Tumpey的老鼠被分成两组。一组通过腹腔注射给药，从第7天开始隔天给予200 μg 反Ly6G mAb（1A8，BioXcell, West Lebanon，NH）直至感染后的第13天。实验于第14天终止，同时收集角膜样品用于后续分析。对照组的老鼠通过相同的方式给予同种型的对照（IgG2b）Ab（LTF-2；BioXcell）。这些实验被重复两次。

移植瘤的免疫组化（IHC）分析：为了检测移植瘤中VEGF和CD31的表达和微血管密度（MVD），兔多克隆抗VEGF和CD31抗体做IHC研究。石蜡包埋的组织风干后，去除石蜡并再水化。封闭非特异性结合位点后，用直接抗VEGF和CD31的第一抗体孵育，然后再用第二抗体孵育。

配体靶向型HKP/antagomirs-132/155纳米颗粒对肿瘤生长的影响：Panc-1细胞移植瘤用于体内评估配体靶向型HKP/antagomirs-132/155纳米颗粒的抗肿瘤活性。当肿瘤平均大小达到100-150 mm³时，包含RNA核苷酸的纳米颗粒水溶液通过尾静脉注射给药，给药剂量为2-5mg/kg，每只小鼠注射体积为100 μl。每3天重复给药一次，连续给药21天，绘制肿瘤生长曲线。

数据统计：所有定量分析的结果均以“平均值±标准差”方式表述，在软件SAS 8.02中、以双侧非配对t检验（两个组之间）或单因素方差分析（ANOVA，三个或更多的组之间）进行统计分析，P ≤ 0.001 （***），P ≤ 0.01（**），P ≤ 0.05（*）表示具有显著性差异。所用统计分析都用到GraphPad Prism软件。

具体实施例1. 将siRNA或antagomir寡聚核苷酸装入HK聚合物

Antagomir-132和无序寡核苷酸序列购自Ambion公司，并根据供应商的指导原则使用。优化的组氨酸-赖氨酸聚合物（HKP）已经被广泛用于siRNA的体外和体内导入（15,16），我们采用HKP的一种，H3K(+H)4b，其结构如图1所示，可以将浓缩的siRNA或antagomir寡核苷酸包裹进去，形成平均直径约150 nm的纳米颗粒。这些纳米颗粒包含antagomir-132或antagomir-132/155，用于体内检测抗血管增生活性，采用的是HSV感染诱导的单纯疱疹病毒性基质角膜炎（HSK）动物模型。已经在各种血管增生模型和异种移植瘤模型中检测了这些HKP-siRNA或HKP-antagomir制剂的治疗效果。如图1所示，给小鼠HSK模型结膜下注射HKP-antagomir后，可以根据角膜表面新生血管区域的面积来评估抗血管增生活性。

具体实施例2. 小鼠眼部感染单纯疱疹病毒后角膜中miR-132水平升高

为检测眼部感染HSV后miR-132的水平，在各时间点收集组织样品，提取miRNA进行QPCR分析。感染后第2天便观察到miR-132水平改变，并在第7天和第14天达到峰值，而对照的miR-133a水平没有变化（图2，A和B），同时未感染的阴性对照在相同的各时间点miR-132水平均没有变化（数据未显示）。这些数据表明，眼部感染HSV之后，miR-132表达水平上升。

具体实施例3. IL-17A和VEGF-A促进HSV感染小鼠角膜中的miR-132表达上升

将小鼠分组，每组6只，用HSV-1 RE感染野生型小鼠的一只眼睛，收集六份角膜，合并后用TaqMan qPCR分析miR-132水平。感染后第2天，用5 μg的可溶性VEGFR1/同型物处理，其它的给药隔天进行，到第6天停止，第7天定量检测miR-132（每组6只小鼠，合并检测）。另一项实验中，5 μg的可溶性VEGFR1（sVR1）/同型物处理持续到第12天，第14天检测miR-132的含量，如图3A所示（每组6只小鼠，合并检测）。单因素方差分析和Bonferroni事后比较检验计算显著性水平，数据以“平均值±标准差”方式显示。采用抗Ly6G抗体分析中性白细胞耗竭情况，如图3B所示。采用200 μg的抗Ly6G/同型抗体处理HSV感染的小鼠，在第14天用Western-blot方法分析角膜中的VEGF-A，qPCR方法分析miR-132的表达水平，结果如图3C和D所示（每组6只小鼠，合并检测）。以非配对学生t检测确定显著性水平。HSV-1 RE分别感染野生型（WT）和IL-17R基因敲除（IL-17R KO）小鼠的一只眼睛，在第7天收集六份角膜合并后分析Ras-GAP的mRNA（图3E），第14天用TaqMan qPCR方法分析miR-132。同时，还分别在第2、7、14天检测了HSV感染的IL-17R KO小鼠和WT小鼠中的基质角膜炎（SK）病变（图3F）、血管增生分数（图3G）和miR-132含量（图3H）（每组6只小鼠，合并检测）。数据以“平均值±标准差”方式显示，所有实验重复两次，*P ≤ 0.05，**P ≤0.01。

具体实施例4. 阻断VEGF活性将有效减低SK中的miR-132水平

当眼部可检测到病毒并且CV变得明显可见时（一般是感染后第7天），各时间点miR-132表达都增加，因此有必要进一步研究miR-132上升引起的反应。由于HSV感染后的整个病程中VEGF水平都升高（17），因此VEGF很可能是miR-132表达上升的促进剂。此外，VEGF能诱导人脐静脉内皮细胞HUVEC的miR-132表达（7）。为了探讨VEGF的功能，我们检测了VEGF被抑制后对miR-132水平的影响。用5μg 的VEGF Trap（可溶性的VEGF受体1）或同型对照处理感染后的动物，从感染后第2天开始隔天给药，直到第12天。根据之前的研究，这样的处理显著抑制了VEGF蛋白的活性，也明显抑制了CV（17）。在第7天和第14天收集角膜，比较VEGF Trap和同型对照分别处理的动物中miR-132的水平，与未感染对照组相比，同型对照处理组动物在感染后第7天miR-132水平显著上升。然而，VEGF trap处理组miR-132水平比同型对照组要低4倍（图3A），第14天的检测结果与此相似（图3C和D）。

具体实施例5. HSV感染IL-17AR敲除（IL-17ARko）的小鼠，miR-132水平降低

我们最近观察到角膜中VEGF水平下降的小鼠不能对IL-17A做出反应（即将发表的数据），这促使我们研究IL-17A对HSV感染小鼠后的miR-132表达的影响。为此，HSV感染IL-17Rko小鼠或野生型（WT）小鼠，在感染后第14天测定miR-132的水平。如图2F和G所示，与野生型小鼠相比，IL-17Rko小鼠的CV和SK损伤明显降低。此外，在感染后第14天检测角膜中miR-132的含量，IL-17Rko小鼠中miR-132比野生型小鼠低两倍（图3H）。这些实验结果说明，细胞因子IL-17A与HSV感染后的miR-132的表达上调有关。

具体实施例6. Antagomir-132能抑制小鼠眼部的miR-132

不同剂量的antagomir/无序序列纳米颗粒治疗HSV感染的小鼠，如图4A所示，在感染后第7天检测时，2.5 μg的antagomir-132获得最佳的miR-132敲低效果（图4B）（每组6只小鼠，合并检测）。单因素方差分析和Bonferroni事后比较检验计算显著性水平，*P ≤ 0.05，所有实验重复两次。HSV-1 RE感染野生型小鼠，收集六份角膜，合并后进行qPCR和WB分析。对HSV感染的小鼠实施结膜下注射2.5 μg的antagomir-132或无序序列，分离各组的角膜并定量检测Ras-GAP的mRNA（图4C）（每组6只小鼠，合并检测）。以非配对学生t检测确定显著性水平，***P≤0.001，实验重复两次，数据以“平均值±标准差”方式显示。2.5 μg 的antagomir-132/无序序列处理HSV感染小鼠后，还原性WB检测到Ras-GAP蛋白的含量（图4D）（每组6只小鼠，合并检测）。图4显示了两次试验中的典型的WB图片。

具体实施例7. antagomir-132治疗导致血管生成因子Ras 1活性降低

一只眼睛感染了HSV-1 RE的野生型小鼠，收集六份角膜后合并在一起进行GTP水解酶活性检测，如图5A所示。antagomir-132或无序序列（每种2.5μg）的纳米颗粒治疗HSV感染的野生型小鼠，在感染和治疗后的第11天收集角膜。图5B和C中，Ras下降实验用于阐明antagomir-132介导的对GTP Ras的负调控（每组6只小鼠，合并检测）。在感染和antagomir-132或无序序列纳米颗粒治疗后的第11天收集角膜，用WB方法测定VEGF水平（图5D和E），两者的VEGF蛋白水平相似。实验重复两次，图中显示了光密度定量分析条带的结果。单因素方差分析和Bonferroni事后比较检验计算显著性水平，***P≤0.001，数据以“平均值±标准差”方式显示。如图5所示，antagomir-132能降低角膜中GTP Ras的水平，而VEGF不受antagomir-132治疗的影响。

具体实施例8. Antagomir-132纳米颗粒减少角膜血管增生和SK分数

为了研究抑制miR-132表达对感染引起的血管增生的影响，试验动物分组后，在第2天或第7天，分别通过结膜下注射给予antagomir-132或对照纳米颗粒治疗。如图6A、B和C所示，第2天开始采用antagomir治疗组动物CV和SK的严重程度均显著减缓。antagomir-132治疗小鼠，血管增生显著性降低。第14天实验结束时，用胶原酶消化分离角膜，结果表明antagomir-132治疗组炎症细胞数量明显减少，如CD31（图6D和E），CD11b（图6F和G）和CD4（图6H和I）。antagomir-132或对照纳米颗粒治疗后，在感染后的第5天检测眼部的病毒量，antagomir-132治疗组动物中病毒水平有轻微的提高（数据未显示）。在另一项感染后第7天才开始的治疗中，同样看到antagomir-132治疗显著降低血管增生水平（图7A、B和C）。第14天实验结束后，收集角膜，胶原酶消化后，用流式细胞仪测定各种细胞数量：CD31⁺（图7D和E）、Gr1⁺CD11b⁺细胞（图7F和G）、浸润性CD4 T细胞（图7H和I）。与无序对照组相比，antagomir-132治疗组的细胞数量明显降低。进一步研究表明，即使在感染后第10天（血管生成之后）开始用antagomir-132治疗，也能显著降低血管增生（CV）。综上所述，HSV感染眼部后，通过抑制miR-132，可以很大程度上调节血管增生，并能调节HSV感染后的免疫病理学。

具体实施例9. antagomir-132和antagomir-155纳米颗粒显示强力抗血管生成活性

为了进一步评估HKP包裹的双靶标antagomir-132和antagomir-155对HSV感染诱导的血管生成效果，在感染后的第2天，分组后的动物分别给予最佳剂量的HKP包裹的antagomirs-132/155，或单独的antagomir-155。在感染后的第12天（图8A）或第15天（图8B）测定血管生成的分数。同时设立一组miR-155敲除小鼠的对照组，以比较双靶标antagomirs-132/155组和单靶标antagomir-155组的治疗效果。

具体实施例10. H3K(+H)4b在体内的免疫刺激性较低

静脉注射各种siRNA导入载体对免疫系统的刺激，通过标准的酶联免疫吸附实验（ELISA）检测各种细胞因子活性。将H3K(+H)4b与H2K4b、H3K4b、H3K(+N)4b、JET-PEI及脂质体进行比较，检测这些载体携带Raf-1 siRNA进入体内后对INFa（图9A）、INFg（图9B）、IL-6（图9C）和TNFa（图9D）表达的影响。很明显，H3K(+H)4b对各种细胞因子产生的影响非常小。

具体实施例11. RGD-PEG-HKP配体靶向的用于RNA寡聚物系统导入的纳米颗粒

我们已经开发了一种新型的用于配体靶向寡聚核苷酸导入的三功能纳米颗粒系统。这一系统包含以下三种组分：与内皮细胞表面受体aVβ3和aVβ5（这两种受体在肿瘤新生血管大量表达）结合的RGD配体；内部包含浓缩的RNA寡聚物的HKP纳米颗粒；中间共价连接了双功能聚乙二醇聚合链，可提高纳米颗粒在血液循环中的稳定性（图10）。对每一个(RGD-PEG)5-H3K(+H)4b分子，均有五个RGD-PEG片段吸附到R的末端（R=KHHHKHHHKHHHHKHHHK）和一个骨架开放的末端。

具体实施例12. 系统导入RGD-PEG-HKP-siRNA纳米颗粒的抗肿瘤活性

使用这种配体靶向型导入系统，我们在异种移植瘤模型汇总评估了其对siRNA导入提升的效率。我们采用表达荧光素酶的肿瘤细胞系MDA-435-LCC6^Luc建立移植肿瘤模型，评估RGD-PEG-HKP-siRNA_Luc系统给药后的抗肿瘤活性。皮下注射5X10⁶个MDA-435-LCC6^Luc细胞，肿瘤细胞接种后的第7天，尾静脉注射RGD-PEG-HKP-siRNA_Luc给药，通过系统成像比较靶标基因沉默情况（此处为荧光霉素Luciferase的活性）（图11a、b和c）。

具体实施例13. RGD-PEG-HKP-siRNA纳米颗粒的药代动力学和药效学

此外，我们还采用标记的siRNA，以裸露（不用载体）和HKP包裹的形式，测定了RGD-PEG-HKP-siRNA纳米颗粒的药代动力学（图12A）。经过全身成像分析，HKP包裹的标记siRNA更多富集在肿瘤部位，而布不包裹的标记siRNA在肿瘤部位的量非常微弱（图12B）。通过重复静脉注射给药，测定RGD-PEG-H3K(+H)4b-siRNA(Raf-1)纳米颗粒对MDA-MB-435细胞异种移植瘤的治疗效果。结果表明，与H3K(+H)4b包裹的Raf-1 siRNA相比，这一新型的载体能极大增强Raf-1 siRNA介导的抗肿瘤活性。

  

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