抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎疫苗组合物及制备方法

摘要

本发明涉及一种抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎疫苗组合物及其制备方法。该疫苗组合物含有猪肺炎支原体抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌抗原，其免疫程序简单，既可产生抗体，又同时具有攻毒保护，能有效的防治猪支原体肺炎和猪传染性胸膜肺炎。该疫苗组合物的免疫效果至少与分别注射单苗效果相当，副反应小，血清抗体效价高，免疫期长，耗时少、费力少、对猪的侵害也小。该疫苗组合物生产工艺简单，免疫成本低廉，实用性强。

说明书

技术领域

本发明属于畜类生物制药技术领域，涉及一种抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎的二联多价疫苗组合物及其制备方法。 

背景技术

猪气喘病又称猪支原体肺炎(Macoplasmal pneumoniae of swine，MPS)或猪地方性流行性肺炎(Swine Enzootic Pneumonia，SEP)，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一种接触性慢性呼吸道传染病，普遍存在于世界各地。患病猪主要表现为咳嗽和气喘，生长迟缓，饲料转化率低，体温基本正常。解剖时以肺部病变为主，尤以两肺心叶，中间叶和尖叶出现胰样变和肉样变为其特征。发病率高，死亡率低。近年的研究发现，猪肺炎支原体与猪繁殖呼吸综合症病毒和其它病原混合感染，使其感染的重要性进一步提高。到目前为止，该病仍是造成养猪经济损失最重要的疾病之一。 

猪肺炎支原体对培养基的营养条件要求非常苛刻，在一般的培养基中很难生长，是动物支原体中较难培养的一种。该疾病通过咳嗽产生的飞沫以及与感染或恢复期的病原携带猪直接接触而传播。感染动物和未感染动物混居导致早期和频繁的再感染，感染通常开始于携带病原的母猪产胎时感染小猪。由于猪群集中管理技术的影响，感染在生命后期才变得明显。当断乳后把猪集中起来时，通常还可发现其它感染。在六周龄或更大的猪中常常观察到明显的疾病，感染猪的生长速度和饲料转化率显著降低。使用抗生素治疗贵并且需要长期使用。再感染也是一个问题。目前疫苗是避免感染及其影响的最有效方法。 

猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)，是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的猪的一种高度传染性呼吸道疾病。该病在世界范围内分布广泛，常呈地方性流行，造成持续的经济损失，严重阻碍了世界养猪业的健康发展。由于APP血清型众多，且各个国家及地区流行的优势血清型各不相同，给该病的防治带来了极大的困难。我国已分离到1、2、3、4、5、7和8型，其中以7型最多，该病在我国不同省市流行的血清型不同。猪传染性胸膜肺炎主要是由感染猪直接传染给易感猪群的，能感染任何年龄的猪只，1～4月龄最易感，APP最主要的传播方式是通过感染猪呼出的小液滴进行的，这些小液滴随着气流漂移，当距离较近的易感猪呼入或直接接触到小液滴时就容易发病。猪传染性胸膜肺炎与猪传染性萎缩性鼻炎和猪气喘病一起成为当今大型养猪场的三大呼吸道传染病。该病以急性出血和慢性纤维素性胸膜肺炎为特征，目前在多数工厂化的养猪国家均有发生。本病主要通过飞沫传播， 也可通过接触传染。该病造成的猪只死亡、生长缓慢、饲料报酬降低及药物防治费用的增加，给世界各地的养殖业造成了严重的经济损失。 

但是，迄今为止，尚没有能够同时防治猪支原体肺炎和猪传染性胸膜肺炎的二联组合疫苗。因此，目前需要研究开发一种安全有效、使用简便，并能同时防治猪支原体肺炎和猪传染性胸膜肺炎的二联组合疫苗。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎的二联疫苗组合物及其制备方法。该疫苗组合物含有猪肺炎支原体抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌抗原，免疫程序简单，既可产生抗体，又同时具有攻毒保护，能同时有效的防治猪支原体肺炎和猪传染性胸膜肺炎。该疫苗生产工艺简单，免疫成本低廉，实用性强。 

为此，本发明提供了一种抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎疫苗组合物，其包括猪肺炎支原体抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌抗原。 

在本发明中，所述猪肺炎支原体抗原包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪肺炎支原体感染的免疫应答的猪肺炎支原体抗原。 

根据本发明，所述猪肺炎支原体抗原为猪肺炎支原体全菌体，其选自灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪肺炎支原体细菌，或者含有猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的多肽成分中一种或几种。 

本发明中所述用语“猪肺炎支原体全菌体”，是指猪肺炎支原体的完整细胞体。 

在本发明的一个具体实施例中，所述猪肺炎支原体抗原选自勃林格殷格翰公司的猪支原体肺炎灭活疫苗( M.hyo)、哈药集团公司的瑞倍适Respisure和RespisureOne、美国先灵葆雅公司的猪支原体肺炎灭活疫苗(Myco )、西班牙海博莱生物大药厂的J株(喜可舒)、美国普泰克公司的MycoGard、美国辉瑞公司的RespiFend MH、梅里亚动物保健公司的猪克喘中的一种或几种。 

在本发明的一个优选的实施例中，所述猪肺炎支原体抗原为灭活形式的J株或HN0613株全菌体。优选所述猪肺炎支原体抗原为灭活形式的HN0613株全菌体。所述猪肺炎支原体HN0613(Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)的保藏编号为：CCTCC NO：M 2012230，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)。保藏日期为2012年6月13日。 

本发明中所述用语“猪肺炎支原体HN0613”，也称为“猪肺炎支原体HN0613株”(Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)。 

根据本发明，在所述疫苗组合物中，所述猪肺炎支原体HN0613灭活前含量为10⁸～10¹⁰MHDCE/ml(MHDCE＝猪肺炎支原体DNA细胞等同物，即1 MHDCE相当于1个猪肺炎支原体)。优选在所述疫苗组合物中，所述猪肺炎支原体HN0613 抗原灭活前含量为2×10⁹MHDCE/ml。 

正如本领域技术人员所知，不同的微生物野外分离株在基因序列上有微小的变异，然而，当变异不影响其蛋白质合成、结构或者主要作用功能区时，该微生物之他种野外分离株即使基因序列无法百分之百相同，其基本的生理功能并不会有所改变。但是同源性比较如果针对全部的基因来进行比对，实际上是非常巨大的工程，不太可行，目前国际上常使用16S Ribosomal RNA(16S rRNA)来进行细菌型的分辨，因此在相似性的比较上可以用16S rRNA来进行比对而得到其同源性。所以本发明所使用的支原体抗原并不限定于本发明所使用的野外分离株，16s rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长(包含约50个功能域)。 

因此，本发明中，所述猪肺炎支原体抗原为与猪肺炎支原体HN0613的16SrRNA的同源性至少为80％的菌株。优选所述猪肺炎支原体抗原为与猪肺炎支原体HN0613的16S rRNA的同源性至少为90％的菌株。进一步优选的是，所述猪肺炎支原体抗原为与猪肺炎支原体HN0613的16S rRNA的同源性至少为95％～99％的菌株，更优选的是，所述猪肺炎支原体抗原为与猪肺炎支原体HN0613的16S rRNA的同源性为98％～99％的菌株。即在不改变猪肺炎支原体16S rRNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的猪肺炎支原体，获得与本发明猪肺炎支原体16S rRNA高度同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似免疫原性的抗原组合物。 

同样，在本发明中，所述胸膜肺炎放线杆菌抗原包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪传染性胸膜肺炎的免疫应答的胸膜肺炎放线杆菌抗原。 

根据本发明，所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为猪胸膜肺炎放线杆菌全菌体，其选自灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪胸膜肺炎放线杆菌细菌，或者含有猪胸膜肺炎放线杆菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或者含有猪胸膜肺炎放线杆菌的免疫原性氨基酸序列的多肽成分中一种或几种。 

本发明中所述用语“猪传染性胸膜肺炎放线杆菌全菌体”，是指猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的完整细胞体。 

本发明中所述用语“猪胸膜肺炎放线杆菌”，也称为“猪传染性胸膜肺炎放线杆菌”或“胸膜肺炎放线杆菌”(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)，该病原菌生长要求严格，为革兰氏阴性球杆菌，有荚膜。 

同样，本发明中所述用语“猪胸膜肺炎放线杆菌抗原”，也称为“猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原”或“胸膜肺炎放线杆菌抗原”。 

在本发明的一个具体实施例中，所述胸膜肺炎放线杆菌抗原选自华中农业大学的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗(1、2、7型)；专利文件CN 102058880中的传染性胸膜肺炎放线杆菌HT株(猪传染性胸膜肺炎HT株的分离、鉴定与定型试验，中国动物检疫，1999，16(2)：7～9)、SZ株(保藏编号为CGMCC  No.4215)、DY株(保藏编号为CGMCC No.4216)中的一种或几种。 

在本发明的一个优选的实施例中，所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为灭活形式的全菌体。优选所述猪胸膜放线杆菌抗原为灭活形式的血清1型LC株、血清5型YC株和血清7型YS株全菌体。 

所述胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株（Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype1 strain LC，APP-1）的保藏编号为:CCTCC NO：M 2011458；所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株（Actinobacillus pleuropneumoniae serotype5 strainYC，APP-5）的保藏编号为:CCTCC NO：M 2011459；所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株（Actinobacillus pleuropneumoniae serotype7 strain YS，APP-7）的保藏编号为:CCTCC NO：M 2011460；上述菌种均保藏于中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学）。保藏日期均为2011年12月9日。 

根据本发明，在所述疫苗组合物中，所述猪胸膜肺炎放线杆菌灭活前血清1型LC株含量为10⁸～10¹⁰CFU/ml，血清5型YC株含量为10⁸～10¹⁰CFU/ml，血清7型YS株含量为10⁸～10¹⁰CFU/ml。优选在所述疫苗组合物中，所述猪胸膜肺炎放线杆菌灭活前血清1型LC株含量为109CFU/ml，血清5型YC株含量为10⁹CFU/ml，血清7型YS株含量为10⁹CFU/ml。 

在本发明中，所述疫苗组合物还包括其它猪的病原体的附加抗原，其选自猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抗原、猪瘟抗原、猪伪狂犬病毒(PRV)抗原、猪圆环病毒抗原(PCV)、猪波氏杆菌抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、猪流感病毒(SIV)中的一种或几种。 

根据本发明，所述疫苗组合物还包括疫苗辅剂，并且，在所述疫苗组合物中，所述疫苗辅剂含量为10wt％～60wt％。 

在本发明中，所述疫苗辅剂包括疫苗佐剂、防腐剂、代谢油混合物、稀释剂。其中，所述疫苗佐剂为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、Gel 01(法国SEPPIC)、蜂胶、ISA206(法国SEPPIC)、ISA760VG(法国SEPPIC)，优选卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、Gel01(法国SEPPIC)、ISA206(法国SEPPIC)、ISA760VG(法国SEPPIC)，更优选卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、Gel01(法国SEPPIC)，更优选卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)。 

本发明进一步提供了一种根据本发明所述疫苗组合物的制备方法，包括配苗步骤：将抗原与疫苗辅剂混合制得抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎疫苗组合物，其中，所述抗原包括猪肺炎支原体抗原和猪胸膜肺炎放线杆菌抗原。 

可任意选择的，在配苗步骤中，所述抗原还包括其它猪的病原体的附加抗原。 

根据本发明方法，所述方法还包括在配苗步骤之前的抗原准备步骤，包括制备抗原，或者通过其他方法获得抗原，如直接购置抗原。所述制备抗原包括分别培养猪肺炎支原体和猪胸膜肺炎放线杆菌，并分别进行浓缩，获得猪肺炎支原体 抗原和猪胸膜肺炎放线杆菌抗原。优选所述制备抗原包括分别培养猪肺炎支原体和猪胸膜肺炎放线杆菌，并分别进行灭活、浓缩，获得猪肺炎支原体灭活抗原和猪胸膜肺炎放线杆菌灭活抗原。 

本发明还提供了一种根据本发明所述的疫苗组合物在稀释PRSS疫苗中的应用。 

本发明针对现有技术的不足提供了一种含有猪肺炎支原体与猪胸膜肺炎放线杆菌的二联多价疫苗组合物，该疫苗组合物免疫程序简单，能同时有效的防治猪支原体肺炎和猪传染性胸膜肺炎。该产品既可产生抗体，又同时具有攻毒保护，其免疫效果至少与分别注射单苗效果相当，副反应小，血清抗体效价高，免疫期长，耗时少、费力少、对猪的侵害也小。该疫苗组合物生产工艺简单，免疫成本低廉，实用性强。 

附图说明

图1是实施例1中猪肺炎支原体HN0613的狄氏染色结果图。 

图2是实施例1中猪肺炎支原体HN0613的PCR鉴定结果图。 

图2中附图标记的含义如下：1 Marker DL 2000；2病料分离株HN0613；3致病性试验分离株；4阴性对照。 

图3是实施例1中猪胸膜肺炎放线杆菌的PCR鉴定结果图 

图3中附图标记的含义如下：1 Marker；2猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株；3猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株；4猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株。 

菌种保藏

猪肺炎支原体HN0613(Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期：2012年6月13日，保藏编号：CCTCC NO：M 2012230。 

胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株（Actinobacillus pleuropneumoniae serotype1strain LC，APP-1），由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学）进行保藏，保藏日期：2011年12月9日，保藏编号：CCTCC NO：M2011458。 

猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株（Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype5 strain YC，APP-5），由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学）进行保藏，保藏日期：2011年12月9日，保藏编号：CCTCCNO：M 2011459。 

猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株（Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype7 strain YS，APP-7），由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学）进行保藏，保藏日期：2011年12月9日，保藏编号：CCTCCNO：M 2011460。 

为获得免疫性强的菌种，各菌种经敏感猪体复壮鉴定合格后冻干保存并保藏。 

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。 

实施例 

实施例1：猪肺炎支原体HN0613的分离鉴定 

1.材料与方法 

(1)材料 

①病料来源 

2006年从河南省各地采集疑似猪支原体肺炎病变肺脏，共16份。 

②培养基 

猪肺炎支原体Friis培养基购自BD公司；猪血清购自GIBCO公司；酚红指示剂购自美国AMRESCO公司。 

③试剂 

生化试剂及化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司。 

细菌基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，狄氏染色试剂盒购自于重庆庞通医疗器械有限公司。生化鉴定试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司。 

④阴、阳性血清 

兔抗猪肺炎支原体J株特异性血清，按参考文献方法制备(Meens，J.，Selke，M.，Gerlach，G.F.，2006.Identification and immunological characterization of conserved Mycoplasma hyopneumoniae lipoproteins Mhp378 and Mhp651.Vet.Microbiol.116：85～95)。未免兔血清作为阴性血清。 

2.方法 

(1)病料处理 

取疑似支原体肺炎病变肺脏，在超净台内用无菌手术剪刀剪取发病部位边缘组织，放入无菌平皿，将病肺组织剪成1～2mm³碎块，接种Friis肉汤，37℃培养，每日观察培养液pH值变化。培养液变色时，取第一代经0.45μm过滤器过滤的培养物0.5ml接种到1.5ml含青霉素2000U/ml的Frris肉汤培养基中，37℃继续培 养，培养基变黄后直接取培养物进行移植传代，如培养物变色，进行涂片，分别进行革兰氏染色和瑞氏染色，镜检。如革兰氏染色未发现细菌，同时瑞氏染色发现支原体样菌体时，取0.2ml培养物涂布于Frris平板固体培养基表面，置37℃，5％ CO₂条件下培养，每日观察是否有支原体样菌落。取支原体样单个菌落接种于Friis肉汤，培养基颜色变黄后取0.2ml培养物涂布于Frris平板固体培养基表面置37℃，5％ CO₂条件下进行纯化培养，如此进行纯化培养2次。将最后一次纯化培养生长的支原体样菌落接种Frris液体培养基所得的颜色变黄培养物保存于-70℃备用。 

(2)菌落狄氏染色 

按参考文献进行(曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术[M]，北京：北京农业大学出版社，1992：49～50，126～129，371～373)，采用无菌方法从固体培养基上切下菌落，放到载玻片上，在两边垫上竹签，滴上狄氏染色液后再盖上一块玻片，置于4℃染色30min后低倍镜下观察结果。 

(3)PCR鉴定及测序分析 

用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA模板。PCR引物参考文献进行合成(J.Caron，M.Ouardani，and S.Dea.Diagnosis and Differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis Infections in Pigs by PCR Amplification of the p36 and p46 Genes[J].Journal of clinical microbiology，2000，38(4)：1390～1396)。FSp36，5’-GGGCCGATGAAACCTATTAAAATAGCT-3’Rsp36，5’-GCCGCGAAATTAAATATTTTTAATTGCATCCTG-3’，上海生工合成。PCR反应体系：超纯水34.5μl、10×PCR Buffer 5μl、dNTP 4μl、引物各2μl、模板2μl、TaqDNA聚合酶0.5μl。按下列参数进行PCR反应：预变性94℃3min；94℃30s，53℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环后；72℃终延伸10min。扩增结束后取上述产物琼脂糖凝胶电泳检测。直接将有特异性条带的PCR产物及引物提交至上海生工进行测序分析。 

(4)生化试验： 

生化试验参考文献进行(曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术[M]，北京：北京农业大学出版社，1992：49～50，126～129，371～373)。主要进行洋地黄皂甙敏感性试验、尿素酶试验、葡萄糖分解试验、精氨酸水解试验、三苯基氯化四氮唑(TTC)还原试验、七叶甙水解试验、甘露醇分解试验、薄膜和斑点形成试验。 

(5)生长抑制试验(GIT) 

Friis平板接种0.1ml对数生长期的猪肺炎支原体培养物，将未稀释的抗血清25μl吸附于灭菌的6mm滤纸片，将吸附有血清的滤纸片贴附于平板表面，培养至菌落可见。正常兔血清处理的纸片作为阴性对照。培养观察圆纸片周围有无菌落抑制环的产生。抑制宽度达2mm以上时判为猪肺炎支原体阳性。 

(6)分离菌株的致病性 

将分离菌株培养物经气管注射1～2周龄健康易感猪3头，每头5ml(HN0613， 108CCU/ml)。另设3头条件相同的对照猪，各气管注射培养基5ml，作为对照。试验猪、对照猪隔离饲养。攻毒后按常规饲养，饲料中无抗生素。观察28日，每日测体温。注射28日后剖检，根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。试验组与对照组进行肺病变指数差异分析。对试验猪及对照猪按实施例1第2部分方法(4)中“生化试验”的方法进行猪肺炎支原体的分离，对分离株按实施例1第2部分方法(3)中“PCR鉴定及测序分析”的方法进行PCR鉴定。 

3.结果 

(1)培养结果 

16份病料中仅有1份病料接种的培养基7日后变黄色，过滤接种后5日培养液变黄，培养液均匀混浊，转接于含青霉素的Friis培养基变色后，革兰氏染色未发现细菌，瑞氏染色发现支原体样菌体。转接于固体培养基后，菌落生长入培养基内部。菌落呈典型煎荷包蛋状，与支原体菌落形态相符，命名为HN0613株猪肺炎支原体。 

(2)狄氏染色结果 

在低倍镜下观察到，在Friis固体培养基的猪肺炎支原体的菌落被染成不褪色的中心深蓝色菌落(参见图1)，与支原体菌落染色特性相符。 

(3)PCR鉴定 

所提取的分离培养物模板经PCR扩增后，再经琼脂糖凝胶电泳检测，待检病料或培养物均在750～1000bp之间接近1000bp的位置有一条带，与预期948bp相符(参见图2)。 

(4)序列测定与分析 

将所分离菌株PCR扩增产物测序与GenBank中进行blast比较。结果显示，HN0613分离菌株P36基因序列与NCBI中公布的Mhp P36基因序列相应序列同源性为98％以上。测序结果见序列表。 

(5)生化及血清学鉴定 

分离菌株生化反应与猪肺炎支原体生化特性相符(表1)。 

表1  HN0613分离株生化及生长抑制试验结果表 

注：+阳性，-阴性；洋地黄皂苷敏感试验出现1mm以上抑制带者为支原体；TTC还原试验猪肺炎支原体阴性，猪鼻支原体阳性；生长抑制试验抑制宽度达2mm以上时判为猪肺炎支原体(曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术[M]，北京：北京农业大学出版社，1992：49～50，126～129，371～373)。 

(6)分离菌株的致病性试验 

将菌株培养物经气管内注射10日龄健康易感猪(IHA抗体＜1∶5)，10日后均相继出现咳嗽和气喘等猪支原体肺炎症状。28日后剖检可见轻度肺病变，病变指数在9～15之间。而对照组均未出现上述症状及病变，剖检猪肺部未见异常。临床观察和肺部病变结果见表2。 

表2  HN0613分离株对仔猪感染情况 

注：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著(P＜0.05)。 

对试验组3头猪进行猪肺炎支原体分离，对其变色液体培养物按实施例1第2部分方法(3)中“PCR鉴定及测序分析”的步骤进行PCR检测，结果在略小于1000bp处出现特异性条带(见图2泳道3)，目的条带大小为948bp，证明分离病原为猪肺炎支原体。 

4.结论 

从猪支原体肺炎典型病例的病肺中分离到了疑似猪肺炎支原体的微生物，经各项鉴定具有猪肺炎支原体的特性，生长抑制试验、PCR及测序鉴定结果表明该微生物属于猪肺炎支原体，命名为猪肺炎支原体HN0613。猪肺炎支原体HN0613在Friis培养基中培养含量可达10⁸～10⁹CCU/ml，对健康易感猪具有一定的毒力，可致其产生运动后咳嗽、气喘、呼吸困难等支原体肺炎典型的临床症状及肺部肉变。 

实施例2：血清1型LC株、5型YC株、7型YS株的分离的鉴定 

1.材料和方法 

(1)待检病料 

来源于河南、湖北等省市共10个猪场中采集疑似胸膜肺炎的发病猪的病料。 

(2)PCR引物序列 

PF-5’CCGACTTTTAAATCCGT3’，PR-5’GAACAGTTGTTCGCTAA3’ 

(3)小鼠 

购于河南省动物实验中心。 

(4)病原菌分离纯化和液体培养 

无菌取濒死猪肺、咽喉扁桃体等组织，接种到TSA(含1wt％的NAD)琼脂培养基上，置10％ CO₂，37℃培养24～36h后挑选典型的单个菌落进行纯化培养。挑选纯化好的单菌落接种于TSB(含1wt％的NAD)液体培养液中，37℃摇床(180r/min)上培养过夜。 

(5)病原菌形态学观察 

取自然发病猪和实验感染小鼠的肺和纯培养物进行革兰氏染色镜检。 

(6)PCR扩增反应。 

用接种环挑取数个纯化后的菌落至含40μl无菌三蒸水的EP管中，水煮5～10min，立即放入冰水混合物中，待完全冷却后，12,000r/min离心3min，取上清4℃保存备用。 

PCR反应(25μl)：10倍缓冲液2.5μl，2mmol/L dNTPs 1.0μl，1μmol/L上游引物1μl，1.5μmol/L下游引物1μl，TaqDNA酶0.2μl，无菌水17.3μl，模板2μl。94℃预变性7min后，按94℃60s，65℃40s，72℃1min 40s的循环程序进行30次循环，最后一个循环结束后再延伸7min，取PCR产物于含EB的0.8％琼脂糖胶中电泳，紫外线灯下观察分析。预期扩增的靶基因为APP外膜脂蛋白基因610bp大小的片段。 

(7)动物试验 

将8只健康小鼠随机分为两组(每组4只)，一组腹腔注射无菌的TSB液体培养液(对照组)，另一组接种液体培养好的菌液，饲养于实验室中，观察30d。 

(8)生化鉴定 

挑取10株纯化好的菌落接种于相应培养基做尿酶、β-溶血、NAD依赖性、cAMP等特性试验。 

(9)血清型鉴定 

玻片凝集试验，将阳性血清倍比稀释，取10μl血清与20μl凝集抗原悬液在洁净的玻片上混和，以生理盐水和未免疫兔血清作空白对照，2min内观察结果，出现明显凝集现象者为阳性。 

2.结果与分析 

(1)培养特性 

该菌在10％CO₂，37℃件下生长良好，在液体培养基上生长旺盛。在TSA培养基上，10％CO₂，37℃，24h后形成直径1～2mm透明，圆润的菌落。 

(2)病原的形态特征 

自然发病猪和实验感染小鼠的肺和纯培养物镜检，可见有革兰氏阴性，菌体平直，两极着色的短杆菌。 

(3)PCR检测结果 

PCR检测结果见图3，其中，三株菌扩增出来的条带与预期大小相符。各泳道样品为：1，Marker；2，猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株；3，猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株；4，猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株。 

(4)生化鉴定结果 

生化鉴定结果见表3。 

表3  分离菌株LC、YC、YS株细菌生化试验结果 

(6)动物试验 

4只小鼠注射液体培养菌液后，在24～36h内全部急性死亡。外表无明显变化，剖解见到与自然发病相同的变化，取肺涂片镜检可见与自然发病形态相同的菌体。对照组没有明显的变化。 

(7)根据细菌病原形态学观察，培养特性、生化特性、血清型试验、PCR鉴定、动物试验以及病死猪临床症状、病理剖解变化，可以判定所分离的细菌为猪胸膜肺炎放线杆菌，LC为APP1型，YC株为血清5型，YS株为血清7型。 

实施例3：猪肺炎支原体抗原和猪胸膜肺炎放线杆菌抗原的制备 

1.菌(毒)株的来源 

所选用的胸膜肺炎放线杆菌菌株为：血清1型LC株保藏编号为CCTCC M2011458；血清5型YC株保藏编号为CCTCC M2011459；血清7型YS株保藏编号为CCTCC M2011460。保藏日期为2011年12月9日。 

所选用的猪肺炎支原体为HN0613，保藏编号为CCTCC No.M2012230。保藏日期为2012年6月13日。 

2.疫苗半成品的制备及检验 

(1)生产用种子的制备 

①猪胸膜肺炎放线杆菌： 

一级种子的繁殖 

将LC、YC、YS株冻干菌种分别划线接种于TSA(大豆酪蛋白琼脂)平板，在5～10％CO₂条件下37℃培养16h，挑取典型菌落划线再接种于TSA平板，继续培养16～18h，平板菌落作为一级种子。 

二级种子的繁殖 

从一级种子TSA平板上挑取典型单菌落，接种TSB(胰蛋白胨大豆肉汤)培养基，37℃震荡培养10h，经纯检合格，即为二级种子。 

TSB培养基：胰蛋白胨1.7g，酵母粉0.6g，大豆胨0.5g，葡萄糖0.25g，NaCl 0.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.328g溶于100mL水中，调pH至7.6，115～121℃高压灭菌15min。使用前加入终浓度为10μg/ml的NAD。 

TSA平板：在TSB液体培养基中加入1.5％的琼脂粉，115～121℃高压蒸汽灭菌30min，待温度冷到50℃时加入终浓度为10μg/ml的NAD，铺制成平板，约15ml/块。 

②猪肺炎支原体： 

一级种子的繁殖 

冻干菌种(HN0613株，保藏编号为CCTCC No.M2012230)，用液体培养基稀释，划线接种于固体培养基平皿上，置37℃培养7d，选择生长良好的菌落，接种于固体培养基斜面上，37℃培养7d，作为一级种子。 

二级种子的繁殖 

取少量液体培养基洗一级种子的斜面培养物，接种于液体培养基大管中，置37℃培养7d，经检验纯粹后作为二级种子。 

液体培养基的配方(按1065ml计)：牛心浸出液300ml，ddH₂O(二次蒸馏水)360ml，校正pH值到7.4，121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份：Hank’s平衡盐溶液(10×)(10倍浓缩)40ml，0.25％酚红10ml马血清200ml，5％水解乳蛋白100ml，25％酵母浸出液20ml，10000IU/ml青霉素10ml，1％醋酸铊溶液25ml。 

固体培养基的配方：在液体培养基中加入15g Noble Agar(纯化琼脂)即可。 

(2)制苗用菌液的制备 

①猪胸膜肺炎放线杆菌： 

采用机械搅拌发酵罐分别培养猪胸膜肺炎放线杆菌1、5、7型菌液。按发酵罐容积的70％加入生产用的半合成培养基(其配方和配置方法为：取胰蛋白胨17g，酵母浸粉6g，大豆蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，氯化钠5g溶于1000ml蒸馏水中，加热溶化后调pH至7.6，115～121℃-高压灭菌30min)，待冷却至55℃左右时，按无菌要求加入灭活的牛血清或马血清20～50ml，NAD加至终浓度为 10μg/ml，同时按培养基数量的0.01wt％～0.02wt％加入消泡剂，待其温度降至37℃时，将2～8℃保存的二级种子液分别按1％(v/v)的比例加入到发酵罐内。调节培养温度至37℃、搅拌转速200rpm、pH7.6、罐压0.03～0.05Mpa之间、溶氧量40％(v/v)，培养时间9h。收获的各型菌液经纯检合格后置2～8℃保存。 

②猪肺炎支原体： 

将液体培养基培养的猪肺炎支原体二级种子液以1∶10(v/v)接种于液体培养基中。37℃下培养3～6日，培养物下降0.5个pH值以上，纯粹检验合格后，再以同样的方式扩大培养(继代次不超过6代)。培养结束后，取样，根据《中华人民共和国兽药典(2010版)》中细菌类活疫苗纯粹检验方法进行纯粹检验。 

(3)含量测定 

①猪胸膜肺炎放线杆菌：活菌计数取培养9～10h菌液1ml，按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录方法进行活菌计数。 

②猪肺炎支原体菌体：用PCR方法对培养物进行计数。10倍比稀释所检培养物，然后做PCR，PCR检出的最低限量为3×10^-3μg(相当于1000个左右的菌体)，按稀释的倍数算出菌体数(沈青春，谭青松，王琴，等.PCR方法测定Mhp培养物菌数[J]，中国预防兽医学报，2006，28(1)：55～57)。 

(4)灭活 

分别取检验合格的猪肺炎支原体菌液和猪胸膜肺炎放线杆菌菌液，按菌液体积总量缓慢加入终浓度为0.2％的甲醛溶液(v/v)，放37℃灭活，其间每隔3～4h搅拌一次，24h后取出，进行灭活检验和无菌检验，结果无菌生长。 

(5)浓缩 

①将猪胸膜肺炎放线杆菌离心，弃去上清获得菌泥，按灭活前活菌计数结果加无菌PBS悬浮。 

②将猪肺炎支原体培养液用密理博(Millipore)公司膜包(分子截留量为1000Kda道尔顿)进行浓缩。 

上述过程制得的抗原浓缩后含量见表4。 

表4  抗原浓缩后含量 

抗原>    灭活前含量>猪肺炎支原体HN0613>    10¹¹MHDCE/ml>猪传染性胸膜放线杆菌血清1型LC株>    10¹¹CFU/ml>猪传染性胸膜放线杆菌血清5型LC株>    10¹¹CFU/ml>猪传染性胸膜放线杆菌血清7型LC株>    10¹¹CFU/ml>

实施例4：抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎疫苗组合物的制备 

1.防腐剂的配制 

1％(w/v)的硫柳汞(国药集团化学试剂有限公司，批号20120106)水溶液和7％(w/v)EDTA(乙二胺四乙酸)(国药集团化学试剂有限公司批号20120203)。 

2.代谢油混合物配制 

在900mL纯化水内溶解10g氯化钠、0.25g氯化钾、2.72磷酸氢二钠、0.25磷酸二氢钾、20mL PluronicL121(BASF Corporation)、40mLSqualane(Kodak)，3.2mLTween80，然后定容到1000ml。混合后，对所述成分进行高压蒸汽灭菌。然后匀浆所述混合物，直到形成稳定的乳浊液。 

3.稀释剂的配制 

无菌的PBS缓冲溶液：在900ml纯化水内溶解8g氯化钠、0.25g氯化钾、3.63g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，然后定容至1L，121℃高压灭菌30min备用。 

4.疫苗佐剂的配制 

无菌的Carbopol(上海欧乐化工有限公司，批号20120309)2％ w/v水溶液：在100ml纯化水中充分溶解2g Carbopol，121℃高压灭菌30min备用。 

5.配苗 

将上述成分按下表所示比例进行混合，即通过无菌操作，将实施例3制备的猪胸膜肺炎放线杆菌浓缩物、猪肺炎支原体浓缩物与所述佐剂、防腐剂和稀释剂混合加入装备有搅拌器的无菌容器，37℃搅拌30分钟。所制备不同疫苗组合物如下： 

表5  疫苗L 

表6  疫苗H 

表7  疫苗1 

表8  疫苗2 

表9  疫苗3 

表10  疫苗4 

表11  疫苗5 

表12  疫苗6 

表13  疫苗7 

实施例5：评价不同抗原含量Mhp-APP组合疫苗的组合效力。 

1.材料： 

按照实施例4制备Mhp与APP的组合疫苗(Mhp抗原含量为10⁸MHDCE/ml，LC株为10⁸CFU/ml，YC株为10⁸CFU/ml，YS株为10⁸CFU/ml)，即疫苗L；Mhp与APP的组合疫苗(Mhp抗原含量为10¹⁰MHDCE/ml，LC株为10¹⁰CFU/ml，YC株为10¹⁰CFU/ml，YS株为10¹⁰CFU/ml)，即疫苗H。 

4～5周龄，Mhp和APP血清抗体均为阴性的猪。 

2.动物试验方法： 

选4～5周龄仔猪70头，随机分为14组，每组5头。第0天，对第1、2、3、4组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗L，对第5、6、7、8组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗H，第9、10、11、12组颈部肌肉注射无菌PBS，均为2ml/头，第1、5组分同一房间饲养，第2、3、4、6、7、8组分同一房间饲养。第13、14组作为严格对照，既不免疫也不攻毒，隔离饲养。第28天，用LC株攻击2、6、10组猪，用YC株攻击3、7、11组猪，用YS株攻击4、8、12组猪，均气管内注射，5ml/头，观察14d后剖检记录病变；记录各组观察结果，统计攻毒保护情况。第60天，分别用CVCC354株强毒(购自中监所)攻击1、5、9组猪，气管内注射5ml/头。30d后统计肺病变。具体见表14。 

表14 

3结果和讨论： 

(1)APP攻毒保护结果见下表。 

表15 

注：病变包括肺出血，心肺表面与胸膜出现粘连。 

发病和死亡情况证明疫苗L、H对APP血清1、5、7型攻击均有免疫保护作用，前者保护率均在80％以上，后者保护率为100％。研究结果表明，APP低剂量抗原组合疫苗和高剂量抗原组合疫苗均能产生良好的保护作用，且随着抗原含量的增加，保护效果增强。 

(2)Mhp攻毒保护结果如下表： 

表16 

  组别>  平均肺病变评分>  1>  5.86>  5>  2.06>  9>  15.6>  14>  0>

表17 

  组对组比较>  P值>  1对9>  ＜0.05>  5对9>  ＜0.05>  1对5>  0.452>  14>  0>

所有接种组与对照组比较均显示统计学显著差异(P＜0.05)，组1的肺病变评分高于组5，但差异不明显。研究结果表明：Mhp-APP组合疫苗L和H均能明显减少Mhp引起的肺病变，具有良好的免疫保护作用。另外，随着疫苗中Mhp抗原含量的增加，保护效果会增强。 

实施例5研究表明，Mhp-App组合疫苗在一定的抗原含量范围之内，均能产生对相应病原感染的保护作用，且抗原含量越大，保护作用越强。 

实施例6：评价Mhp-APP组合疫苗和单苗相比Mhp部分的免疫效力，以及在组 合疫苗中有不同含量Mhp时的组合效力。 

1.材料： 

按照实施例4方法分别制备Mhp单苗(Mhp抗原含量为2×10⁹MHDCE/ml)，记为疫苗1；Mhp与APP的组合疫苗(Mhp抗原含量为2×10⁹MHDCE/ml，LC株为10⁹CFU/ml，YC株为10⁹CFU/ml，YS株为109CFU/ml)，记为疫苗2；Mhp与APP的组合疫苗(Mhp抗原含量为10⁹MHDCE/ml，LC株为109CFU/ml，YC株为10⁹CFU/ml，YS株为10⁹CFU/ml)，记为疫苗3。 

4～5周龄，Mhp和APP血清抗体均为阴性的猪。 

2.动物试验方法： 

选4～5周龄仔猪50头，随机分为5组，每组10头。第0天，对第1、2、3组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗1、疫苗2、疫苗3各2ml，第4组颈部肌肉注射无菌PBS 2ml/头，第5组作为严格对照，既不免疫也不攻毒，隔离饲养。第60天，分别用CVCC354株强毒(购自中监所)攻击1～4组猪，气管内注射5ml。30d后统计肺病变。另外，在免疫后不同时间对猪采血，分离血清，利用ELISA方法测定Mhp抗体效价(IDEXX ELISA Ab Test Kit)。具体见表18和表19。 

表18 

表19 

  组别>  头数>  D0接种>  D60，Mhp攻击>  剖检日>  1>  10>  2ml疫苗1颈部IM>  是>  D90>  2>  10>  2ml疫苗2颈部IM>  是>  D90>  3>  10>  2ml疫苗3颈部IM>  是>  D90>  4>  10>  2ml PBS颈部IM>  是>  D90>  5>  10>  N/A>  N/A>  D90>

[0228] 3.结果和讨论： 

(1)攻毒保护结果如表20、表21： 

表20  肺病变评分 

  组别>  平均肺病变评分>  1>  4.22>  2>  2.46>  3>  2.23>  4>  15.2>  5>  0>

表21  肺评分成对测试结果 

  组对组比较>  P值>  1对2>  0.131>  1对3>  0.183>  1对4>  ＜0.05>  2对3>  0.677>  2对4>  ＜0.05>  3对4>  ＜0.05>

所有接种组与对照组比较显示统计学显著差异(P＜0.05)，组1肺病变评分高于组2与组3，但差异不显著；而组2与组3肺评分相当。研究结果令人意外：Mhp-APP组合疫苗比单苗更能减少Mhp引起的肺病变；而低含量Mhp抗原组合疫苗产生了与高含量Mhp抗原组合疫苗相当的免疫效力，两者减少Mhp引起的肺病变程度相当。 

(2)血清学检测结果如下表： 

表22 

所有猪在试验前均保持血清学阴性，免疫组猪随着免疫时间的增加，血清学 阳性转化率升高，组1在攻毒前80％猪转化为阳性，组2在攻毒前100％猪转化为阳性，组3在攻毒前90％猪转化为阳性，组4、组5攻毒前均为阴性。研究结果令人意外：组2、组3猪无论是血清抗体产生速度，还是攻毒前血清抗体阳性转化率，都要高于组1。抗体研究与病变研究结果相似，不同Mhp抗原含量组合疫苗产生的抗体水平相当，均高于Mhp单苗。 

实施例6研究结果令人意外：3种试制疫苗均能产生对Mhp的保护力，但Mhp-APP组合疫苗中Mhp部分免疫效力不仅仍存在，而且明显高于Mhp单苗；一半含量Mhp抗原组合疫苗与全含量Mhp抗原组合疫苗的免疫效力相当。可能是APP抗原对Mhp抗原的免疫效应产生了协同作用，而这种协同作用可能只会在一定抗原量比例下存在并达到最高点。 

实施例7：评价Mhp-APP组合疫苗和单苗相比APP部分的免疫效力，以及在组合疫苗中有不同含量APP时的组合效力。 

1.材料： 

按照实施例4方法分别制备APP-1单苗(LC株抗原含量为10⁹CFU/ml)，记为疫苗4；APP-5单苗(YC株抗原含量为109CFU/ml)，记为疫苗5；APP-7单苗(YS株抗原含量为10⁹CFU/ml)，记为疫苗6；Mhp与APP的组合疫苗(HN0613株抗原含量为2×10⁹MHDCE/ml，LC株、YC株、YS株抗原含量均为5×10⁸CFU/ml)，记为疫苗7。 

4～5周龄，Mhp和APP血清抗体均为阴性的猪 

2.动物试验方法： 

选4～5周龄仔猪65头，随机分为13组，每组5头。第0天，对第1、2、3组猪分别颈部肌肉注射疫苗4、疫苗5、疫苗6，2ml/头；第4、5、6组猪颈部肌注疫苗7，2ml/头；第7、8、9组猪颈部肌注疫苗2，2ml/头；第10、11、12组猪颈部肌注无菌PBS，2ml/头；第13组猪作为严格对照，既不免疫也不攻毒，隔离饲养。第28天，用LC株攻击1、4、7、10组猪，用YC株攻击2、5、8、11组猪，用YS株攻击3、6、9、12组猪，均气管内注射，5ml/头，观察14d后剖检记录病变；记录各组观察结果，统计攻毒保护情况。 

在免疫后不同时间对猪采血，分离血清，利用IHA方法测定APP抗体效价(许如苏，沈烨，蔡雄丹等.用IHA试验进行猪传染性胸膜肺炎的血清学调查[J]，中国兽医杂志，2003，39(2)：23～23.)。 

表23 

3.结果和讨论 

(1)攻毒保护结果见下表 

表24 

注：病变包括肺出血，心肺表面与胸膜出现粘连。 

发病和死亡情况证明疫苗4、疫苗5、疫苗6分别对APP血清1、5、7型有免疫保护作用，保护率均在80％；疫苗7对APP血清1型保护率为80％，对5、7型均完全保护；疫苗2对3种血清型完全保护。研究结果令人意外，组合疫苗对APP各血清型的保护力比单苗的效果更好，至少效果相当；甚至1/2 APP抗原含量的组合疫苗都比单苗的保护效果好；而全APP抗原含量的组合疫苗保护效果 最佳。 

(2)血清学检测结果如下： 

表25 

结果令人意外，两种组合疫苗免疫后的抗体水平都明显高于各种APP单苗。全APP抗原含量的组合疫苗产生的抗体水平最高，1/2 APP抗原含量的组合疫苗次之。抗体水平与免疫攻毒保护呈正相关。 

实施例7研究结果令人意外：单苗和组合疫苗均能产生对APP的保护力，但2种组合疫苗中APP部分免疫效力不仅仍存在，而且明显高于APP单苗；1/2含量APP抗原组合疫苗高于全含量APP抗原单苗的免疫效力，但低于全含量APP抗原组合疫苗的免疫效力。这些结果表明，可能是Mhp抗原对APP抗原的免疫效应产生了协同作用，且这种协同作用可能会随着抗原量的增加而加强。 

4.小结与讨论 

试验结果令人意外，实施例4中所制备的含有Mhp抗原和APP抗原的二联疫苗无论是从攻毒保护效果上，还是从血清学抗体水平上来看，其免疫效果都比单苗更好，两种抗原之间不仅无相互干扰，而且有协同作用，低抗原量组合疫苗甚至超过了高抗原量单苗的效果，同抗原含量二联苗免疫效果明显好于单苗；而且该二联苗只需一次免疫，即可超过分别免疫单苗的效果，不仅简化了免疫程序，更加提高了免疫效果。 

实施例8：评价Mhp-APP组合疫苗与PRRSV活疫苗联合使用时的免疫效力 

1.材料： 

按照实施例4方法制备的疫苗2。 

普莱柯生物工程股份有限公司生产的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(CH-1R株)，批号120205。 

上海海利生物技术股份有限公司生产的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R 株)，批号11093。 

瑞普生物技术股份有限公司生产的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(R98株)，批号120109。 

4～5周龄，Mhp和APP血清抗体均为阴性的猪。 

2.方法： 

(1)PRRSV含量测定 

取3种PRRSV活疫苗，分别用疫苗2和参考稀释液(无菌PBS)，稀释复原至1头份/1ml，20±3℃放置2h，依照各自产品质量标准中的病毒含量测定方法测定稀释后疫苗中PRRSV含量。通过与参考稀释液的比较，评估Mhp-App组合疫苗对病毒活性的影响。 

(2)组合疫苗免疫攻毒试验： 

分别取3种活疫苗，按照实施例4方法制备疫苗2稀释复原至0.5头份/ml，编号如下。 

表26 

  疫苗编号>  组分>  PRRSV含量>  疫苗A>  疫苗2+PRRS(CH1-R株)>  0.5头份/ml>  疫苗B>  疫苗2+PRRS(JXA1-R株)>  0.5头份/ml>  疫苗C>  疫苗2+PRRS(R98株)>  0.5头份/ml>

选4～5周龄仔猪90头，随机分组，分别免疫稀释好的疫苗A、B、C，设PBS对照，免疫后28d分别攻毒App LC株、YC株、YS株以及免疫后60d攻毒MhpCVCC354株。记录病变以及统计攻毒保护情况。具体如下表。 

表27 

3.结果和讨论 

(1)PRRSV含量测定结果如下： 

表28 

结果表明，疫苗2稀释冻干PRRSV活疫苗后，与参考稀释液相比，PRRSV含量略有下降，但不超过0.4log10，均符合各自产品质量标准。所以，本发明中组合疫苗与PRRSV活疫苗联合使用时，并不影响PRRSV活性。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。