用于提取试管树苗的基因组DNA的试样制备方法

摘要

一种用于提取试管树苗的基因组DNA的试样制备方法，其步骤是：把研磨至粉末状的试管树苗进行预前处理，预前处理步骤为：a、把增殖生长３０天左右的试管树苗顶部嫩梢，研磨至粉末加入离心管中，按照试管树苗与提取液体积与β－巯基乙醇的比例1g:3-10ml:25-80ul，依次加入提取液和β－巯基乙醇，摇动混合均匀；在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000g的离心机中把离心管运行8-12分钟；b、抛弃上清部分，沉淀再次加入提取液，上下颠倒离心管使沉淀充分溶解，在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000g的离心机中把离心管运行8-12分钟；C、至少重复步骤b两次，在离心管中得到的沉淀物即为经过预前处理的前期试样；使用高盐CTAB提取液按照CTAB方法，把试管树苗中的蛋白质和多糖进行充分处理，使ＤＮＡ释放出来，因此制取的基因组DNA效果好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取基因组DNA的方法，尤其是一种用于提取试管树苗的基因组DNA的试样制备方法。

背景技术

在分子生物学、转基因材料检测等研究中, 高质量基因组DNA的获得是重要前提，获取DNA质量的优劣可能直接影响到后期试验研究的成败，因此提取基因组DNA的方法是生物技术中一项重要技术手段。植物材料由于不同物种之间其生理生化特点不同，不同生长期、不同生长部位及生长在不同条件下其内含物也不一样，其DNA提取的难易不同，提取的方法也不尽相同。目前国内外研究并使用的DNA提取的方法有很多，其中被最广泛应用的是传统的CTAB即十六烷基三甲基溴化铵法和SDS即十二烷基磺酸钠法；水稻、小麦、棉花等一年生作物，一般采用SDS法和改良SDS法，就可得到高质量的基因组DNA；而多年生的木本果树，由于富含多糖、酚类或单宁等物质，一般多采用CTAB法或改良CTAB法，因为CTAB既可以裂解细胞，又可以有效地去除多酚类和多糖类物质的沉淀；但对不同树种，CTAB法提取基因组DNA的效果不同，为了得到理想的DNA提取效果，针对不同树种、不同材料的具体特点，现有提取基因组DNA的方法大都在CTAB基础上进行一些适当的调整。对田间生长的梨树提取基因组DNA的方法，大多是在CTAB法的基础上进行不同的调整，即添加抗氧化剂防止材料褐变，其方法主要有：一是在磨样时添加Vc；二是在磨样时或在提取液中添加PVP或在提取液中同时加Vc和PVP，都得到了理想的结果；但上述提取基因组DNA的方法中其样品材料都取自田间生长的植株，而对于生长在试管内的无菌苗，由于生长环境的不同，其材料的内含物也不同，应用上述的ＤＮＡ提取方法去提取梨树试管苗的DNA，结果得到的是很难溶解的黏稠的胶状物,　经琼脂糖凝胶电泳检测，观察不到DNA条带的出现；说明添加抗氧化剂的CTAB改良方法不适用于梨树试管苗材料基因组DNA的提取。目前还没有一种用于提取试管树苗的基因组DNA的试样制备方法。

发明内容

为了克服上述技术缺点，本发明的目的是提供一种用于提取试管树苗的基因组DNA的试样制备方法，获得高质量的基因组DNA。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案是：其步骤是：

（1）、把研磨至粉末状的试管树苗进行预前处理，预前处理步骤为：a、把增殖生长30-40天的试管树苗顶部嫩梢，研磨至粉末转入离心管中，按照试管树苗与提取液体积与β－巯基乙醇的比例1 g : 3-10 ml : 25-80 ul ，依次加入提取液和β－巯基乙醇，摇动混合均匀；在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中把离心管运行8-12分钟；b、丢弃上清部分，加入提取液溶解沉淀，在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中把离心管运行8-12分钟；C、至少重复步骤b两次，在离心管中得到的沉淀物即为经过预前处理的前期试样；

（2）、使用高盐CTAB提取液按照CTAB方法，得到试管树苗进行提取基因组DNA的后期试样。

裂解细胞膜前用提取液对研磨好的样品重复洗涤３次，并加入0.2-2%　β－巯基乙醇，目的是去除多糖。β－巯基乙醇防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除，用含高盐（4-6 M NaCl）的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液去除残留的多糖。CTAB可裂解细胞膜、核膜，使DNA从细胞中释放出来。由于设计了预前处理步骤和用高盐CTAB提取液作为介质的CTAB方法，把试管树苗中的蛋白质和多糖充分处理，使ＤＮＡ释放出来，因此制取基因组DNA效果好。

 

本发明设计了，提取液设置为包含有100 -120 mM pH值为 8的Tris-HCl、 4-6 mM pH值为 8的EDTA、0.35-0.5 M 山梨醇、0.2-2 % w/vβ－巯基乙醇。

本发明设计了，高盐CTAB提取液设置为包含有40-60 mM pH值为 8的Tris-HCl、4-6 M pH值为 8的NaCl、25-30 mM pH值为 8的EDTA、 1.5-2.5 %w/v CTAB、1-2% w/vPVP、8-12%w/v 十二烷酰基肌氨酸钠。

本发明设计了，其步骤为：

1、 取0.1- 0.3 g增殖生长30-40天的试管树苗顶部嫩梢，放入直径为５cm的小研钵中，加入液氮用研杵快速研磨至粉末，加入0.8-1.0 ml提取液，转移到1.5 ml 离心管中，置于冰上存放，再去研磨第二个样品；所有样品准备好后，在通风厨内向每一离心管内加入8-10 ul β－巯基乙醇，摇动混合均匀。

2、在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中运行8-12分钟。

3、丢弃上清部分，加入提取液，充分溶解沉淀，重复第2步骤。

4、重复第3步骤。

5、在每个离心管中，加入450-550 ul 提取液使沉淀充分溶解，然后再加入300-400 ul 高盐CTAB提取液，混匀后，置于温度为６５℃水浴中孵育45-90分钟；期间摇动几次离心管，即每个离心管为试样Ⅰ。

６、 在每个含有试样Ⅰ的离心管中加入等体积氯仿，颠倒混合均匀，在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中运行8-12分钟。

7、吸取上清物到另一个离心管，再加入等体积氯仿，重复第6步骤。

8、吸取上清物到一新的离心管，加入２倍体积的100%的乙醇和1/10体积的3M NaAC, 颠倒混匀，在温度为-18－-22℃的环境中，放置30分钟或过夜。

9、在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中运行8-12分钟。

10、丢弃上清部分，沉淀用70-75%乙醇洗涤2-3次,　然后放到超净工作台上，无菌风吹干，每个离心管内的沉淀为试样Ⅱ。

11、在每个含有试样Ⅱ的离心管中加50-100 ul的电导率为３左右的纯净水溶解，再加入0.5-1.0 ul RNAase A, 置于温度为37℃水浴中孵育30-60分钟。

12、加入等体积氯仿，轻轻颠倒混合均匀，在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中运行8-12分钟。

13、 吸取上清物到另一个新离心管，再加入等体积氯仿，重复第12步骤；

14、吸取上清物到另一个离心管，加入２倍体积的100%乙醇和1/10体积的3M NaAC, 上下颠倒混合均匀，在温度为-18－-22℃的环境中，放置至少2小时。

15、在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中运行8-12分钟。

16、丢弃上清部分，沉淀用70-75%乙醇洗涤1-2次,　再放到超净工作台上，无菌风吹干，得到的沉淀即为试样Ⅲ。

17、把纯净水加入到试样Ⅲ中，放到温度为-18－-22℃中保存备用。

本发明设计了，试管树苗设置为试管梨树苗或试管枣树苗。

在高离子强度的溶液中(>0.7Ｍ NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，但不能沉淀核酸, 使DNA溶解在液相中。提取液中含PVP (聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染，同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。十二烷酰基肌氨酸钠是一种阴离子去垢剂，它的作用也是裂解细胞，使ＤＮＡ释放，加入有机溶剂氯仿抽提，氯仿使蛋白变性，去除蛋白，用RNAase A(核糖核酸酶Ａ)去除ＲＮＡ。

本发明的技术效果在于：由于试管苗可用于转基因植株的早期检测也可用于离体诱变变异无性系的早期鉴定，同时试管苗不受季节限制，样品材料可周年供应，方便于开展分子生物学研究，缩短了研究周期。

附图说明

图1梨试管苗基因组ＤＮＡ纯度电泳检测结果示意图：

图２转GUS和AG基因的梨转基因株系PCR分析示意图：

图３梨转基因植株基因组DNA酶切产物电泳结果示意图： 图４梨转基因植株Southern杂交结果示意图：

图5枣树试管苗基因组ＤＮＡ纯度电泳结果示意图。

图6枣树试管苗基因组ＤＮＡ酶切结果电泳图。

图7枣树转ＧＵＳ基因转基因株系的PCR扩增图。

具体实施方式

本发明的第一个实施例，其步骤是：

（1）、把研磨至粉末状的试管梨树苗进行预前处理，预前处理步骤为：a、把增殖生长30-40天的试管树苗顶部嫩梢，研磨至粉末转入离心管中，按照试管树苗与提取液体积与β－巯基乙醇的比例1 g : 3 ml : 25 ul ，依次加入提取液和β－巯基乙醇，摇动混合均匀；在温度为3℃的环境中，在离心力为8000 g的离心机中把离心管运行8分钟；b、丢弃上清部分，加入提取液溶解沉淀，在温度为3℃的环境中，在离心力为8000 g的离心机中把离心管运行8分钟；C、至少重复步骤b两次，在离心管中得到的沉淀物即为经过预前处理的前期试样；

（2）、使用高盐CTAB提取液按照CTAB方法，得到试管树苗进行提取基因组DNA的后期试样。

在本实施例中，提取液设置为包含有100 mM pH值为 8的Tris-HCl、 4mM pH值为 8的EDTA、0.35 M 山梨醇、0.2% w/vβ－巯基乙醇。

在本实施例中，高盐CTAB提取液设置为包含有40 mM pH值为 8的Tris-HCl、4 M pH值为 8的NaCl、25 mM pH值为 8的EDTA、 1.5 %w/v CTAB、1% w/vPVP、8%w/v 十二烷酰基肌氨酸钠。

本发明的第二个实施例，其步骤是：

（1）、把研磨至粉末状的试管梨树苗进行预前处理，预前处理步骤为：a、把增殖生长30-40天的试管树苗顶部嫩梢，研磨至粉末转入离心管中，按照试管树苗与提取液体积与β－巯基乙醇的比例1 g : 10 ml : 80 ul ，依次加入提取液和β－巯基乙醇，摇动混合均匀；在温度为6℃的环境中，在离心力为12000 g的离心机中把离心管运行12分钟；b、丢弃上清部分，加入提取液溶解沉淀，在温度为6℃的环境中，在离心力为12000 g的离心机中把离心管运行12分钟；C、至少重复步骤b两次，在离心管中得到的沉淀物即为经过预前处理的前期试样；

（2）、使用高盐CTAB提取液按照CTAB方法，得到试管树苗进行提取基因组DNA的后期试样。

在本实施例中，提取液设置为包含有120 mM pH值为 8的Tris-HCl、 6 mM pH值为 8的EDTA、0.5 M 山梨醇、2 % w/vβ－巯基乙醇。

在本实施例中，高盐CTAB提取液设置为包含有60 mM pH值为 8的Tris-HCl、6 M pH值为 8的NaCl、30 mM pH值为 8的EDTA、 2.5 %w/v CTAB、2% w/vPVP、12%w/v 十二烷酰基肌氨酸钠。

本发明的第三个实施例，其步骤是：

（1）、把研磨至粉末状的试管梨树苗进行预前处理，预前处理步骤为：a、把增殖生长30-40天的试管树苗顶部嫩梢，研磨至粉末转入离心管中，按照试管树苗与提取液体积与β－巯基乙醇的比例1 g : 6.5 ml : 55 ul ，依次加入提取液和β－巯基乙醇，摇动混合均匀；在温度为4.5℃的环境中，在离心力为10000 g的离心机中把离心管运行10分钟；b、丢弃上清部分，加入提取液溶解沉淀，在温度为4.5℃的环境中，在离心力为10000 g的离心机中把离心管运行10分钟；C、至少重复步骤b两次，在离心管中得到的沉淀物即为经过预前处理的前期试样；

（2）、使用高盐CTAB提取液按照CTAB方法，得到试管树苗进行提取基因组DNA的后期试样。

在本实施例中，提取液设置为包含有110 mM pH值为 8的Tris-HCl、4.5mM pH值为 8的EDTA、0.4 M 山梨醇、1.1% w/vβ－巯基乙醇。

在本实施例中，高盐CTAB提取液设置为包含有50 mM pH值为 8的Tris-HCl、5M pH值为 8的NaCl、27 mM pH值为 8的EDTA、 2 %w/v CTAB、1.5% w/vPVP、10%w/v 十二烷酰基肌氨酸钠。

本发明的第四个实施例，其步骤是：

（1）、把研磨至粉末状的试管枣树苗进行预前处理，预前处理步骤为：a、把增殖生长30-40天的试管树苗顶部嫩梢，研磨至粉末转入离心管中，按照试管树苗与提取液体积与β－巯基乙醇的比例1 g : 8 ml : 40ul ，依次加入提取液和β－巯基乙醇，摇动混合均匀；在温度为5℃的环境中，在离心力为9000g的离心机中把离心管运行11分钟；b、丢弃上清部分，加入提取液溶解沉淀，在温度为5℃的环境中，在离心力为9000g的离心机中把离心管运行11分钟；C、至少重复步骤b两次，在离心管中得到的沉淀物即为经过预前处理的前期试样；

（2）、使用高盐CTAB提取液按照CTAB方法，得到试管树苗进行提取基因组DNA的后期试样。

在本实施例中，提取液设置为包含有110 mM pH值为 8的Tris-HCl、 4.8mM pH值为 8的EDTA、0.41M 山梨醇、1.8 % w/vβ－巯基乙醇。

在本实施例中，高盐CTAB提取液设置为包含有52 mM pH值为 8的Tris-HCl、4.9 M pH值为 8的NaCl、28 mM pH值为 8的EDTA、 1.8 %w/v CTAB、1.8% w/vPVP、11%w/v 十二烷酰基肌氨酸钠。

本发明的第五个实施例，其步骤为：

1、 取0.1- 0.3g增殖生长30-40天左右的试管梨苗顶部嫩梢，放入直径为５cm的小研钵中，加入液氮用研杵快速研磨至粉末，加入0.8-1.0 ml提取液，转移到1.5 ml 离心管中，置于冰上存放，再去研磨第二个样品；所有样品准备好后，在通风厨内向每一离心管内加入8-10 ul β－巯基乙醇，摇动混合均匀。

2、在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中运行8-12分钟。

3、抛弃上清部分，加入提取液，充分溶解沉淀，重复第2步骤。

4、重复第3步骤。

5、在每个离心管中，加入450-550 ul 提取液使沉淀充分溶解，然后再加入300-400 ul 高盐CTAB提取液，混匀后，置于温度为６５℃水浴中孵育45-90分钟；期间摇动几次离心管，即每个离心管为试样Ⅰ。

6、在每个含有试样Ⅰ的离心管中加入等体积氯仿，颠倒混合均匀，在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中运行8-12分钟。

7、吸取上清物到另一个离心管，再加入等体积氯仿，重复第6步骤。

8、吸取上清物到一新的离心管，加入２倍体积的100%的乙醇和1/10体积的3M NaAC, 颠倒混匀，在温度为-18－-22℃的环境中，放置30分钟或过夜。

9、在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中运行8-12分钟。

10、丢弃上清部分，沉淀用70-75%乙醇洗涤2-3次,　然后放到超净工作台上，无菌风吹干，每个离心管内的沉淀为试样Ⅱ。

11、在每个含有试样Ⅱ的离心管中加50-100 ul的电导率为３左右的纯净水溶解，再加入0.5-1.0 ul RNAase A, 置于温度为37℃水浴中孵育30-60分钟。

12、加入等体积氯仿，轻轻颠倒混合均匀，在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中运行8-12分钟。

13、 吸取上清物到另一个新离心管，再加入等体积氯仿，重复第12步骤；

14、吸取上清物到另一个离心管，加入２倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAC, 上下颠倒混合均匀，在温度为-18－-22℃的环境中，放置至少2小时。

15、在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中运行8-12分钟。

16、丢弃上清部分，沉淀用70-75%乙醇洗涤1-2次,　再放到超净工作台上，无菌风吹干，得到的沉淀即为试样Ⅲ。

17、把纯净水加入到试样Ⅲ中，放到温度为-18－-22℃冰箱中保存备用。

在本实施例中，提取液设置为包含有100 -120 mM Tris-HCl (pH 8)、4-6 mM EDTA (pH 8)、0.35-0.5  M 山梨醇、0.2-2% (v/v) β－巯基乙醇(用前现加)。

在本实施例中，高盐CTAB提取液设置为包含有40-60 mM Tris-HCl (pH 8)、４-6 M NaCl、25-30 mM EDTA (pH 8)、 1.5-2.5%  (w/v) CTAB、1-2% (w/v) PVP、8-12% (w/v) 十二烷酰基肌氨酸钠。 

在本实施例中，3 M NaAC(乙酸钠)的pH 值设置为5.2。

在本实施例中，RNAase A设置为RNA酶Ａ 10 mg/ml。

本发明的第六个实施例，其步骤为：

1、 取0.1g增殖生长30-40天左右的试管梨苗顶部嫩梢，放入直径为５cm的小研钵中，加入液氮用研杵快速研磨至粉末，加入0.8 ml提取液，转移到1.5 ml 离心管中，置于冰上存放，再去研磨第二个样品；所有样品准备好后，在通风厨内向每一离心管内加入8 ul β－巯基乙醇，摇动混合均匀。

2、在温度为3℃的环境中，在离心力为8000 g的离心机中运行8分钟。

3、抛弃上清部分，加入提取液，充分溶解沉淀，重复第2步骤。

4、重复第3步骤。

5、在每个离心管中，加入450 ul 提取液使沉淀充分溶解，然后再加入300 ul 高盐CTAB提取液，混匀后，置于温度为６５℃水浴中孵育45分钟；期间摇动几次离心管，即每个离心管为试样Ⅰ。

6、在每个含有试样Ⅰ的离心管中加入等体积氯仿，颠倒混合均匀，在温度为3℃的环境中，在离心力为8000 g的离心机中运行8分钟。

7、吸取上清物到另一个离心管，再加入等体积氯仿，重复第6步骤。

8、吸取上清物到一新的离心管，加入２倍体积的100%的乙醇和1/10体积的3M NaAC, 颠倒混匀，在温度为-18℃的环境中，放置30分钟。

9、在温度为3℃的环境中，在离心力为8000 g的离心机中运行8分钟。

10、丢弃上清部分，沉淀用70%乙醇洗涤2次,　然后放到超净工作台上，无菌风吹干，每个离心管内的沉淀为试样Ⅱ。

11、在每个含有试样Ⅱ的离心管中加50ul的电导率为３的纯净水溶解，再加入0.5ul RNAase A, 置于温度为37℃水浴中孵育30分钟。

12、加入等体积氯仿，轻轻颠倒混合均匀，在温度为3℃的环境中，在离心力为8000 g的离心机中运行8分钟。

13、 吸取上清物到另一个新离心管，再加入等体积氯仿，重复第12步骤；

14、吸取上清物到另一个离心管，加入２倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAC, 上下颠倒混合均匀，在温度为-18℃的环境中，放置至少2小时。

15、在温度为3℃的环境中，在离心力为8000 g的离心机中运行8分钟。

16、丢弃上清部分，沉淀用70%乙醇洗涤1次,　再放到超净工作台上，无菌风吹干，得到的沉淀即为试样Ⅲ。

17、把纯净水加入到试样Ⅲ中，放到温度为-18℃冰箱中保存备用。

在本实施例中，提取液设置为包含有100 mM Tris-HCl (pH 8)、4 mM EDTA (pH 8)、0.35  M 山梨醇、0.2% w/vβ－巯基乙醇。

在本实施例中，高盐CTAB提取液设置为包含有40 mM Tris-HCl (pH 8)、４M NaCl、25 mM EDTA (pH 8)、 1.5%  w/vCTAB、1% w/vPVP、8% w/v十二烷酰基肌氨酸钠。 

在本实施例中，3 M NaAC即乙酸钠的pH 值设置为5.2。

在本实施例中，RNAase A设置为RNA酶Ａ 10 mg/ml。

本发明的第七个实施例，其步骤为：

1、 取0.3g增殖生长30-40天左右的试管梨苗顶部嫩梢，放入直径为５cm的小研钵中，加入液氮用研杵快速研磨至粉末，加入1.0 ml提取液，转移到1.5 ml 离心管中，置于冰上存放，再去研磨第二个样品；所有样品准备好后，在通风厨内向每一离心管内加入10 ul β－巯基乙醇，摇动混合均匀。

2、在温度为6℃的环境中，在离心力为12000 g的离心机中运行12分钟。

3、抛弃上清部分，加入提取液，充分溶解沉淀，重复第2步骤。

4、重复第3步骤。

5、在每个离心管中，加入550 ul 提取液使沉淀充分溶解，然后再加入400 ul 高盐CTAB提取液，混匀后，置于温度为６５℃水浴中孵育90分钟；期间摇动几次离心管，即每个离心管为试样Ⅰ。

6、在每个含有试样Ⅰ的离心管中加入等体积氯仿，颠倒混合均匀，在温度为6℃的环境中，在离心力为12000 g的离心机中运行12分钟。

7、吸取上清物到另一个离心管，再加入等体积氯仿，重复第6步骤。

8、吸取上清物到一新的离心管，加入２倍体积的100%的乙醇和1/10体积的3M NaAC, 颠倒混匀，在温度为-22℃的环境中，放置24小时。

9、在温度为6℃的环境中，在离心力为12000 g的离心机中运行12分钟。

10、丢弃上清部分，沉淀用75%乙醇洗涤3次,　然后放到超净工作台上，无菌风吹干，每个离心管内的沉淀为试样Ⅱ。

11、在每个含有试样Ⅱ的离心管中加100 ul的电导率为３的纯净水溶解，再加入1.0 ul RNAase A, 置于温度为37℃水浴中孵育60分钟。

12、加入等体积氯仿，轻轻颠倒混合均匀，在温度为6℃的环境中，在离心力为12000 g的离心机中运行12分钟。

13、 吸取上清物到另一个新离心管，再加入等体积氯仿，重复第12步骤；

14、吸取上清物到另一个离心管，加入２倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAC, 上下颠倒混合均匀，在温度为-22℃的环境中，放置至少2小时。

15、在温度为6℃的环境中，在离心力为12000 g的离心机中运行12分钟。

16、丢弃上清部分，沉淀用75%乙醇洗涤2次,　再放到超净工作台上，无菌风吹干，得到的沉淀即为试样Ⅲ。

17、把纯净水加入到试样Ⅲ中，放到温度为-22℃冰箱中保存备用。

在本实施例中，提取液设置为包含有120 mM Tris-HCl (pH 8)、6 mM EDTA (pH 8)、0.5  M 山梨醇、2% w/vβ－巯基乙醇。

在本实施例中，高盐CTAB提取液设置为包含有60 mM Tris-HCl (pH 8)、6 M NaCl、30 mM EDTA (pH 8)、 2.5%  w/v CTAB、2% w/vPVP、12% w/v十二烷酰基肌氨酸钠。 

在本实施例中，3 M NaAC即乙酸钠的pH 值设置为5.2。

在本实施例中，RNAase A设置为RNA酶Ａ 10 mg/ml。

本发明的八个实施例，其步骤为：

1、 取0.2g增殖生长30-40天左右的试管梨苗顶部嫩梢，放入直径为５cm的小研钵中，加入液氮用研杵快速研磨至粉末，加入0.9 ml提取液，转移到1.5 ml 离心管中，置于冰上存放，再去研磨第二个样品；所有样品准备好后，在通风厨内向每一离心管内加入9ul β－巯基乙醇，摇动混合均匀。

2、在温度为4.5℃的环境中，在离心力为10000 g的离心机中运行10分钟。

3、抛弃上清部分，加入提取液，充分溶解沉淀，重复第2步骤。

4、重复第3步骤。

5、在每个离心管中，加入500 ul 提取液使沉淀充分溶解，然后再加入350 ul 高盐CTAB提取液，混匀后，置于温度为６５℃水浴中孵育65分钟；期间摇动几次离心管，即每个离心管为试样Ⅰ。

6、在每个含有试样Ⅰ的离心管中加入等体积氯仿，颠倒混合均匀，在温度为4.5℃的环境中，在离心力为10000 g的离心机中运行10分钟。

7、吸取上清物到另一个离心管，再加入等体积氯仿，重复第6步骤。

8、吸取上清物到一新的离心管，加入２倍体积的100%的乙醇和1/10体积的3M NaAC, 颠倒混匀，在温度为-20℃的环境中，放置30分钟或过夜。

9、在温度为4.5℃的环境中，在离心力为10000 g的离心机中运行10分钟。

10、丢弃上清部分，沉淀用72.5%乙醇洗涤2次,　然后放到超净工作台上，无菌风吹干，每个离心管内的沉淀为试样Ⅱ。

11、在每个含有试样Ⅱ的离心管中加75 ul的电导率为３的纯净水溶解，再加入0.75ul RNAase A, 置于温度为37℃水浴中孵育45分钟。

12、加入等体积氯仿，轻轻颠倒混合均匀，在温度为4.5℃的环境中，在离心力为10000 g的离心机中运行10分钟。

13、 吸取上清物到另一个新离心管，再加入等体积氯仿，重复第12步骤；

14、吸取上清物到另一个离心管，加入２倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAC, 上下颠倒混合均匀，在温度为-20℃的环境中，放置至少2小时。

15、在温度为4.5℃的环境中，在离心力为10000 g的离心机中运行10分钟。

16、丢弃上清部分，沉淀用72.5%乙醇洗涤2次,　再放到超净工作台上，无菌风吹干，得到的沉淀即为试样Ⅲ。

17、把纯净水加入到试样Ⅲ中，放到温度为-20℃冰箱中保存备用。

在本实施例中，提取液设置为包含有110 mM Tris-HCl (pH 8)、5 mM EDTA (pH 8)、0.45 M 山梨醇、1.5%  w/v  β－巯基乙醇。

在本实施例中，高盐CTAB提取液设置为包含有50 mM Tris-HCl (pH 8)、5 M NaCl、27.5 mM EDTA (pH 8)、 2%  w/vCTAB、1.5% w/vPVP、10% w/v十二烷酰基肌氨酸钠。 

在本实施例中，3 M NaAC即乙酸钠的pH 值设置为5.2。

在本实施例中，RNAase A设置为RNA酶Ａ 10 mg/ml。

本发明的九个实施例，用试管枣苗替代试管梨苗，按照本发明的第五个实施例实施。

本发明的十个实施例，用试管枣苗替代试管梨苗，按照本发明的第六个实施例实施。

本发明的十一个实施例，用试管枣苗替代试管梨苗，按照本发明的第七个实施例实施。

本发明的十二个实施例，用试管枣苗替代试管梨苗，按照本发明的第八个实施例实施。

在本技术方案中，使用高盐CTAB提取液按照CTAB方法，是指实施例五至十二中的第5步骤至第17步骤。

图1为电泳检测ＤＮＡ纯度结果示意图，梨树试管苗基因组DNA琼脂糖凝胶电泳观察：取２ul DNA跑0.8%琼脂糖凝胶电泳，检测ＤＮＡ质量。获得的ＤＮＡ亮带明显。说明本实施例的技术方案的确能去除多糖或其他次生物质对ＤＮＡ的污染，ＤＮＡ纯度高。　

图２分别转GUS和AG基因的梨转基因株系PCR分析示意图，梨试管苗基因组DNA PCR扩增结果分析：对我们实验室获得的梨转基因植株株系，采用本实施例的技术方案提取ＤＮＡ，采用25 ul PCR反应体系，取５０ng基因组ＤＮＡ做模板,加转入基因片段的ＤＮＡ的引物进行PCR扩增，结果得到了特异的扩增条带，条带清晰，效果理想。图2的左图为转GUS基因的株系，图2的右图为转AG基因的转基因株系，Ｍ：为1kb DNA Ｍarker，左、右两图的１都为非转基因的对照，２－７为转基因株系。

图３梨转基因植株基因组DNA酶切产物电泳结果示意图，用内切酶XbaI酶切本方法提取的梨基因组DNA，电泳检测结果如图３。酶切后均可得到一片弥散的泳道。说明本实施例的技术方案提取的DNA可达到酶切要求。

    图4梨转基因植株Southern杂交结果示意图，XbaI内切酶酶切后进行Southern杂交，每一个株系都得到了杂交信号。M: 1kb DNA Ｍarker,1-5是５个不同的转基因株系；C:非转基因植株对照。

图5为枣树试管苗基因组ＤＮＡ纯度电泳检测结果示意图。

图6为枣树试管苗基因组ＤＮＡ酶切结果电泳图。

图7为枣树转ＧＵＳ基因的转基因株系的PCR扩增图。

本专利技术的优点是对含多糖、色素及其他次生代谢物的梨试管苗，能成功实现高质量基因组DNA的提取，提取的DNA纯度高，可用于PCR、Southern等转基因植株的分子检测或其他分子生物学研究。而常规的CTAB提取DNA法在提取梨试管苗基因组ＤＮＡ时，或电泳检测不到DNA条带，或可检测到DNA，但酶切时得不到弥散的带形，影响下一步的Southern分析。本技术的另一个优点是实验操作简单，所用药品为常规药品，价格低，比试剂盒所花费用少，而且比试剂盒提取的DNA质量高，得率也高。

本专利方法应用于本实验室枣试管苗的提取，也成功获得了高质量的基因组DNA。说明本专利方法的确可以解决梨试管苗或其他富含多糖的果树试管苗的多糖或其他次生物对基因组DNA提取的影响问题。

在用于提取试管树苗的基因组DNA的试样制备方法技术领域内；以上只是具体的实施例，凡是在上述实施例中进行同等技术特征的替换或对实施例技术方案的无实质性的改动的技术内容都在本发明的包护范围内。