利用摩擦禾的未减数配子特性培育玉米异源多倍体的方法

摘要

本发明公开了利用摩擦禾的未减数配子特性培育玉米异源多倍体的方法，属于玉米远缘杂交领域。本发明以MTF-1为母本，以玉米或四倍体多年生类玉米为父本杂交，然后选择能越冬、分蘖数在15个以上，且染色体数为母本染色体数与父本雄配子染色体数之和的杂交后代植株，即为新的玉米异源多倍体。本发明方法克服了玉米近缘属种的生殖障碍，以所育成的玉米异源多倍体为桥梁材料转移性状，为育成突破性的玉米品种提供了良好的遗传基础。其次，本发明方法为其他物种的异源多倍体育种提供了典范。本发明方法育成的异源多倍体为多年生，无性繁殖，为异源多倍体起源与进化研究以及多倍体育种提供材料。本发明方法简单，时间短、效率高、工作量小。

说明书

技术领域

本发明属于植物远缘杂交方法领域，具体涉及利用摩擦禾的未减数配子 特性培育玉米异源多倍体的方法。

背景技术

多倍体是指细胞中含有3个或者3个以上染色体组的生物体，分为同源 多倍体和异源多倍体两大类。植物中的多倍体现象十分普遍，许多重要栽培 作物如小麦、棉花、花生、烟草、甘薯、马铃薯等，以及许多果树、蔬菜均 为多倍体，其它一些作物如玉米(Gaut,B.S.等,Proceedings of the  National Academy of Sciences.1997.94(13):6809-6814)、大豆(Shoemaker, R.等，Genetics，1996，144(1):329-338)等其祖先在进化中也经历了多倍 化过程。在植物界中，与二倍体相比，多倍体具有细胞体积增大的效应，往 往表现出茎秆粗壮，叶片、果实和种子较大，糖类和蛋白质等营养物质的含 量增加等特性。此外，多倍体植物往往存在更广泛的生态适应性，在特定环 境中具有更强的可塑性、抗逆性，正是因为这些优势的存在，多倍体优势利 用也备受育种家们的重视。现存的多倍体植物几乎都是天然多倍体，天然多 倍体形成主要有两种途径，一是生物体细胞染色体数目加倍，二是未减数配 子的产生和融合即性加倍，包括单亲或双亲多倍体化。人工合成多倍体主要 是通过体细胞染色体数目加倍，染色体加倍最普遍使用的是秋水仙素，该药 品对人体的毒害作用大，药品的残留对于环境污染严重，并且人工合成多倍 体所需的工作量大，周期长，获得的多倍体稳定性差，目前通过人工合成获 得的多倍体数量有限。

二十世纪30年代，Mangelsdorf等通过二倍体玉米（2n=20.Zea mays L.） 与四倍体摩擦禾（2n=72）远缘杂交首次获得了玉米-摩擦禾异源三倍体杂种 （2n=46）（Mangelsdorf,P.C.等,Journal of Heredity,1931,22(11): 329-343），随着摩擦禾无融合生殖特性的发现与研究的深入(Brown,W.V.等, American Journal of Botany,1958:253-263)，Petrov等人提出将摩擦禾 无融合生殖的特性转入玉米的想法，并通过四倍体玉米（2n=40）与四倍体摩 擦禾（2n=72）远缘杂交首次获得了玉米-摩擦禾异源四倍体杂种（2n=56） (Petrov等.1979)，在玉米-摩擦禾异源四倍体杂种与玉米的回交研究中发 现，玉米-摩擦禾异源四倍体及其衍生后代兼具无融合生殖的特性，能产生一 种独特的B_Ⅲ型杂种后代（Kindiger,B.等,Genetica,1996a,97(1):103-110; Kindiger,B.等,Crop science,1996b,36(5):1108-1113;Sokolov,V. 等,Genetika,2000,32(3):331-353)，在亲本摩擦禾的杂种中也曾有B_Ⅲ型杂种后代报道(Kindiger,B.等,Genetica,1994,92(3):197-201)，B _Ⅲ型杂种是由未减数的卵细胞（2n配子）和减数的精核融合产生的个体，这 种2n+n的结合形式在其它植物中也有报道(Bashaw,E.等,Crop science, 1990,30(3):571-575;Bashaw,E.等,International journal of plant  sciences,1992:466-470;Burson,B.L.,Genome,1992,35(6):1002-1006)， 是一种特殊的生殖方式。

四川农业大学唐祈林等利用摩擦禾这种无融合生殖的特性，以玉米-摩擦 禾异源四倍体杂种（2n=56）为母本，以四倍体多年生类玉米（2n=40）为父 本，成功培育出玉米异源六倍体MTF-1（2n=76），MTF-1包含完整的二倍体玉 米染色体组（20条），四倍体多年生类玉米染色体组（20条）和四倍体指状 摩擦禾染色体组（36条），MTF-1表现为多年生、分蘖旺盛，花粉育性极低， 而雌穗部分可育（苏月贵，四川农业大学硕士论文，2009）。利用无融合生殖 产生2n配子的有性多倍化是天然多倍体形成的主要途径之一，这种机制还可 用于提高杂种后代的倍性水平，克服物种间远缘杂交的障碍，不仅可直接将 育成的玉米异源多倍体作为饲草加以利用，更重要的是可作为桥梁材料将玉 米近缘属种的优良性状转移到栽培玉米中。

发明内容

针对目前玉米育种中存在的遗传基础狭窄，难以产生突破性品种，而玉 米近缘属种之间因存在生殖隔离，使玉米近缘属种的优良性状难以在玉米育 种中得到利用的问题，本发明目的在于提供一种利用摩擦禾的未减数配子特 性培育玉米异源多倍体的方法。利用该方法可以合成更高倍数的玉米异源多 倍体，使不同玉米近缘属种有利基因的聚合和转移变得容易，从而扩大玉米 育种的种质资源基础。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

利用摩擦禾的未减数配子特性培育玉米异源多倍体的方法，包括以下步 骤：

（1）、将玉米异源六倍体MTF-1（Tripsazea creammaize T.2n=76；苏月 贵，四川农业大学硕士论文，2009）进行分兜种植，并分批种植玉米（Zea mays  L.）或四倍体多年生类玉米（Zea perennis）；

（2）、在MTF-1吐丝期，以MTF-1为母本，以玉米或四倍体多年生类 玉米为父本进行杂交，收获呈黑色或灰色的杂交后代种子；其中对MTF-1雌 穗至少重复授粉3次；

（3）、将步骤（2）所得的杂交后代种子种植在人工气候室的营养钵中， 在温度为28℃、湿度为70%的条件下进行催芽，待幼苗生长至3叶1心时移 栽至塑料花盆或田间种植；

（4）、在拔节期，选择分蘖数在15个以上的植株，且在其株高30cm时， 取根尖进行细胞染色体数鉴定，每个单株至少鉴定50个细胞，选择细胞染色 体数为母本染色体数与父本雄配子染色体数之和的植株；对所选的单株进行 分蔸繁殖；

（5）、对步骤（4）所选的植株进行AFLP分析，同时对MTF-1、玉米、 四倍体多年生类玉米和四倍体鸭茅状摩擦禾（Tripsacum dactyloides L.，2n=72） 进行AFLP分析，选择与MTF-1条带（泳带）一致、基因组未丢失的单株；

（6）利用火焰干燥法（见苏月贵，四川农业大学硕士论文，2009年） 对步骤（5）所选的单株的根尖材料进行染色体制片，选择染色体处于有丝分 裂中期且分散度高的根尖燃片进行双色基因组原位杂交，分别用地高辛和生 物素标记玉米和四倍体多年生类玉米的染色体，鉴定其染色体组成；选择根 尖细胞染色体数为母本染色体数与父本雄配子染色体数之和、且其染色体构 成包括来自母本MTF-1的玉米染色体组（20条）、四倍体多年生类玉米染色 体组（20条）和四倍体鸭茅状摩擦禾染色体组（36条），以及父本（玉米或 四倍体多年生类玉米）雄配子染色体组的植株，即为新的玉米异源多倍体（玉 米异源七倍体或玉米异源八倍体）。

上述方法步骤（1）中所述的玉米异源六倍体MTF-1（苏月贵，四川农业 大学硕士论文，2009）是四川农业大学以引自美国的四倍体玉米（Zea mays  L.4n=40）和四倍体鸭茅状摩擦禾（或称指状摩擦禾，Tripsacum dactyloides L.， 2n=72）之间的属间杂种F₁为母本，以四倍体多年生类玉米(Zea perennis， 2n=40)为父本杂交育成的玉米异源六倍体，MTF-1是一个包含完整玉米染色 体组（20条）、鸭茅状摩擦禾染色体组（36条）和四倍体多年生类玉米染色 体组（20条）共76条染色体的属间杂种，是一个自然界不存在的新物种， 四川农业大学将新育成的玉米异源六倍体MTF-1分类命名为玉黍禾属玉淇淋 草种，将其拉丁文分类名称命名为Tripsazea creammaize T.其中T为MTF-1 的育种人及分类人唐祈林的简称。

玉米异源六倍体MTF-1（Tripsazea creammaize T.）（见图1）综合了玉米、 四倍体多年生类玉米和鸭茅状摩擦禾的特点，表现为多年生，无性繁殖，植 株茁壮，直立丛生，根系发达；抽雄时期平均株高为310cm，抽雄期后株高 最高可达335cm，主茎粗9.8-12.9mm，抽雄期单株分蘖达50-60个，分蘖与 主茎茎粗差异不明显，且整个生命周期中不断生成新的根分蘖；叶片深绿细 长，叶长61-81cm，叶宽5.1-5.9cm，单个茎秆叶片数为20-23片；主茎顶端 雄花属圆锥花序，花序长27-30cm，花粉高度不育，茎秆节点上着生5-7个分 枝，分枝顶端为穗状花序的雌花，9-18个小穗在穗轴上呈双行或四行对生排 列。植株雄穗、叶鞘和苞叶均为深紫色。给MTF-1授粉可获得少量种子，种 子颖壳坚硬，呈褐色或灰褐色。植株抗寒、抗涝能力强，在0-5℃及长期水淹 条件下仍能持续长出新分蘖。

MTF-1主要通过分兜繁殖、茎秆扦插或其他无性繁殖方式等无性繁殖方 法进行繁殖。公众可从四川农业大学获得MTF-1（Tripsazea creammaize  T.2n=76）生物材料。

上述方法步骤（1）中所述的玉米（Zea mays L.）是指玉米自交系、玉米 杂交种、玉米综合种、玉米地方品种或玉米育种中间材料等。

所述的玉米自交系是指Mo17、48-2、掖478、沈5003或昌7-2等玉米自 交系。

上述方法步骤（1）中所述的四倍体多年生类玉米是指四倍体多年生类玉 米9475（Zea perennis9475）或其他四倍体多年生类玉米材料，公众可从 墨西哥小麦玉米改良中心免费获得四倍体多年生类玉米9475（Zea perennis 9475）。

上述方法步骤（4）中所述的细胞染色体数鉴定的方法为：在晴天中午 10:00～14:00时且气温高于25℃时取根尖，在黑暗条件下用α-溴萘饱和水溶 液预处理2-3h，将预处理的根尖用清水清洗干净后置于固定液中（固定液的 组成成分及其比例为：无水乙醇:冰醋酸=3:1）12-24h，再将固定后的根尖用 改良卡宝品红染色压片，镜检，鉴定染色体数。

上述方法步骤（4）中所述的分蔸繁殖是指以植株基部的分蘖为种苗进行 无性繁殖的方法。

上述方法步骤（5）中所述的对步骤（4）所选的植株进行AFLP分析的 具体方法为：提取步骤（4）所选的植株的总DNA，同时提取MTF-1、玉米、 四倍体多年生类玉米和四倍体鸭茅状摩擦禾（Tripsacum dactyloides L.，2n=72） 的总DNA，采用EcoRI和MseI进行酶切，37℃酶切连接反应6h，取出后， 置于65℃水浴10min使酶灭活，冷却至室温；其中酶切与酶连接反应体系为： 总DNA5.0μL（100ng/μL），10xBuffer2.5μL，EcoRI/MseI5.0U，EcoRI接 头5.0Pmol，MseI接头5.0Pmol，T₄DNA连接酶10.0U，ddH₂O补齐25.0μL； 然后以酶切和连接反应后所得的DNA为模板，以SEQ ID No:1和SEQ ID No:2 为引物进行预扩增，其中预扩增的PCR反应程序为：94℃变性15s，60℃复 性30s，72℃延伸60s，28个循环；72℃2min，4℃保存；预扩增产物用 2%的琼脂糖凝胶电泳检测，预扩增引物为：

E00：5’-GACTGCGTACCAATTC-3’（SEQ ID No:1），

M00：5’-GATGAGTCCTGAGTAAC-3’；（SEQ ID No:2）；

再以预扩增所得的DNA为模板，分别以SEQ ID No:3至SEQ ID No:34 的16对引物中的每个引物对为引物进行选择性扩增，选择性扩增产物用6% 的变性聚丙烯凝胶电泳检测，选择与MTF-1条带一致、基因组未丢失的单株； 其中所述的选择性扩增PCR程序为：94℃变性10s，65℃复性30s，72℃延 伸60s，13个循环，退火温度每循环降低0.7℃；94℃变性10s，56℃复性 30s，72℃延伸60s，25个循环，延伸每循环增加1s；72℃2min，；其中 所述的16对选择性扩增引物为：

第一对引物：

1-F：5’-GACTGCGTACCAATTCAGG-3’（SEQ ID No:3），

1-R：5’-GATGAGTCCTGAGTAACCAA-3’（SEQ ID No:4）；

第二对引物：

2-F：5’-GACTGCGTACCAATTCACC-3’（SEQ ID No:5），

2-R：5’-GATGAGTCCTGAGTAACCAA-3’（SEQ ID No:6）；

第三对引物：

3-F：5’-GACTGCGTACCAATTCACG-3’（SEQ ID No:7），

3-R：5’-GATGAGTCCTGAGTAACCAA-3’（SEQ ID No:8）；

第四对引物：

4-F：5’-GACTGCGTACCAATTCAAC-3’（SEQ ID No:9），

4-R：5’-GATGAGTCCTGAGTAACCAA-3’（SEQ ID No:10）；

第五对引物：

5-F：5’-GACTGCGTACCAATTCAGC-3’（SEQ ID No:11），

5-R：5’-GATGAGTCCTGAGTAACCAA-3’（SEQ ID No:12）；

第六对引物：

6-F：5’-GACTGCGTACCAATTCAAG-3’（SEQ ID No:13），

6-R：5’-GATGAGTCCTGAGTAACCAA-3’（SEQ ID No:14）；

第七对引物：

7-F：5’-GACTGCGTACCAATTCACA-3’（SEQ ID No:15），

7-R：5’-GATGAGTCCTGAGTAACCAA-3’（SEQ ID No:16）；

第八对引物：

8-F：5’-GACTGCGTACCAATTCACT-3’（SEQ ID No:17），

8-R：5’-GATGAGTCCTGAGTAACCAA-3’（SEQ ID No:18）；

第九对引物：

9-F：5’-GACTGCGTACCAATTCACG-3’（SEQ ID No:19），

9-R：5’-GATGAGTCCTGAGTAACCAT-3’（SEQ ID No:20）；

第十对引物：

10-F：5’-GACTGCGTACCAATTCACC-3’（SEQ ID No:21），

10-R：5’-GATGAGTCCTGAGTAACCAT-3’（SEQ ID No:22）；

第十一对引物：

11-F：5’-GACTGCGTACCAATTCACG-3’（SEQ ID No:23），

11-R：5’-GATGAGTCCTGAGTAACCAT-3’（SEQ ID No:24）；

第十二对引物：

12-F：5’-GACTGCGTACCAATTCAAC-3’（SEQ ID No:25），

12-R：5’-GATGAGTCCTGAGTAACCAT-3’（SEQ ID No:26）；

第十三对引物：

13-F：5’-GACTGCGTACCAATTCAGC-3’（SEQ ID No:27），

13-R：5’-GATGAGTCCTGAGTAACCAT-3’（SEQ ID No:28）；

第十四对引物：

14-F：5’-GACTGCGTACCAATTCAAG-3’（SEQ ID No:29），

14-R：5’-GATGAGTCCTGAGTAACCAT-3’（SEQ ID No:30）；

第十五对引物：

15-F：5’-GACTGCGTACCAATTCACA-3’（SEQ ID No:31），

15-R：5’-GATGAGTCCTGAGTAACCAT-3’（SEQ ID No:32）；

第十六对引物：

16-F：5’-GACTGCGTACCAATTCACT-3’（SEQ ID No:33），

16-R：5’-GATGAGTCCTGAGTAACCAT-3’（SEQ ID No:34）。

上述利用摩擦禾的未减数配子特性培育玉米异源多倍体的方法，具体包 括以下步骤：

（1）、在四川省，从三月下旬开始，分10批种植玉米(Zea mays L.，2n=20， 以下同)，每批70株，每批种植间隔10天，玉米采用双株种植，其中行距为 60cm，株距为35cm；在四月上旬，按照行距为2米、株距为2米的距离将 玉米异源六倍体MTF-1（Tripsazea creammaize T.2n=76；苏月贵，四川农业 大学硕士论文，2009）进行分蔸种植；

（2）、在吐丝期，在吐丝前将MTF-1雌穗套袋，并在MTF-1雌穗吐丝 后将MTF-1花丝剪短至1～3cm，然后以玉米为父本给MTF-1雌穗授粉，每 个雌穗至少重复授粉3次，每次授粉后在套袋上作标记；收获呈黑色或灰色 的杂交后代种子；

（3）、次年4月，将步骤（2）得到的杂交后代种子种植在人工气候箱的 营养钵中，在温度为28℃、湿度为70%的条件下进行催芽，植株生长至3叶 1心时移栽至塑料花盆或大田中种植；

（4）、在拔节期，选择具有分蘖、且分蘖数在15个以上的植株，待植株 株高30cm时，取根尖，鉴定细胞染色体数；每个单株至少鉴定50个细胞， 选择细胞染色体数为母本染色体数与父本雄配子染色体数之和(2n=86)的单 株，并对所选的单株进行分蔸繁殖；

（5）、对步骤（4）所选的植株进行AFLP分析，同时对MTF-1、玉米、 四倍体多年生类玉米、四倍体鸭茅状摩擦禾（Tripsacum dactyloides L.，2n=72） 进行AFLP分析，选择与MTF-1条带（泳带）一致、基因组未丢失的单株；

（6）、利用火焰干燥法（苏月贵，四川农业大学硕士论文，2009）对步 骤（5）所选的单株的剩余根尖材料进行染色体制片，选择染色体处于有丝分 裂中期且分散度高的根尖燃片进行双色基因组原位杂交，分别用地高辛和生 物素标记玉米和四倍体多年生类玉米染色体，鉴定其染色体组成；选择根尖 细胞染色体数目为86条，且其染色体组构成为玉米染色体30条、四倍体多 年生类玉米染色体20条和四倍体鸭茅状摩擦禾染色体数36条的植株，即育 成的玉米异源七倍体。

上述方法步骤（3）中所述的塑料花盆的口径为40cm，高度为35cm。

上述方法步骤（4）中所述的鉴定细胞染色体数目的方法为：在晴天中午 10：00～14:00时且气温高于25℃时取根尖，在黑暗条件下用α-溴萘饱和水 溶液预处理2-3h，将预处理的根尖用清水清洗干净后置于固定液中（固定液 的组成成分及其比例为：无水乙醇:冰醋酸=3:1）24h以上，再将固定后的根 尖用改良卡宝品红染色压片，镜检，鉴定染色体数。

上述方法步骤（5）中所述的AFLP分析的方法为：提取步骤（4）所选 的植株的总DNA，同时提取MTF-1、玉米、四倍体多年生类玉米和四倍体鸭 茅状摩擦禾（Tripsacum dactyloides L.，2n=72）的总DNA，采用EcoRI和 MseI进行酶切，37℃酶切连接反应6h，取出后，置于65℃水浴10min使酶 灭活，冷却至室温；其中酶切与酶连接反应体系为：总DNA5.0μL（100ng/μL）， 10xBuffer2.5μL，EcoRI/MseI5.0U，EcoRI接头5.0Pmol，MseI接头5.0 Pmol，T₄DNA连接酶10.0U，ddH₂O补齐25.0μL；然后以酶切和连接反应 后所得的DNA为模板，以SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物进行预扩增， 其中预扩增的PCR反应程序为：94℃变性15s，60℃复性30s，72℃延伸 60s，28个循环；72℃2min，4℃保存；预扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电 泳检测；再以预扩增所得的DNA为模板，分别以SEQ ID No:3至SEQ ID No:34 的16对引物中的每个引物对为引物进行选择性扩增，选择性扩增产物用6% 的变性聚丙烯凝胶电泳检测，选择与MTF-1条带一致、基因组未丢失的单株； 其中所述的选择性扩增PCR程序为：94℃变性10s，65℃复性30s，72℃延 伸60s，13个循环，退火温度每循环降低0.7℃；94℃变性10s，56℃复性 30s，72℃延伸60s，25个循环，延伸每循环增加1s；72℃2min。

上述利用摩擦禾的未减数配子特性培育玉米异源多倍体的方法，具体包 括以下步骤：

（1）、在四川省，从三月下旬开始，分7批种植四倍体多年生类玉米(Zea  perennis，2n=40，以下同)，每批间隔7天，每批10株，四倍体多年生类玉 米单株种植，其中株行距为2m×2m；在四月上旬，按照行距为2米、株距 为2米的距离将玉米异源六倍体MTF-1（Tripsazea creammaize T.2n=76；苏 月贵，四川农业大学硕士论文，2009）进行分蔸种植；

（2）、在吐丝期，在吐丝前将MTF-1雌穗套袋，并在MTF-1雌穗吐丝 后将MTF-1花丝剪短至1～3cm，然后以四倍体多年生类玉米为父本给 MTF-1雌穗授粉，每个雌穗至少重复授粉3次，每次授粉后在套袋上作标记， 收获呈黑色或灰色的杂交后代种子；

（3）、次年4月，将步骤（2）得到的种子种植在人工气候箱的营养钵中 中，在温度为28℃，湿度为70%的条件下催芽，植株生长至3叶1心时移栽 至塑料花盆或田间种植；

（4）、选择具有分蘖、且分蘖数在15个以上的植株；待植株株高为30cm 时，取根尖，鉴定细胞染色体数；每个单株至少鉴定50个细胞，选择细胞染 色体数为母本染色体数与父本雄配子染色体数之和(2n=96)的植株，并对所选 的单株进行分蔸繁殖；

（5）、对步骤（4）所选的植株进行AFLP分析，同时对MTF-1、玉米、 四倍体多年生类玉米、四倍体鸭茅状摩擦禾（Tripsacum dactyloides L.，2n=72） 进行AFLP分析，选择与MTF-1条带（泳带）一致、基因组未丢失的单株；

（6）、利用火焰干燥法（苏月贵，四川农业大学硕士论文，2009）对步 骤（5）所选的单株剩余根尖材料进行染色体制片，选择染色体处于有丝分裂 中期且分散度高的根尖燃片进行双色基因组原位杂交，分别用地高辛和生物 素标记玉米和四倍体多年生类玉米染色体，鉴定染色体组成；选择植株根尖 细胞染色体数目为96条、且其染色体构成含有玉米染色体20条、四倍体多 年生类玉米染色体40条和鸭茅状摩擦禾染色体数36条的完整染色体组的单 株，即育成玉米异源八倍体。

上述方法步骤（3）中所述的塑料花盆的口径为40cm，高度为35cm。

上述方法步骤（4）中所述的鉴定细胞染色体数目的方法为：在晴天中午 10：00～14:00时且气温高于25℃时取根尖，在黑暗条件下用α-溴萘饱和水 溶液预处理2-3h，将预处理的根尖用清水清洗干净后置于固定液中（固定液 的组成成分及其比例为：无水乙醇:冰醋酸=3:1）24h以上，再将固定后的根 尖用改良卡宝品红染色压片，镜检，鉴定染色体数。

上述方法步骤（5）中所述的AFLP分析的方法为：提取步骤（4）所选 的植株的总DNA，同时提取MTF-1、玉米、四倍体多年生类玉米和四倍体鸭 茅状摩擦禾（Tripsacum dactyloides L.，2n=72）的总DNA，采用EcoRI和 MseI进行酶切，37℃酶切连接反应6h，取出后，置于65℃水浴10min使酶 灭活，冷却至室温；其中酶切与酶连接反应体系为：总DNA5.0μL（100ng/μL）， 10xBuffer2.5μL，EcoRI/MseI5.0U，EcoRI接头5.0Pmol，MseI接头5.0 Pmol，T₄DNA连接酶10.0U，ddH₂O补齐25.0μL；然后以酶切和连接反应 后所得的DNA为模板，以SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物进行预扩增， 其中预扩增的PCR反应程序为：94℃变性15s，60℃复性30s，72℃延伸 60s，28个循环；72℃2min，4℃保存；预扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电 泳检测；再以预扩增所得的DNA为模板，分别以SEQ ID No:3至SEQ ID No:34 的16对引物中的每个引物对为引物进行选择性扩增，选择性扩增产物用6% 的变性聚丙烯凝胶电泳检测，选择与MTF-1条带一致、基因组未丢失的单株； 其中所述的选择性扩增PCR程序为：94℃变性10s，65℃复性30s，72℃延 伸60s，13个循环，退火温度每循环降低0.7℃；94℃变性10s，56℃复性 30s，72℃延伸60s，25个循环，延伸每循环增加1s；72℃2min。

本发明的优点和积极效果：（1）、本发明方法克服了玉米近缘属种之间的 生殖障碍，以本发明方法培育的玉米异源多倍体作为桥梁材料，可将玉米近 缘属种的优良性状很容易地转移到玉米中，为解决玉米育种中存在的种质基 础狭窄问题，育成突破性的玉米品种提供了良好的遗传种质基础。（2）本发 明方法为其他物种的异源多倍体育种提供了典范。（3）、本发明方法培育的玉 米异源多倍体综合了玉米、四倍体多年生大刍草和摩擦禾的优点，产量高、 品质好，而且多年生，可以直接作为饲草品种应用；（4）、利用本发明方法育 成的玉米异源多倍体稳定性好，并且其具有的多年生、无性繁殖的特性，为 对其长期有效利用提供了保证。（5）利用本发明方法育成的异源多倍体为多 年生，繁殖方式为无性繁殖，田间表现稳定，可以保持亲本的优良性状，为 异源多倍体起源与进化研究以及多倍体育种提供材料。（6）本发明比利用秋 水仙素等方法简单，时间短、效率高、工作量小。

附图说明

图1、玉米异源六倍体MTF-1植株照片。

图2、玉米异源七倍体MTFM-1细胞染色体原位杂交显微照片。

图3、玉米异源七倍体MTFM-1与MTF-1和三个亲本AFLP分析电泳图 谱；其中1为MTFM-1，2为MTF-1、3为四倍体鸭茅状摩擦禾、4为四倍体 多年生类玉米、5为玉米。

图4、玉米异源七倍体MTFM-1的植株照片。

图5、玉米异源八倍体MTFF-1细胞染色体原位杂交显微照片。

图6、玉米异源八倍体MTFF-1与MTF-1和三个亲本AFLP分析电泳图 谱；其中1为MTFF-1，2为MTF-1、3为四倍体鸭茅状摩擦禾、4为四倍体 多年生类玉米、5为玉米。

图7、玉米异源八倍体MTFF-1的植株照片。

具体实施方式

实施例1、利用MTF-1和摩擦禾的未减数配子特性培育玉米异源七倍体

（1）、在四川省成都温江区惠和村农场，从三月下旬开始，分10批双株 种植玉米自交系Mo17(Zea mays，2n=20)，每批间隔10天，每批70株，株 行距为35cm×60cm；在四月上旬，将MTF-1（Tripsazea creammaize T.苏月 贵，四川农业大学硕士论文，2009。公众可从四川农业大学获得）（见图1） 分蔸种植于大田，株行距2m×2m，共50株；

（2）、在吐丝期，在MTF-1雌穗吐丝前，将MTF-1雌穗套牛皮纸袋， 待雌穗吐丝后将花丝剪短至1cm，以Mo17为父本给MTF-1雌穗授粉，每个 雌穗至少重复授粉3次，每次授粉后在牛皮纸袋上做标记，收获呈黑色或灰 色的杂交后代种子。

（3）、次年4月，将步骤（2）得到的种子种在在人工气候箱的营养钵中， 在温度为28℃，湿度为70%的条件下催芽，待幼苗生长至3叶1心时移栽至 塑料花盆中种植，所述的塑料花盆的口径为40cm，高度为35cm。

（4）、在拔节期，选择具有分蘖，且分蘖数在15个以上的植株，待植株 株高30cm时，在晴天中午10：00～14:00时且气温25℃时取根尖，在黑暗条 件下用α-溴萘饱和水溶液预处理2-3h，将预处理的根尖用清水清洗干净后置 于固定液中（固定液的组成成分及其比例为：无水乙醇:冰醋酸=3:1）24h， 再将固定后的根尖放置于70%无水乙醇中保存在4℃；将固定后的根尖用改 良卡宝品红染色压片，在显微镜下鉴定染色体数，每个单株鉴定50个细胞， 选择细胞染色体数为母本染色体数与父本减数雄配子染色体数之和(2n=86) 的植株（见图2），并对所选的单株进行分蔸繁殖。

（5）、对步骤（4）所选的植株进行AFLP分析，具体方法为：提取步骤 （4）所选的染色体数目为86的植株的幼嫩叶片的总DNA，以及MTF-1 （Tripsazea creammaize T.2n=76），二倍体玉米（Zea mays L.2n=20），四本体 鸭茅状摩擦禾（或称指状摩擦禾，Tripsacum dactyloides L.，2n=72）和四倍体 多年生类玉米（Zea perennis，2n=40）的幼嫩叶片的总DNA，采用EcoRI和 MseI进行酶切，37℃酶切连接反应6h，取出后，置于65℃水浴10min使酶 灭活，冷却至室温；其中酶切与酶连接反应体系为：总DNA5.0μL（100ng/μL）， 10xBuffer2.5μL，EcoRI/MseI5.0U，EcoRI接头5.0Pmol，MseI接头5.0 Pmol，T₄DNA连接酶10.0U，ddH₂O补齐25.0μL；然后以酶切和连接反应 后所得的DNA为模板，以SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物进行预扩增， 其中预扩增的PCR反应程序为：94℃变性15s，60℃复性30s，72℃延伸 60s，28个循环；72℃2min，4℃保存；预扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电 泳检测；再以预扩增所得的DNA为模板，分别以SEQ ID No:3至SEQ ID No:34 的16对引物中的每个引物对为引物进行选择性扩增，选择性扩增产物用6% 的变性聚丙烯凝胶电泳检测，选择与MTF-1条带一致、基因组未丢失的单株 （图3）；其中所述的选择性扩增PCR程序为：94℃变性10s，65℃复性30s， 72℃延伸60s，13个循环，退火温度每循环降低0.7℃；94℃变性10s，56℃ 复性30s，72℃延伸60s，25个循环，延伸每循环增加1s；72℃2min。

（6）、利用火焰干燥法对步骤（5）筛选的单株剩余根尖材料进行染色 体制片，选择分裂相好的根尖燃片进行双色基因组原位杂交，分别用地高辛 和生物素标记二倍体玉米和四倍体多年生类玉米染色体，鉴定染色体组成。 选择根尖细胞染色体数目为86条，且包含玉米染色体30条、四倍体多年生 类玉米染色体20条和四倍体鸭茅状摩擦禾染色体数36条的材料，鉴定结果 即为育成的多年生玉米异源七倍体（见图4），定名为MTFM-1。

实施例2、利用MTF-1和摩擦禾的未减数配子特性培育玉米异源八倍体

按照如下方法进行：

（1）在四川省成都温江区惠和村农场，从三月下旬开始，分7批种植四 倍体多年生类玉米9475(Zea perennis9475，2n=40)（墨西哥国际玉米和小麦 改良中心免费提供），每批间隔7天，每批10株，四倍体多年生类玉米单株 种植，株行距为2m×2m；在四月上旬，将四川农业大学培育的玉米异源六 倍体MTF-1（Tripsazea creammaize T.苏月贵，四川农业大学硕士论文，2009。 公众可从四川农业大学获得）分蔸种植于大田，株行距为2m×2m，共50株；

（2）、在吐丝期，在MTF-1雌穗吐丝前，将MTF-1雌穗套牛皮纸袋， 待雌穗吐丝后将花丝剪短至2cm，以四倍体多年生类玉米9475为父本给 MTF-1授粉，每个雌穗至少重复授粉3次，每次授粉后在牛皮纸袋上作标记， 收获呈黑色或灰色的杂交后代种子。

（3）、次年4月，将步骤（2）得到的杂交后代种子种植在人工气候箱的 营养钵中，在温度为28℃，湿度为70%的条件下进行催芽，植株生长至3叶 1心时移栽至塑料花盆中，所述的塑料花盆的口径为40cm、高度为35cm。

（4）、在分蘖期，选择具有分蘖、且分蘖数在15个以上的后代植株，待 植株株高为30cm时，在晴天中午10:00～14:00时且气温≥25℃时取根尖，在 黑暗条件下用α-溴萘饱和水溶液预处理2-3h，将预处理的根尖用清水清洗干 净后置于固定液（固定液的组成成分及其比例为：无水乙醇:冰醋酸=3:1）中 24小时，再将固定后的根尖放置于70%无水乙醇中保存在4℃备用；将步骤 固定的根尖用改良卡宝品红染色压片鉴定染色体数，每个单株鉴定50个细胞， 选择染色体数为母本染色体数与父本减数雄配子染色体数之和(2n=96)的植 株（见图5），并对所选的单株进行分蔸繁殖。

（5）、对步骤（4）所选的植株进行AFLP分析，具体方法为：采用2×CTAB 法提取步骤（4）所选的染色体数为96的植株幼嫩叶片的总DNA，以及MTF-1， 玉米自交系Mo17，四倍体鸭茅状摩擦禾（墨西哥小麦玉米改良中心免费提供） 和四倍体多年生类玉米9475（墨西哥小麦玉米改良中心免费提供）的幼嫩叶 片总基因组DNA，采用EcoRI和MseI进行酶切，37℃酶切连接反应6h，取 出后，置于65℃水浴10min使酶灭活，冷却至室温；其中酶切与酶连接反应 体系为：总DNA5.0μL（100ng/μL），10xBuffer2.5μL，EcoRI/MseI5.0U， EcoRI接头5.0Pmol，MseI接头5.0Pmol，T₄DNA连接酶10.0U，ddH₂O 补齐25.0μL；然后以酶切和连接反应后所得的DNA为模板，以SEQ ID No:1 和SEQ ID No:2为引物进行预扩增，其中预扩增的PCR反应程序为：94℃变 性15s，60℃复性30s，72℃延伸60s，28个循环；72℃2min，4℃保存； 预扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测；再以预扩增所得的DNA为模板， 分别以SEQ ID No:3至SEQ ID No:34的16对引物中的每个引物对为引物进 行选择性扩增，选择性扩增产物用6%的变性聚丙烯凝胶电泳检测，选择与 MTF-1条带一致、基因组未丢失的单株（图6）；其中所述的选择性扩增PCR 程序为：94℃变性10s，65℃复性30s，72℃延伸60s，13个循环，退火 温度每循环降低0.7℃；94℃变性10s，56℃复性30s，72℃延伸60s，25 个循环，延伸每循环增加1s；72℃2min。

（6）利用火焰干燥法对步骤（5）所选的单株剩余根尖材料进行染色体 制片，选择分裂相好的根尖燃片进行双色基因组原位杂交，分别用地高辛和 生物素标记二倍体玉米Mo17和四倍体多年生类玉米染色体，鉴定染色体组 成。植株根尖细胞染色体数目为96条，且其染色体构成为包含玉米染色体 20条、四倍体多年生类玉米染色体40条和四倍体鸭茅状摩擦禾染色体数36 条的植株，即为育成的多年生高倍性玉米异源八倍体（见图7），定名为MTFF-1。

实施例3、玉米异源八倍体MTFF-1与玉米异源六倍体MTF-1雌穗和雄 穗性状测定对比试验

按照如下方法进行：

（1）、2012年4月通过分蔸扩繁的方式将玉米异源八倍体MTFF-1（实 施例2）与玉米异源六倍体MTF-1（四川农业大学提供）种植于塑料花盆（口 径40cm×高33cm），每个材料种植10盆。

（2）、测定时期及其所测的形态性状

植株进入抽雄吐丝期后，随机选取玉米异源八倍体MTFF-1与玉米异源 六倍体MTF-1各3盆，用直尺和OlympusSZX16荧光体式镜测量花丝长度、 雌穗长度、花序长、主茎长小花花药长度、主茎短小花花药长度、主茎长小 花长度、主茎短小花长度；统计植株主茎雌穗数、穗粒数、雄花分枝数、主 茎长小花重量、主茎短小花重量，共12个性状。

（3）、测定方法:将材料从固定液中取出，清水冲洗3-5遍后在蒸馏水中 浸泡2-3min。分别放入10%的蔗糖溶液编号，抽其真空，浸泡2-3h用刀片 将材料分割成小段，用OCT冰冻切片包埋剂包埋，置于冰冻切片机（LEICA  CM1850UC）上切片，厚度为35μm，制作成临时装片。同时将花药破裂后 流出的花粉制作成临时装片。将切片或装片置于荧光显微镜（OLYMPUS  BX61）下，分别用绿光、蓝光、紫外光激发后观察拍照。用IPP5.1软件（media  cybernetics）对花药表皮厚度、花药单个花室面积、花药维管束面积、主茎长 小花花粉面积、主茎短小花花粉面积、花丝横切面积、花丝维管束面积、雄 穗茎杆维管束面积、维管束个数、雄穗茎杆横切总面积和雄穗茎杆皮层厚度 11个指标进行测量。

表1MTFF-1与MTF-1性状指标测定对比试验结果（平均值）

测定指标 MTF-1 MTFF-1 穗粒数（粒） 17.3 10.33 花药维管束面积（μm²） 3015.5 3418.86 花丝长度（cm） 8.93 13.7 主茎长小花花粉面积（μm²） 3759.68 3065.27 雄穗茎秆横切总面积（μm²） 1449177.2 975656.36 主茎短小花花粉面积（μm²） 3593.29 3200.62 雌穗长度（cm） 7.37 8.02 主茎雌穗数（个） 5.33 8.33 花丝横切面积（μm²） 596716.03 736324.06

结果（见表1）将所测定的23个性状指标进行统计分析，其中，14个性 状指标无显著性差异，9个性状指标存在显著差异（表1）。结果显示：异源 八倍体MTFF-1穗粒数上产生了退化，但是在花药维管束面积、花丝长度、 主茎长小花花粉面积、雄穗茎杆横切总面积、主茎短小花花粉面积、雌穗长 度、主茎雌穗数、花丝横切面积8个性状上显著超过异源六倍体MTF-1，在 授粉和结实能力上显著超过异源六倍体MTF-1，说明其作为桥梁作物向玉米 转移近缘属种基因具有重大利用价值。