不同菌种对人参发状根的影响及应用方法

摘要

本发明涉及不同菌种对人参发状根的影响及应用方法，属于作物生物技术领域。其过程包括如下方面：(1)外植体处理；(2)菌种的保存与活化；(3)人参发状根诱导条件的优化；(4)人参发状根的获得与鉴定；(6)人参发状根再生体系的建立及条件优化；(7)发状根再生植株途径中生理生化特性的研究。(8)人参发状根及其培养物的组织学观察与核型分析。本发明以发根农杆菌侵染人参诱导发状根，提出了发状根诱导的若干影响因素及发状根再生植株过程，为人参的种质资源保存、创新保存提供了一条新途径，为人参的育种奠定基础。

说明书

技术领域

本发明涉及不同菌种对人参发状根的影响及应用方法，属于作物生物技术领域。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Mey.)为五加科(Araliaceaae)人参属植物，从古至今， 一直闪烁着无穷的魅力和神圣的光彩。我国是人参的发源地，早在两千多年前，我们的 祖先就发现并利用人参防治疾病。我国最早的药学典籍《神农本草经》称，人参“主补 五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目，开心益智，久服轻身延年。”嗣后， 在《明医别录》、《伤寒论》、《唐本草》以及《本草纲目》等医药书籍中都有详细的记述。

医学和药理研究证明，人参皂苷为人参的主要有效成分之一；是人参根的主要生物 活性物质。人参皂苷按其化学性质可分为；人参皂苷二醇型(A型)，包括Ra、Rb1、Rb2、 Rc、Rd、Rh2等；人参皂苷三醇型(B型)，包括Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1等；齐墩果酸 型(C型)。

人参中含有的糖类主要有单糖、低聚糖多糖和杂多糖，总糖含量为4％～6％。单糖类 主要有葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、鼠李糖和木糖；低聚糖中的二糖主要是蔗糖、麦芽糖 和乳糖；三糖主要有人参三糖A、B、C、D等四种；多糖大部分是水溶性的，在人参根、 茎、叶和果中的水溶性多糖都是杂多糖。人参多糖是由人参淀粉和人参果胶两部分组成， 其中人参果胶是主要药理活性成分。

人参的根、茎、叶中均含有游离氨基酸，其各部分所含氨基酸数量及种类都不尽相 同。郑毅男等首次从红参中分离得到了精氨酸衍生物精氨酸双糖苷(AFG)。人参根中含 有多种B族维生素，如VB1、VB2、VB12及烟酸、烟酰胺、泛酸。还含有多种无机元素， 李向高等应用中子活化分析法测定了人参、三七中均含有18种以上的无机元素。

人参挥发油的化学成分主要有三类：第一类为倍半萜类，第二类为长链饱和羧酸类， 此外还有少量芳香烃类。倍半萜类是人参挥发油的主要成分。

发状根因其特性拥有许多细胞、组织和器官培养所无法比拟的优点。与植物细胞培 养和器官培养相比，发状根培养物有许多突出的优点：①生长迅速。黄菊辉等培养的 芥菜转化的发状根生长速度是非转化根的100倍以上。②合成能力高且稳定性强，培养 过程中不需加入激素。③生物转化功能。利用发状根的生物转化功能可以产生许多新的 化合物④向培养基中释放代谢物，发根的这一特性有利于分离提取次生代谢物。⑤可 通过基因工程方法，增加次生物质的产量，发根农杆菌质粒是一个很好的转基因载体， 可把目的基因导入植物细胞中。⑥繁殖能力强。发根具有高度的繁殖潜能，可以制成人 工种子长期保存。⑦发状根易于分离且容易获得再生植株，这对于获得转基因植物或把 外源基因转到可由根再生的植株具有重要意义。⑧发状根可以帮助难以生根的木本植物 生根。

近年来，天然药物特别是植物类药正日益受到人们的重视和欢迎。但是由于人类对 植物药需求的急剧增加，野生资源日趋减少，人工种植药材又面临农药残留、重金属污 染、品种退化以及品质控制等问题。

人参作为名贵药材，在保健和医疗上应用广泛。主要工作集中在栽培、药化、药理 等研究。关于人参遗传转化研究较少，尤其人参发状根形态发生研究较少。本发明以发 根农杆菌侵染人参诱导发状根，探讨影响发状根诱导的若干因素及发状根再生植株过 程，为人参的种质资源保存、创新保存提供了一条新途径，为人参的育种奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于以发根农杆菌侵染人参诱导发状根，提出发状根诱导的若干影响 因素及发状根再生植株过程，为人参的种质资源保存、创新保存提供了一条新途径，为 人参的育种奠定基础。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。

该发明的有益效果在于：

不同菌种对人参发状根的影响及应用方法，其过程包括如下方面：

(1)外植体处理：(I)人参种子萌发及处理：经过沙藏层积处理，已经开裂的种 子，播种到栽培盘中，遮荫培养，待播种1～2周苗长出后，用0.1％L汞消毒6min，无 菌水清洗5次。将其叶片、带叶幼茎和茎段切成1.0cm的切段，接于MS固体培养基上 预培养用作转化的起始材料。(II)人参一年、两年、三年生根的处理：将人参三年生 根表面用清水清洗干净后，流水冲洗3～4h，用0.1％升汞消毒10～20min后，无菌水清 洗5遍，切成0.2cm厚的薄片放在MS固体培养基上待用。

(2)菌种的保存与活化：发根农杆菌的长期保存方法是将农杆菌溶于甘油中，于 -20℃条件下保存，这种方法可以保存菌种几年。短期保存的方法是将发根农杆菌接种 于YEB固体培养基上培养，当长出菌斑后，于4℃冰箱中保存，此种方法可以保存菌种 数月。

无菌条件下，用接种针挑取保存菌液，于YEB固体平板上划线，28℃置于黑暗条件 下培养，直到长出单菌落。挑取一个单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，120r／min、 28℃、暗条件下培养24h，此时YEB液体培养基由接种前的透明的红棕色变成浑浊的淡 黄色，证明细菌已正常长出。取1mL已活化的菌液加入50mL的YEB液体培养基中， 120r／min，28℃暗条件下培养，活化菌液达到生长对数期，此时菌液就可以作为感染用。

(3)人参发状根诱导条件的优化：

(3a)不同菌种对人参发状根诱导率的影响：选择发根农杆菌R1601、8196、A4、 rolA、rolB、rolC六个菌种经平板活化后接入YEB液体培养基，待其菌液生长浓度达到 OD₆₀₀=0.6时用于侵染。2～3周苗龄的人参实生苗叶片，选择生长良好幼嫩的，在无菌条 件下切成0.5cm×0.5cm的小块投入菌液中，25±1℃摇床100～120r／min侵染15～ 30min，无菌条件下取出。灭菌滤纸吸干表面菌液，接于MS培养基上，考察不同菌种对 人参发状根诱导率的影响。

(3b)不同外植体对人参发状根诱导率的影响：选择外植体为2～3周苗龄人参实 生苗的叶片、茎段、叶柄和人参芽胞、人参愈伤组织、1、2、3年生人参根，选择菌种 为发根农杆菌A4，考察人参外植体的选择对发状根诱导率的影响。其中叶片、茎段、叶 柄、人参芽胞为叶盘法，浸染时间为15～30min，人参愈伤组织、人参1、2、3年生根为 滴加法。

(3c)预培养时间对人参发状根诱导率的影响：选择MS固体培养基为预培养基质， 选择2～3周人参实生苗的茎段为材料，预培养时间选为12h、24h、48h、72h、96h，以 考察预培养时间对人参发状根诱导率的影响。

(3d)NAA浓度对人参发状根诱导率的影响：在预培养的MS基本培养基中添加一定 量的NAA有益于发状根的诱导。以2～3周人参实生苗的茎段为材料，MS基本培养基中 添加NAA的浓度选择为0mg／L、2mg／L、4mg／L、6mg／L，比较发状根诱导率考察NAA最适 浓度。

(3e)基质与共培养时间对人参发状根诱导率的影响：一般而言，高盐培养基如MS、 LS等有助于发状根的形成，而低盐培养基如B5等则有助于细菌增殖，所以在发状根形 成后的除菌过程中，除菌比较困难。本实验选择共培养时间为12h、24h、36、48h，共 培养培养基选为MS、1／2MS。外植体为实生苗的叶片，预培养培养基为MS+NAA2.0mg／L 时间为48h，菌种为A4，以考察基质与共培养时间对人参发状根诱导率的影响。

(3f)菌液浓度对人参发状根诱导率的影响：制备好的菌液用YEB液稀释至OD₆₀₀值为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0，将人参实生苗叶柄投入不同浓度的菌液中浸染15～ 30min，25±1℃摇床100～120r／min，然后取出用无菌滤纸吸干表面的菌液，在共培养 基上培养2d后，再转接到MS共培养培养基上，每隔7d换一次培养基。

(3g)AS与侵染时间对人参发状根诱导率的影响：挑取的单菌落接种于添加AS的 30mL YEB液体培养基中活化，AS浓度选为0、100、200μmol／L振荡培养，待其光密度 值为0.6时将人参实生苗的茎段浸入，侵染时间选为10min、15min、20min、25min和 30min。

(3h)Cef浓度对抑菌和侵染的影响：Cef的浓度选择为200、300、400、500、600 mg／L，除菌基质选择为MS基本固体基质。综合比较综合抑菌效果、污染率、获得发根 数三项指标，考察Cef的最优浓度。

(4)人参发状根的获得与鉴定：

(4a)人参发根的获得：①外植体预培养：人参实生苗消毒后，将其叶片切成 1.0cm×1.0cm的小块，叶柄、和茎切成1.0cm长的段，人参一年、二年、三年生根流水 冲洗去表面浮土，经升汞消毒后蒸馏水3～5遍冲净，视材料厚度切成0.2～0.5cm薄片， 将以上材料接于MS+NAA2mg／L培养基中黑暗条件下培养48h用于侵染。②侵染与共培养： 在超净工作台上，将预培养的外植体，转移到装有备好菌液的三角瓶中，封口后放在 120r／min，暗条件下的摇床上感染10～30min，感染后的外植体用无菌滤纸吸干表面菌 液，接种到MS固体培养基中，于黑暗、25℃条件下共培养48h。③除菌培养：将共培养 后的感染材料用无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干外植体表面的无菌水，将其转接到含有 Cef500mg／L的MS固体培养基上培养。于黑暗、25℃条件下除菌培养。

(4b)人参愈伤与一年、二年、三年生根发状根的诱导：用微量移液器吸取活化的 菌株8μL滴到已接到MS固体培养基的人参愈伤组织切面与人参根切片上。避免菌液滴 到MS固体培养基上，25℃，黑暗条件下培养。2周后除去褐化死亡的，转移到新鲜的 MS固体培养基上继续培养。

(4c)PCR分子检测：侵染获得的发状根在形态上与正常人参根相比较体现出明显 的差异，如发状根可在无激素的培养基上迅速生长，多根毛、多分枝、无向地性等特点。 发状根在液体培养基中生长迅速，大于人参愈伤组织悬浮培养物或未转化的根培养物， 这些表型可以为判定发状根提供了形态学上的依据。通过PCR方法对质粒T_L-DNA的rolB 基因检测将进一步提供分子生物学的依据。

①引物设计及合成：质粒T_L-DNA序列分析结果，设计了rolB基因的特异引物prolc1 和prolc2。

引物1：5′-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3′；

引物2：5′-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3′；

利用以上引物可通过PCR扩增到T-DNA上rolB基因的片段，预期长度是423bp，由 上海生工生物有限公司合成。

②CTAB法提取人参发状根总DNA；

③提取发根农杆菌的Ri质粒；

④PCR循环参数

⑤PCR反应体系

超纯水定容至20μL

⑥琼脂凝胶电泳，成像系统下照相。

(5)人参发状根液体与固体培养生长量与总皂苷含量的测定：

发状根液体培养采用1／2MS液体培养基为基本培养基(3％蔗糖，pH值5.8～6.0)， 将10条生长旺盛的约2cm的发状根根尖接入装有30mL1／2MS液体培养基中，温度为 24±1℃，摇床转速100r／min，每隔5d取样，测定发状根干重及人参总皂苷的含量，测 定一个半月。所有数据为3瓶的平均值，重复3次。

绘制标准曲线测定发状根中总皂苷含量：①取Rg10.020g溶于甲醇中，定容为 2mg／mL；②取Rg1对照品溶液30、60、90、120、150μL；③分别置于5支试管中(10mL， 具塞)，甲醇定容为150μL，以相应试剂作对照；④将试管置于冰水浴中加5％香草醛醇溶 液和72％硫酸摇匀，60℃恒温水浴20min；⑤冰水浴15min后在755分光光度仪544nm处检 测。以人参为标准品比色测定，根据标准曲线Y=503.29X+4.456，R²=0.9924求得样品皂 苷含量(％)，标准曲线参见附图1。

发状根中总皂苷的测定：取一定量液体培养的新鲜发状根，蒸馏水冲洗后，用滤纸 吸干发状根表面的水分，称量发状根鲜重。然后于真空干燥箱中80℃下干燥至恒重， 称量。将干燥后的发状根粉碎，放入三角瓶中，加入一定量的浓度为40％的乙醇溶剂， 并将三角瓶口用封口膜密封。置于超声发生器中进行分离提取，提取时间15min，超声 频率为28KHz，提取两次。在冰水浴中加5％香草醛醇溶液和72％H₂SO₄染色，60℃恒温水浴 10min，冰水浴15min，于544nm处测吸光度。

(6)人参发状根再生体系的建立及条件优化：

(6a)人参发状根愈伤组织的诱导：以人参发状根为外植体，置于添加不同浓度， 不同组合的2，4-D、BA、KT等生长调节物质的MS培养基上，蔗糖浓度为30g／L，琼脂6.5 g／L，pH值调至6.0(灭菌前)，灭菌压力为0.1MP持续15～20min。放置于不同光照强度 下，诱导温度为24±1℃，光照周期为12h，弱光培养，12d后统计愈伤组织诱导率(产生 愈伤组织的外植体数／外植体总数)分析各类生长调节物质与光照强度对愈伤组织诱导 作用的大小，筛选最佳种类及浓度组合和光照强度。

(6b)人参发状根的器官发生：

①不同激素浓度、组合与光照对丛生芽生长和分化的影响：分别取不同浓度及组合 的KT、IBA GA35.0mg／L生长调节物质的不同浓度组合对培养物进行处理，分析各物质 对培养物生长、分化的影响，筛选出长势及生物量均达到理想水平的最优培养基配方。 取黑暗、弱光、强光三个光照条件，观察光对培养物的影响。其中弱光为培养室内正常 采光度(约1000Lx)，光周期同正常日变化。强光由日光灯提供(约2000Lx)，光周期为 10h／d。

②不同激素配比对生根的影响：分别取不同浓度及组合的NAA、IBA、GA₃5.0mg／L 生长调节物质的不同浓度组合对培养物进行处理，分析各物质对根长势和生根情况的影 响，筛选出长势及生物量均达到理想水平的最优培养基配方。

(7)发状根再生植株途径中生理生化特性的研究：

(7a)考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量：

牛血清白蛋白配成含蛋白质100μg／mL的标准蛋白溶液。以蛋白质浓度为横坐标， 以吸光度为纵坐标绘制标准曲线：Y=0.0052X-0.0253R²=0.9905；

称取鲜样各1g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL 蒸馏水洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，在室温(20～25℃)下放置1h以充分 提取，然后4000r／min离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL容量瓶，并以蒸馏水定 容。

另取两只10mL具塞试管，分别吸取样品蛋白质提取液0.1mL，放入具塞刻度试管中， 加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混匀，放置2min后以空白为对照，在595nm下 比色，记录吸光值，并通过标准曲线查得蛋白质含量，按照下式计算：

式中X-根据样品的吸光度查得的标准曲线值(μg)；

V_T-提取液总体积(mL)；

W-样品鲜质量(g)；

V_s-测定时加样量(mL)；

N-稀释倍数；

(7b)蒽酮法测定可溶性糖含量：

将分析纯葡萄糖在80℃下烘至恒重，精确称取0.100g，配置成100μg／mL的标准 葡萄糖溶液。以葡萄糖浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线： Y=0.0064X+0.0035  R²=0.9991；

称取材料0.20g，，剪碎放入支刻度试管中，加入8mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸 水中提取30min(提取2次)，提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容 至刻度，吸取0.5mL样品液于试管中，加蒸馏水1.5mL，加入5mL蒽酮硫酸试剂，在630nm 波长下测光密度，按照下式计算：

式中C-从标准曲线查得的糖量(μg)；V_T-提取液总体积(mL)；V_S-测定时取用的样 品体积(mL)；W-组织重量(g)；N-稀释倍数；

(7c)淀粉含量的测定：准确称取100mg纯淀粉，配置成每毫L含淀粉100μg的标 准液，以淀粉浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线：Y=0.0021X+0.0359 R²=0.9658；

将提取可溶性糖以后的残渣，移入50mL容量瓶中，加20mL热蒸馏水，放入沸水浴 中煮15min，再加入9.2mol／LHCLO₄2mL提取15min，冷却后，混匀，2500r／min离心 10min，并用蒸馏水定容，加入5mL蒽酮硫酸试剂，在630nm波长下测光密度，按照下 式计算：

式中C-由标准曲线得到的淀粉质量(μg)；V-提取液量(mL)；W-组织重量(g)；

a-显色时吸取液体积(mL)；

(7d)过氧化物酶活性测定：反应混合液的制备：100mol／L pH6.0磷酸缓冲液50 mL于烧杯中，加入愈创木酚28μl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解， 待溶液冷却后，加入30％H₂O₂19μL，混合均匀，保存于冰箱中备用。

取材料2g放入研钵中，加5mL pH6.0磷酸缓冲液研磨成匀浆，以4000r／min离心 15min，上清液转入20mL容量瓶中，残渣再用5mL磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容 量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。

取混合液3mL和磷酸缓冲液1mL为对照，混合液3mL加入酶液1mL立即开始计时， 于470nm波长下测吸光度值，每隔1min度数1次，按照下式计算：

式中ΔA₄₇₀-反应时间内吸光度变化；W-材料重量(g)；T-反应时间(min)；

V_T-提取酶液总体积(mL)；V_S-测定时取用酶液体积(mL)；

(7e)过氧化氢酶活性测定：

取不同时期材料各1g加3mL预冷过的pH7.8的磷酸缓冲液，放入研钵中研磨成匀 浆，转移至25mL容量瓶中，冲洗研钵数次合并缓冲液定容至刻度，置于5℃冰箱静置 10min取上液，4000r／min离心15min，取上清液再次离心，得上清液5℃保存备用。

取10mL试管3支，其中两支为测定一支为空白，具体见表1。

表1 过氧化氢酶活力测定

             Peroxide                               单位：mL

S0管于沸水中煮1min，冷却。所有试管25℃预热，逐管加入0.3mL0.1mol／L的H₂O₂， 立即计时，240nm测吸光值，每间隔1min读数一次：

${\mathrm{\Delta A}}_{240}=A_{S0}-\frac{A_{S1}+A_{S2}}{2}$

式中A_S0-反应时间内对照管吸光度；A_S1、A_S2-样品测定管吸光度；

W-样品鲜质量(g)；t-反应时间(min)；V_T-提取酶液总体积(mL)；

V_S-测定时取用酶液体积(mL)；0.1表示A₂₄₀下降0.1时的一个酶活性单位(U)；

(7f)多酚氧化酶活性测定：

取2g体细胞胚发生中各时期材料置于预冷研钵中，加入0.2g PVP、5mL0.05mol／L  pH8.0磷酸缓冲液充分研磨成均浆。3000r／min4℃条件下离心15min，取上清r／min 入25mL容量瓶中，用缓冲液再次提取残渣，合并上清，定容，低温保存备用，见表2。

表2 多酚氧化酶活力测定

             oxidase                                 单位：mL

30℃水浴恒温10min，在398nm波长下测定吸光值。

A₃₉₈-反应时间内吸光度变化；W-材料重量(g)；t-反应时间(min)；

V_T-提取酶液总体积(mL)；V_S-测定时取用酶液体积(mL)；

(8)人参发状根及其培养物的组织学观察与核型分析：

(8a)石蜡切片及显微结构观察：①固定：选取发状根、发根诱导的愈伤组织和胚 性愈伤组织，分割成小于1cm左右的小块，材料用FAA固定液固定24h，r／min入70％ 酒精保存于4℃冰箱里；②脱水、透明、透蜡与包埋：室温下经70％，85％，95％，100％， 100％的乙醇中，脱水各2h，乙醇：二甲苯=1：1过夜，纯二甲苯二次各1.5h，二甲苯： 石蜡=1：1，50℃12h，纯石蜡二次60℃各12h的透明、透蜡过程，最后包埋在熔融石 蜡中，待冷却凝固即可；③切片、贴片：蜡块经修整后，用旋转切片机切成10μm的连 续蜡带，再进行贴片，35℃展片烘干12h；④染色、封片：铁矾-苏木精染色法染色，加 拿大树胶封片，TS100型倒置显微镜下观察并照相。

(8b)核型分析：①取材及预处理：上午9～10时取发状根根尖0.5cm，愈伤 0.5cm×0.5cm小块，丛生芽0.5cm叶尖用对二氯苯溶液在室温处理6～12h。②固定： 将预处理过的述材料用蒸馏水冲洗3～5次，然后移入卡诺氏固定液中4～15℃条件下 固定24h，蒸馏水冲洗，放入0.075mol／L液中低渗，在25～30℃条件下，发状根处理 6min，愈伤组织和芽30min，70％乙醇冲洗2次后转入70％乙醇中保存备用。③酸解：将 材料从70％乙醇中取出，用蒸馏水漂洗.然后放入已经在60℃水浴锅中预热的1mol／L  HCI中，在60℃恒温条件下解离10～15min，取出用蒸馏水冲洗2～3次(约10min)。④ 制片：将解离冲洗后的材料置于30～40℃、4％的铁矾水溶液中染色1h，蒸馏水洗涤4～ 5次.每次约5min，置于5％苏木精水溶液中染色2h，蒸馏水冲洗5～10min，45％的醋酸 20min，压片。压片时，用镊子取根尖置于载玻片上，切下根尖分生组织。将其切成薄 片，滴一滴45％的醋酸，迅速捣碎材料，加盖玻片压片。选染色体分散良好的片子冰冻 揭盖片，放入烘箱，40℃干燥1h。室温下自然干燥24h以上，二甲苯透明，中性树胶封 片。

进一步地，上述步骤(4c)中的CTAB法提取人参发状根总DNA步骤为：

(1)取280mg经继代培养的人参发状根加入10％PVP在液氮中充分研磨至粉状(约 30s～1min)；

(2)用药匙小心转移至1.5mL的离心管中，加入65℃预热的660μL2×CTAB的提 取缓冲液，65℃水浴45min，每隔5～10min轻轻振荡一次；

(3)取出Eppendorff管冷却至室温，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，混匀， 12000r／min，离心10min；

(4)用一只剪去前头的枪头，小心将上清液转移到一只新的1.5mL离心管中，并 加入两倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，即见到丝状沉淀，-20℃下放置30min， 12000r／min，离心5min，得到淡黄色沉淀；

(5)倾去上清液，并用吸水纸吸净残余溶液，加入300μL超纯水重新溶解，再加 入-20℃预冷的无水乙醇600μL，沉淀过夜；

(6)12000r／min，离心10min，得到白色的胶状沉淀。倾去上清液，并用吸水纸吸 净残余溶液，加入70％乙醇800μL洗涤沉淀2～3次；

(7)吸净残余溶液，置超净工作台吹干(约需10～15min)；

(8)加入40～60μL超纯水，溶解沉淀，加入3μLRnase，室温放置30min后，-20℃ 下保存。

进一步地，上述步骤(4c)中提取发根农杆菌的Ri质粒步骤为：

(1)挑取R1601单菌落于10mLYEB培养基中，28℃，120r／min，过夜培养；

(2)吸取8mL培养好的菌液，加入10mL离心管中，4000r／min，离心5min，倾去 培养液，加入2mL预冷的STE，重新悬浮细胞。分别吸取1mL菌悬液，加入1.5mL离心 管中，12000r／min离心2min，倾去培养液，获得适量的菌体细胞；

(3)入200μL冰浴过的Solution I，涡旋振荡使细胞均匀分布，室温下放置10min；

(4)加入400μL新鲜配置好的SolutionII，轻轻颠倒混匀，冰浴5min；

(5)加入300μL SolutionIII，反复颠倒数次，使溶液在粘稠的菌体裂解物中分散 均匀，然后置冰上5min；

(6)12000r／min离心10min，小心吸取上清液加入1.5mL离心管中；

(7)加入等体积的饱和酚、氯仿，通过剧烈振荡混合有机相和水相，12000r／min 离心5min；

(8)小心吸取上清液加入新的1.5mL离心管中，用等体积的氯仿重新抽提一次；

(9)小心吸取上清液加入新的1.5mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，1／10 体积的3mol／LNaAc，冰浴30min，12000r／min，离心10min，倾去上清液，倒置在吸水 纸上，使溶液流尽；

(10)加入1mL70％乙醇洗涤两次，12000r／min离心5min，收集沉淀；

(11)倾去洗涤液，倒置于吸水纸上吸干残余的溶液，在超净工作台上吹干；

(12)加入50μLTE重悬，备用。

进一步地，上述步骤(4c)中琼脂凝胶电泳步骤为：

(1)以胶带条封住电泳槽胶模边缘形成一个模具；

(2)配制足量的电泳缓冲液(1×TAE)用以灌满电泳槽和配制凝胶；

(3)准确称量琼脂粉加到盛有一定量电泳缓冲液的三角瓶中在微波炉中加热至融 化，小心加入溴乙锭，终浓度为0.5μg／mL，轻旋以混匀凝胶溶液。

(4)在模具上放合适的梳子形成加样孔，然后倒入适量温热的琼脂糖溶液，室温 30min以后，去掉封边胶带。将凝胶放入电泳槽，使电泳缓冲液没过凝胶约1mm；

(5)混合PCR扩增产物样品和0.2倍体积的上样缓冲液；

(6)用微量移液管一次性枪头将样品混合液缓慢加入浸没凝胶的加样孔内，分子质 量标准加在样品的左侧；

(7)关上电泳槽盖，接好电极插头，DNA向阳极端泳动，给予1～5V／cm的电压，很 快观察到溴酚蓝从加样孔进入胶体内；

(8)当DNA样品或溴酚蓝和二甲苯氰FF在凝胶中迁移了足够的距离时，关上电源， 拔出电极插头和打开电泳槽盖，把凝胶置于凝胶成像系统下照相。

本发明的有益效果在于：本发明以发根农杆菌侵染人参诱导发状根，提出了发状根 诱导的若干影响因素及发状根再生植株过程，为人参的种质资源保存、创新保存提供了 一条新途径，为人参的育种奠定基础。

附图说明

图1为本发明实施例中标准曲线的测定图。

图2为本发明实施例中发根农杆菌A4菌液浓度对人参诱导率的影响图。

图3为本发明实施例中AS以及感染时间对人参诱导率的影响图。

图4为本发明实施例中不同外植体对人参发状根诱导率的影响图。

图5为本发明实施例中预培养时间对人参诱导率的影响图。

图6为本发明实施例中NAA浓度对人参诱导率的影响图。

图7为本发明实施例中共培养时间对人参诱导率的影响图。

图8为本发明实施例中不同Cef浓度对抑菌效果和芽分化的影响图。

图9为本发明实施例中人参发状根PCR检测结果图。

图10为本发明实施例中人参发状根液体培养条件下生长与皂苷含量的动态曲线。

图11为本发明实施例中5种不同的培养基对人参发状根生长倍数的影响图。

图12为本发明实施例中光照对培养物的影响图。

图13为本发明实施例中光照对不定芽分化率的影响图。

图14为本发明实施例中光照对不定芽生长率的影响图。

图15为本发明实施例中不同发育时期可溶性蛋白含量图(1：人参发状根；2：人 参发状根愈伤组织；3：人参发状根形成芽的愈伤组织)。

图16为本发明实施例中不同发育时期可溶性糖含量图(1：人参发状根；2：人参 发状根愈伤组织；3：人参发状根形成芽的愈伤组织)。

图17为本发明实施例中不同发育时期淀粉含量比较图(1：人参发状根；2：人参 发状根愈伤组织；3：人参发状根形成芽的愈伤组织)。

图18为本发明实施例中不同的发育时期过氧化物酶活性图(1：人参发状根；2： 人参发状根愈伤组织；3：人参发状根形成芽的愈伤组织)。

图19为本发明实施例中不同的发育时期过氧化氢酶活性图(1：人参发状根；2： 人参发状根愈伤组织；3：人参发状根形成芽的愈伤组织)。

图20为本发明实施例中不同时期多酚氧化酶活性图(1：人参发状根；2：人参发 状根愈伤组织；3：人参发状根形成芽的愈伤组织)。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述该发明的具体实施方式。

实施例1：人参发状根诱导条件的优化

(1)不同菌种对人参发状根诱导率的影响：本实施例中选择R1601、8196、A4、 rolA、rolB、rolC六个菌种侵染2～3周苗龄的人参实生苗叶片，考察不同菌种对人参 发状根诱导率的影响，其结果见表3。

表3 不同菌种对人参发状根诱导率的影响

不同菌种间的致病能力存在着很大差异，由发根农杆菌A4侵染的2～3周苗龄的人 参实生苗叶片在侵染的第16d，叶片的切口处有白色的颗粒组织出现，有一些出现在叶 片伤口褐化处，另一些出现于叶片膨大的愈伤组织上并不明显。随着时间的推移，白色 颗粒组织无规则的伸长生长，其尖端为浅黄白色冠帽，躯干部略有透明，一定长度后躯 干上出现细小的白色根毛。其接触培养基质后并不深入基质，而是贴附于基质表面继续 生长；当接触瓶壁时，则沿瓶壁向上继续生长。

(2)菌液浓度对人参发状根诱导率的影响：菌液浓度是影响人参发状根诱导率的 一个重要因素。因植物种类、外植体类型以及侵染时间的不同，要求发根农杆菌菌液浓 度也有差异，菌种浓度过大，细菌生长迅速，抑制细胞代谢过程外植体易出现褐化或损 伤，且不易除菌；浓度太稀，能附着在细胞的细菌太少，不足以形成足够的发状根，从 而影响诱导率。不同光密度的A4发根农杆菌悬浮液对预培养48h的人参实生苗的叶柄 进行侵染，诱导率的影响如表4所示。结果表明：光密度值为OD₆₀₀=0.6为最宜，诱导率 可达10.8％，比光密度值为0.4和0.8的诱导率分别高出4.8％和3.7％，发根农杆菌A4 菌液浓度对人参诱导率的影响图见附图2。

表4 发根农杆菌A4菌液浓度对人参诱导率的影响

(3)AS与侵染时间对人参发状根诱导率的影响：有研究表明激活Vir区基因表 达有关的植物细胞释放信号分子有9种，均为水溶性酚类化合物，其中，乙酰丁香酮和 羟基乙酰丁香酮作用最强，在诱导发状根时，可使用这些化合物处理以促进T-DNA向植 物细胞转移、加工和整合。由表5可知总体趋势上AS的添加对A4侵染人参实生苗的茎 段率有促进作用，提高了其转化效率，最高转化率达到10.7％，侵染时间在总体趋势上 20min为最优，说明浸染时间的选择对于侵染率也有很大影响，AS以及感染时间对人参 诱导率的影响图见附图3。

表5 AS以及感染时间对人参诱导率的影响

(4)不同外植体对人参发状根诱导率的影响：选择外植体为2～3周苗龄人参实生苗 的叶片、茎段、叶柄和人参芽孢、人参愈伤组织、1、2、3年生人参根。考察A4侵染人 参，外植体的选择对发状根诱导率的影响。表6中的结果表明：叶柄为最优外植体，诱 导率为9.0％，1年生人参根次之，诱导率为8.5％，而芽孢和愈伤并未获得发状根。转化 条件为预培养时间为48h，共培养48h，共培养培养基为MS加AS100μmol／L，OD₆₀₀=0.6， 叶片、茎段、叶柄、人参芽孢为叶盘法，浸染时间为30min，人参愈伤组织、人参1、2、 3年生根为滴加法。不同外植体对人参发状根诱导率的影响图见图4。

表6 不同外植体对人参发状根诱导率的影响

(5)预培养时间对人参发状根诱导率的影响：由表7可以看出在相同培养条件下不同 预培养时间条件对人参发状根的诱导率影响很大，预培养12～48h诱导率随时间的增加 而逐渐增加，这可能是由于预培养会使外植体伤口处边缘的细胞快速进入旺盛分裂期， 从而提高诱导率。超过48h诱导率开始下降。由此看出，预培养48h对于诱导人参发状 根为宜。预培养时间对人参诱导率的影响图见附图5。

表7 预培养时间对人参发状根诱导率的影响

(6)NAA浓度对人参发状根诱导率的影响：如表8和图6所示，在预培养培养基中添加 NAA有益于人参发状根的诱导，添加NAA组诱导率均高于未添加组，NAA2.0mg／L诱导率 达到7.0％为未添加NAA的2.33倍。

表8 NAA浓度对人参发状根诱导率的影响

(7)基质与共培养时间对人参发状根诱导率的影响：外植体与农杆菌共培养时间 与基质是影响发状根转化率的一个重要因素。外植体为实生苗的叶片，预培养培养基为 MS+NAA2.0mg／L时间为48h，菌种为A4，选择共培养时间为12h、24h、36、48h，共培 养培养基选为MS、1／2MS。如表9和图7所示，结果为共培养基质MS优于1／2MS，共培 养时间以48h为最宜。延长共培养时间可以增加转化几率，但是共培养时间过长，将使 菌大量繁殖增加后续除菌的困难且易致外植体死亡。

表9 共培养时间与基质对人参发状根诱导率的影响

(8)头孢霉素(Cef)浓度对抑菌和侵染的影响：采用叶盘法进行植物遗传转化时， Cef可以有效抑制农杆菌在植物体与培养基上的生长。从表10和图8可以看出：其浓度 在200～600mg／L范围内，浓度越大，抑菌效果越好，获得的发根数在3～25个之间。 综合抑菌效果、污染率、获得发根数三项指标，认为保持较好的抑菌效果和获得较多的 发根数的最优浓度应为500mg／L。

表10 不同Cef浓度对抑菌效果和获得发根数的影响

注：++为有大量农杆菌，+++为有少量农杆菌，++++为有极少量农杆菌

实施例2：人参发状根的鉴定

共培养后的材料用500mg／LCef水溶液冲洗3次，无菌滤纸吸干材料表面水份，接 种于含500mg／L头Cef的MS固体培养基上进行除菌培养。每7d更换一次除菌培养基， 4～5周后转接到不含任何抗生素的MS固体培养基上培养。

本实施例中的人参发状根最早在感染后的27d产生(Condition：OD₆₀₀=0.6， seedlings with stem explants，preconditioning time=48h，AS100μmol／L)。发状 根出现在创口处，一块外植体材料上可产生一条至几条发状根，而有的材料则先产生疏 松的愈伤组织，然后在愈伤组织上逐渐有发状根长出。所有产生的发状根均表现出生长 迅速、有白色根毛、分枝多、无需添加外缘激素，贴附于培养基表面或延瓶壁向上生长。 而未经菌液感染的对照材料则没有发状根产生，有的外植体虽两端稍有膨大，但在无激 素固体培养基上进一步培养过程中逐渐死亡。待发状根生长1cm以上时切下接于MS固 体培养基上培养。

(1)人参发状根的鉴定：取人参发状根100mg和未经侵染的人参实生苗叶片和1 年生人参根各200mg，按照前述方法，提取发状根和1年生人参根中的DNA，制备成检 测样品。同时提取Ri质粒和人参非转化叶片中的DNA，制备阳性对照与阴性对照样品。 将制备各种DNA于前述PCR反应条件下进行扩增反应。产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳 (5V／cm)后，凝胶成像系统下照相观察DNA条带并拍照。其结果如图9所示。从图9中 可以看出，根据设计的一对引物对人参发状根进行PCR检测，结果出现了预期的特异条 带(423bp)，而未转化的人参叶片和1年生人参根则没有扩增条带出现，证明tDNA已 经整合进人参发状根的基因组中。

(2)人参发状根液体培养条件下生长与皂苷含量的动态曲线：在液体培养条件下， 人参发状根的生长量与皂苷含量变化基本符合“S”型曲线(图10所示)。人参发状根在 从固体MS培养基中转接到液体培养基中会在转接的前几天进入一个短暂的延迟期，在 经过短时间的延迟期后，在第15d即进入对数生长期，一直到第35d达到生长率增长的 最高峰，在第35d后生长逐渐减缓、皂苷含量在第45d后有所下降。

(3)不同固体培养基对人参发状根生长量的影响：固体培养基MS、1／2MS、1／3MS、 1／4MS和1／10MS对人参发状根的生长量及总皂苷含量的影响(图11所示)。从图11中可 以看出固体MS培养基中30d增长倍数最高可达46.5倍，最小可达35倍，平均为35倍。 1／10MS最差平均为2.29倍。

实施例3：人参发状根愈伤组织的诱导

(1)不同生长调节物质对愈伤组织诱导的影响：采用L₉(3⁴)正交试验研究BA、KT 和2，4-D对人参发状根愈伤组织的诱导作用的影响力。因素水平见表11，每个实验的样 本数大于30，试验重复3次，采用评分法记录试验结果，3次试验的平均结果用SPSSV13.0 进行分析，见表12、表13。

表11 诱导愈伤组织试验因素水平设计

表12正交试验方案与试验结果

表13 方差分析

Dependent Variable：人参发状根愈伤诱导率

a R Squared＝.980(Adjusted R Squared=.919)

注：(P<0.01)代表极显著水平；(P<0.05)代表显著水平

由方差分析(表13)可知，对于发根愈伤组织的诱导，2，4-D的影响最大，KT次之， 都达到了显著水平。BA的影响较小，作用不明显。根据以上分析选取人参发状根愈伤组 织的最佳诱导培养基为：MS+2，4-D2.0mg／L+KT0.2mg／L。

(2)光照对愈伤组织的影响：人参参发状根愈伤组织，不论在光照或黑暗的条件 下都能发生，但光照对两者的生长均有明显的抑制作用。与光照条件下培养诱导产生的 愈伤组织相比，暗培养条件下的愈伤组织颜色较浅，淡黄或浅棕黄色。脱分化速度快， 25d左右几乎全部愈伤化，愈伤组织大量形成，生长迅速。而在强光下，其生长受到抑 制，40d时诱导率仍很低。从诱导率上来看，黑暗条件下最高，强光下最低，弱光下介 于两者之间，为80％左右；从生长量来说，黑暗条件下生长较光照时生长速度快。见表 14和图12。愈伤组织进行继代的最初2个月中，脱分化不完全依然有发状根产生，对 愈伤组织的生长不利，且细胞分裂素浓度越低发状根数量越多，随着继代时间的增长、 转移代数的增多，不完全脱分化数量越少。

表14 光照对培养物的影响

实施例4：人参发状根的器官发生

(1)植物激素种类和浓度对不定芽的影响：不同生长调节物质对芽的影响见表15， 从中表明，经继代培养在不同浓度的KT培养基里，其增殖率和分化率正好相反；当KT 达到2.0mg／L时，分化率较高为20％左右，但生长率较低；KT为1.0mg／L时，其结果正 相反。由结果选取3号组合为人参发状根愈伤组织不定芽诱导与生长基质。

表15 不同生长调节物质对芽的影响

(2)光照对不定芽分化增殖的影响：如表16和图13、图14所示，在黑暗和光照 条件下，人参不定芽都有分化。对于不定芽的分化系数而言在交替光照时，人参发状根 比黑暗及光照时高，而当不定芽增殖时在光照条件下，其增殖系数比交替光照时要高， 表明光照条件有益于发状根愈伤组织不定芽的生长。

表16 光照对不定芽分化增殖的影响

(3)不同激素配比对生根的影响：将生长到3～4cm的健壮的无菌苗分割成单株， 接种到添加不同激素的不含硝酸铵的1／2MS+GA35.0mg／L的培养基里诱导生根。由表17 可以看出IBA0.5mg／L比IBA1.0mg／L生根效果好，NAA1.0mg／L比NAA2.0mg／L生根效 果好。

2个月后，在苗基部便可长出多条肉质根，待形成完整植株后，打开封口膜，在室 温下炼苗2～3d，将小苗从瓶中取出，洗净根部培养基，在滤纸上吸干水分，再移入装 有消毒过的基质(珍珠岩：蛭石：砂土=1：1：1)的花盆中，前几次用1.0mg／L NAA营 养液浇灌，之后定期浇水，用塑料布罩住以保持一定湿度，几天后摘掉，即可移栽。

表17 不同基质对生根的影响

实施例5：发状根再生植株途径中生理生化特性的研究

植物体再生植株是一个复杂的过程。细胞的生理生化变化是组织形态变化的基础。 植物体再生植株发生的本质是控制细胞基因按时空顺次表达的结果，蛋白质、糖、淀粉 和酶都是基因表达的产物。因此，细胞的生理生化指标也呈现有规律的变化，可直接反 映细胞的基因活动。植物体细胞中的酶与物质和能量代谢密切相关，同时又参与细胞的 分裂和分化，其活性的改变可影响植物形态发生。

(1)可溶性蛋白含量：由图15可以看出发状根器官发生再生植株个时期蛋白的变 化，由发状根到愈伤再到有芽产生的愈伤组织，蛋白含量逐渐降低。人参组的蛋白变化 十分平缓。

(2)可溶性多糖含量：由图16可以看出人参糖含量的变化与蛋白近似，基本为 缓步下降。蛋白的含量在人参发状根阶段逐渐升高，进入愈伤为先升后降，在芽产生的 阶段持续降低。

(3)可溶性淀粉含量：淀粉是植物细胞最普遍的能量贮藏物质，淀粉含量的多少 可以作为细胞分化的一个标志，其消长与细胞分裂、组织分化和器官形成具有密切关系。 在植物细胞发育过程中，淀粉作为发育信号而大量被利用淀粉含量的变化趋势同多糖， 在胚性愈伤组织时期含量较高，淀粉积累可能是细胞进一步分化的必要前提。从图17 可以看出，淀粉含量的变化基本与糖的变化相同。

(4)过氧化物酶活性测定：由图18可知在人参组变化趋势相同，经发状根到愈伤 再到芽过氧化物酶的活力逐渐降低。人参发根初期的酶活力是愈伤晚期的3.4倍。

(5)过氧化氢酶活性测定：由图19可知人参组先升后降，其酶活力最高的愈伤阶 段分别是发状根的2.06倍、芽的2.79倍。

(6)多酚氧化酶：由图20可以看出在人参组不同阶段多酚氧化酶的变化均呈现S 曲线形，其变化趋势同为发根阶段下降，愈伤阶段上升，芽时又明显下降。其酶活力最 高与最低的比值为3.78倍。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视 为本发明的保护范围。