一种短肽、载铜纳米生物材料及在制备治疗下肢缺血性疾病的药物中的应用

摘要

一种自组装短肽，它的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所述。一种载铜纳米生物材料，为RP自组装短肽、RAD16-II自组装短肽、CuSO4和灭菌去离子水配制成的混合溶液所形成的凝胶状物质，所述混合溶液中，RP自组装短肽的浓度为0.1mM～4mM，RAD16-II自组装短肽的浓度为2mM～8mM、CuSO4的浓度为10μM～100μM，所述RP自组装短肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所述，所述RAD16-II自组装短肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所述。实验表明，所述载铜纳米生物材料可在制备治疗下肢缺血性疾病的药物中应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物材料领域，特别涉及自组装短肽、含自组装短肽的载 铜纳米生物材料及其在制备治疗下肢缺血性疾病的药物中的应用。

背景技术

自组装短肽是一种新型的纳米生物材料，自20世纪90年代问世以来， 受到了人们的广泛重视，得到了快速的发展，并在细胞三维培养及制 备疏水药物载体、止血药物、烧伤治疗药物、抑菌药物、白血病治疗 或预防药物等方面应用。但是，制备出更多的自组装短肽、扩大自组 装短肽的应用范围仍然是科技工作者关注的问题。

下肢缺血性疾病是一种世界范围内常见的下肢动脉慢性狭窄或闭塞导 致的外周血管病，下肢缺血性疾病主要包括下肢动脉硬化闭塞症(ASO )、血栓闭塞性脉管炎(TAO)和糖尿病动脉硬化闭塞症(DAO)。下肢缺血 性疾病往往由于病侧主要动脉严重闭塞，造成远端供血障碍，其最终 结局往往是截肢甚至死亡。下肢缺血性疾病发病率都在逐年急速上升 。据统计，在西方国家最新的重度下肢缺血(Critical limb ische mia, CLI)的发病率为500-1000/百万人/年，在美国每年病例数量为 150000-300000。CLI第一年的死亡率和发病率超过了恶性肿瘤，死亡 率为25%，截肢率为30%。在我国，现有下肢缺血病人2000万以上，年 增长高达60万。近年来，随着引起血管疾病危险因素的增多，如高血 脂、高血压、糖尿病等疾病发病人数的急速增加以及老龄化时代的到 来，下肢缺血性疾病已逐渐凸显出严重的危害程度和发病率逐年增高 的趋势，面对如此严峻形势，如何减少患者的致残率、挽救已濒于截 肢的病人肢体，是医疗领域急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种自组装短肽和含自组装短肽的载铜纳米生 物材料，本发明的再一目的是证明载铜纳米生物材料能使病变组织器 官的血管新生，以便开发出一类治疗下肢缺血性疾病的新型药物。

本发明所述自组装短肽，命名为RP，其氨基酸序列为序列表中SEQ I D NO：1所述，其理论分子量为3066.15道尔顿。本发明所述载铜纳米 生物材料，为上述RP自组装短肽、RAD16-II自组装短肽、CuSO₄和灭菌 去离子水配制成的混合溶液所形成的凝胶状物质，所述混合溶液中， RP自组装短肽的浓度为0.1mM～4mM，RAD16-II自组装短肽的浓度为2m M～~8mM、CuSO₄的浓度为10μM～100μM，所述RAD16-II自组装短肽已 公开 [见Shuguang Zhang. Designer self-assembling peptid e nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures. S eminars in Cancer  Biology 15 (2005) 413–420] ，其氨基酸序列为序列表中SEQ  ID NO：2所述。本发明所述载铜纳米生物材料，其制备方法如下：

（1）去离子水的灭菌处理

将去离子水在蒸汽压103.4kPa、温度121.3℃下处理至少30分钟，然后 冷却至室温；

（2）原料溶液的配制

在室温、常压下将CuSO₄用步骤（1）灭菌处理的去离子水配制成CuSO ₄溶液，然后在超净台的无菌环境中将CuSO₄溶液用0.22μm的一次性滤 器过滤除菌，所述CuSO₄溶液中，CuSO₄的浓度是上述形成凝胶状物质 的混合液中的CuSO₄浓度的2倍~4倍；

在超净台的无菌环境中于室温、常压下将RP自组装短肽用步骤（1）灭 菌处理的去离子水配制成RP自组装短肽溶液，所述RP自组装短肽的氨 基酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所述，所述RP自组装短肽溶液中 ，RP自组装短肽的浓度是上述形成凝胶状物质的混合液中的RP自组装 短肽浓度的2倍~4倍；

在超净台的无菌环境中于室温、常压下将RAD16-II自组装短肽用步骤 （1）灭菌处理的去离子水配制成RAD16-II自组装短肽溶液，所述RAD 16-II自组装短肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所述，所述 RAD16-II自组装短肽溶液中，RAD16-II自组装短肽的浓度是上述形成 凝胶状物质的混合液中的RAD16-II自组装短肽浓度的2倍~4倍；

（3）混合液的配制

所述混合液由步骤（2）配制的CuSO₄溶液、RP自组装短肽溶液和RAD1 6-II自组装短肽溶液组成，CuSO₄溶液的量按混合液中CuSO₄的浓度为 10μM～100μM计量，RP自组装短肽溶液的量按混合液中RP自组装短肽 的浓度为0.1mM～4mM计量，RAD16-II自组装短肽溶液的量按混合液中 RAD16-II自组装短肽的浓度为2mM～8mM计量，在超净台的无菌环境中 于室温、常压下将计量好的CuSO₄溶液、RP自组装短肽溶液和RAD16-I I自组装短肽溶液加入反应容器中，并混合均匀；

（4）成胶

将步骤（3）所配制的混合液在室温、常压下超声反应20 min ~40m in，然后在常压、4℃的环境中放置12小时~24小时，即形成的凝胶状 的载铜纳米生物材料。

上述方法中，超声反应的超声功率为160W ~200W。

动物实验表明，用本发明所述载铜纳米生物材料对下肢缺血动物模型 干预治疗，可使缺血下肢的血管新生，从根本上改善缺血下肢的血供 ，显著减少了缺血下肢的局部坏疽（见实施例5、实施例6）。

本发明所述载铜纳米生物材料可以通过添加药学上可接受的载体或赋 形剂，制成适于临床使用的治疗下肢缺血性疾病的药物。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了一种新型自组装短肽，增加了自组装短肽的种类。

2、实验表明，本发明所述载铜纳米生物材料可促进缺血下肢的血管新 生，从根本上改善缺血下肢的血供，显著减少缺血下肢的局部坏疽， 对下肢缺血动物模型取得了显著的治疗效果。

3、本发明所述载铜纳米生物材料是通过对缺血下肢进行肌肉局部注射 的方式进行治疗，较之搭桥、介入等手术方式治疗，操作更加简单， 易于推广。

4、本发明可为下肢缺血疾病的治疗提供一种有效的新药品，具有明显 的社会效益和经济效益。

附图说明

图1 是本发明所述方法制备的自组装短肽RP纯化后的高效液相色谱图 （HPLC）；

图2是本发明所述自组装短肽RP的质谱图；

图3是实施例2所制备的RAD16-II自组装短肽纯化后的高效液相色谱图 （HPLC）；

图4是实施例2所制备的RAD16-II自组装短肽的质谱图；

图5 是原子力显微镜（AFM）图，图中，Cu-NM代表本发明所述载铜纳 米生物材料；

图6是实验小鼠的缺血下肢病理评分照片

图7是实验小鼠的缺血下肢病理评分图，图中，Cu-NM代表本发明所述 载铜纳米生物材料；

图8是实验小鼠的缺血下肢治疗后第28天的血流灌注量测定照片，图中 ，Cu-NM代表本发明所述载铜纳米生物材料；

图9是实验小鼠的缺血下肢治疗后第28天的血流灌注量测定图，图中， Cu-NM代表本发明所述载铜纳米生物材料，**, 表示Cu-NM治疗组与对 照组（Control组）具有显著性差异 (P <0.01)。

具体实施方式

实施例1：自组装短肽RP的合成

1、材料及设备

1.1 试剂

芴甲氧羰基(Fmoc) – 氨基酸为美国SIAM公司产品； PyBOP、Boc -His-Merrifield resin树脂 、六氢吡啶、二甲基吡啶为Merck公司 产品；二甲基甲酰胺(DMF)为日本三星公司产品（使用前先经茚三酮浸 泡和3?分子筛脱水，并测定无游离氨基）；二氯甲烷(DCM) ，为中 国医药（集团）上海化学试剂公司产品(使用前用无水碳酸钾浸泡处理 ）；三氟乙酸(TFA)为GEEL BELGIUM公司产品；甲醇为上海振兴化工 一厂产品；HPLC甲醇为Merck公司产品；四氢呋喃为上海化学试剂站中 心化工厂产品。

1.2 仪器

431A型多肽合成仪为Applied biosystems 产品,高效液相色谱仪为 安捷伦1100色谱仪，制备色谱仪为WATERS600E；冷冻干燥机（FREEZE  DRYER 18)为LABCONCO产品; 质谱仪为Finnigan LCQ。

2、制备方法

2.1 肽链的合成：

肽链的合成采用Fmoc/PyBOP方法。Fmoc保护基团的脱除用30%六氢吡啶 的DMF溶液；肽链从树脂上的切落用切肽试剂（三氟乙酸/结晶苯酚/水 /乙二硫醇/甲乙硫醚=81.5/5/5/2.5/1）。

接肽前树脂处理：

① 称取100毫克Boc- His -Merrifield resin到砂芯过滤反应器 中；

② 加入二氯甲烷浸泡洗涤6次，每次5毫升，过滤除去洗涤的二氯甲 烷；

③ 加入10%的TFA（二氯甲烷作溶剂）5毫升，室温反应2小时，以除 去树脂上氨基酸N端的BOC保护基；

④加入二氯甲烷浸泡洗涤3次，每次5毫升，然后加入5% 的三乙胺（ 二氯甲烷作溶剂）5毫升，2次中和PH值后再用二氯甲烷洗涤6次，DMF 洗涤5次即可放入仪器反应器中进行接肽反应。

接肽在431 A多肽合成仪上进行，称取100mg His -Merrifield r esin放入反应器中， 然后按下列量在合成仪中依次加入各种Fmoc-氨 基酸（反应过程中加入的FMOC- 氨基酸并不是一次全部加入反应容器 ，而是按照多肽的序列顺序从C端逐渐加入，每一个氨基酸反应周期时 间为40分钟，在加入氨基酸的同时要加入相同摩尔的PYBOP试剂和HOB T试剂）

以下是序列中需要加入氨基酸的量：

每步接肽反应加入

PyBOP  Mwt:  520.30  (x1.00eq)  1560.9 [mg/coupling ]

HOBt+H2O(1) Mwt: 153.10 (x1.00eq)  6000.0[micro-L/coupl ing]

0.50[mmol/mL DMF]

NMM(1)  109.95[mL/mol]  (x1.50eq)  324.0[micro-L/coupl ing]

1.00[mmol/mL DMF]

脱帽反应加入

六氢吡啶  30%       9000 x 2[micro-L/coupling]

洗涤时用

DMF ( DEBLOCK )    9000 x 5[micro-L/coupling]

DMF ( EXCESS AA )   9000 x 5[micro-L/coupling]

合成仪的第一步反应是用DMF浸泡反应容器中的树脂（即本条多肽Phe -Merrifield resin），浸泡洗涤5遍后加入第一个氨基酸Fmoc-Phe- OH、PyBop、HOBT、NMM，反应20分钟后，经DMF洗涤5遍，然后加入配 制好的六氢吡啶，此步用来脱除树脂上的FMOC保护基团，大约10分钟 ，在脱除FMOC后，用DMF 或二氯甲烷洗涤树脂6-9次，把六氢吡啶清 洗干净，以确保下一步反应的顺利进行（六氢吡啶显强碱性，不利于 接肽反应）；

第二步，加入反应的第二个氨基酸Fmoc- Gly -OH和PYBOP 、相同 摩尔的NMM试剂和HOBT试剂，然后一起加入到已经脱掉FMOC基团的Gly  - Merrifield resin中，反应20分钟后继续第一步，清洗掉多余 的氨基酸试剂，然后加入六氢吡啶脱除保护基，进行18步循环后即可 完成多肽的接肽反应，随着循环系数的增加而改变氨基酸的种类，其 它试剂（PYBOP 、 NMM试剂和HOBT试剂）的量保持不变。

接完多肽的树脂经过甲醇清洗后干燥。然后全部转移至玻璃茄形瓶中 ，加入60毫升无水甲醇并冰浴到-20度时缓慢的通入氨气，使其温度保 持在0度以下，通入氨气时间为90分钟，然后密封振摇24小时取出，过 滤收其滤液并浓缩抽干（这一步是将多肽从树脂上切下并酰胺化）， 再加入事先配好并预冷的切肽试剂5ml（81.5%TFA5%thioanisole5%ph enol5%water2.5%EDT1%TIS）。25℃下搅拌反应3小时。取出过滤，收 集滤液；树脂用少量三氟乙酸洗3次，将洗涤液与滤液合并，浓缩后冷 却，然后加入5 ml冷乙醚使多肽沉淀，离心收集沉淀，真空干燥。得 粗品约170mg。

2.2 肽链的纯化：

先采用高效液相色谱仪（安捷伦1100）分析系统确定目标肽，使用C1 8反相柱子，条件为：A相为95%的水（甲醇配比），B相为95%的甲醇（ 甲醇配比），然后各加0.1 %的TFA ，常规条件：在上样品之前先用 A相平衡柱子15分钟，然后上样，从A相到B相为25分钟梯度。检测波长 ：220nm，流速:1mL/min，先用A溶液平衡柱子，上样后，从A到B溶液 梯度洗脱25min，收集目标肽，然后做质谱鉴定。再根据目标多肽的出 峰时间来确定本条多肽的最佳洗脱梯度。

确定目标肽后，采用Waters600E纯化系统进行多肽制备：使用C18反相 制备柱子，条件为：A相为95%的水（乙腈配比），B相为95%的甲醇（ 乙腈配比），然后各加0.1 %的TFA ，常规条件：从A相到B相为70分 钟梯度。检测波长：220nm,流速：36mL/min，先用A溶液 平衡柱子，上样后，从A到B溶液梯度洗脱，收集多肽洗脱峰，与分析 仪器配合确定样品的目标峰，然后冻干，得到纯度>95%的纯化自组装 短肽（见图1）。

2.3 质谱分析鉴定

质谱分析鉴定的实验过程：将冻干的纯化自组装短肽经过80%的甲醇溶 解，高速离心，取上清溶液进行质谱检测，检测结果见图2，根据图2 可确定其分子量为3066.0 道尔顿(理论分子量为3066.15道尔顿)，表 明所合成的短肽确为本发明所述RP自组装短肽。

实施例2：RAD16-II短肽的合成

1. 材料及设备

1.1 试剂

芴甲氧羰基(Fmoc) – 氨基酸为美国SIAM公司产品； PyBOP、Boc -His-Merrifield resin树脂 、六氢吡啶、二甲基吡啶为Merck公司 产品；二甲基甲酰胺(DMF)为日本三星公司产品（使用前先经茚三酮浸 泡和3?分子筛脱水，并测定无游离氨基）；二氯甲烷(DCM) ，为中 国医药（集团）上海化学试剂公司产品,(使用前用无水碳酸钾浸泡处 理）；三氟乙酸(TFA)为GEEL BELGIUM公司产品；甲醇为上海振兴化 工一厂产品；HPLC甲醇为Merck公司产品；四氢呋喃为上海化学试剂站 中心化工厂产品。

1.2 仪器

431A型多肽合成仪为Applied biosystems 产品,高效液相色谱仪为 安捷伦1100色谱仪，制备色谱仪为WATERS600E；冷冻干燥机（FREEZE  DRYER 18)为LABCONCO产品; 质谱仪为Finnigan LCQ。

2. 制备方法

2.1 肽链的合成：

肽链的合成采用Fmoc/PyBOP方法。Fmoc保护基团的脱除用30%六氢吡啶 的DMF溶液；肽链从树脂上的切落用切肽试剂（三氟乙酸/结晶苯酚/水 /乙二硫醇/甲乙硫醚=81.5/5/5/2.5/1）。

接肽前树脂处理：

① 称取2000毫克Boc- Ala -Merrifield resin到砂芯过滤反应器 中；

② 加入二氯甲烷浸泡洗涤6次，每次60毫升，过滤除去洗涤的二氯甲 烷；

③ 加入10%的TFA（二氯甲烷作溶剂）60毫升，室温反应2小时，以除 去树脂上氨基酸N端的BOC保护基；

④加入二氯甲烷浸泡洗涤3次，每次5毫升，然后加入5% 的三乙胺（ 二氯甲烷作溶剂）60毫升，2次中和PH值后再用二氯甲烷洗涤6次，DM F洗涤5次即可放入仪器反应器中进行接肽反应。

接肽在431 A多肽合成仪上进行，称取100mg Ala -Merrifield r esin放入反应器中， 然后 按下列量在合成仪中依次加入各种Fmoc-氨基酸（反应过程中加入的F MOC- 氨基酸并不是一次全部加入反应容器，而是按照多肽的序列顺 序从C端逐渐加入，每一个氨基酸反应周期时间为40分钟，在加入氨基 酸的同时要加入相同摩尔的PYBOP试剂和HOBT试剂）

以下是序列中需要加入氨基酸的量：

肽反应加入

PyBOP  Mwt:  520.30  (x1.00eq)  3122 [mg/coupling]

HOBt+H2O(1) Mwt: 153.10 (x1.00eq) 1200 [micro-L/couplin g]

0.50[mmol/mL DMF]

NMM(1) 109.95[mL/mol] (x1.50eq) 900 [micro-L/coupling]

1.00[mmol/mL DMF]

脱帽反应加入

六氢吡啶   30%      9000 x 2[micro-L/coupling]

洗涤时用

DMF ( DEBLOCK )     9000 x 5[micro-L/coupling]

DMF ( EXCESS AA )    9000 x 5[micro-L/coupling]

合成仪的第一步反应是用DMF浸泡反应容器中的树脂（即本条多肽Phe -Merrifield resin），浸泡洗涤5遍后加入第一个氨基酸Fmoc-Asp( OtBu)-OH、PyBop、HOBT、NMM，反应20分钟后，经DMF洗涤5遍，然后 加入配制好的六氢吡啶，此步用来脱除树脂上的FMOC保护基团，大约 10分钟，在脱除FMOC后，用DMF 或二氯甲烷洗涤树脂6-9次，把六氢 吡啶清洗干净，以确保下一步反应的顺利进行（六氢吡啶显强碱性， 不利于接肽反应）；

第二步，加入反应的第二个氨基酸Fmoc-Ala-OH和PYBOP 、相同摩尔 的NMM试剂和HOBT试剂，然后一起加入到已经脱掉FMOC基团的Gly -  Merrifield resin中，反应20分钟后继续第一步，清洗掉多余的氨基 酸试剂，然后加入六氢吡啶脱除保护基，进行18步循环后即可完成多 肽的接肽反应，随着循环系数的增加而改变氨基酸的种类，其它试剂 （PYBOP 、 NMM试剂和HOBT试剂）的量保持不变。

接完多肽的树脂经过甲醇清洗后干燥。然后全部转移至玻璃茄形瓶中 ，加入60毫升无水甲醇并冰浴到-20度时缓慢的通入氨气，使其温度保 持在0度以下，通入氨气时间为90分钟，然后密封振摇24小时取出，过 滤收其滤液并浓缩抽干（这一步是将多肽从树脂上切下并酰胺化）， 再加入事先配好并预冷的切肽试剂5ml（81.5%TFA5%thioanisole5%ph enol5%water2.5%EDT1%TIS）。25℃下搅拌反应3小时。取出过滤，收 集滤液；树脂用少量三氟乙酸洗3次，将洗涤液与滤液合并，浓缩后冷 却，然后加入60ml冷乙醚使多肽沉淀，离心收集沉淀，真空干燥。得 粗品约1900mg。

2.2 肽链的纯化：

先采用高效液相色谱仪（安捷伦1100）分析系统确定目标肽，使用C1 8反相柱子，条件为：A相为95%的水（甲醇配比），B相为95%的甲醇（ 甲醇配比），然后各加0.1 %的TFA ，常规条件：在上样品之前先用 A相平衡柱子15分钟，然后上样，从A相到B相为25分钟梯度。检测波长 ：220nm，流速:1mL/min，先用A溶液平衡柱子，上样后，从A到B溶液 梯度洗脱25min，收集目标肽，然后做质谱鉴定。再根据目标多肽的出 峰时间来确定本条多肽的最佳洗脱梯度。

确定目标肽后，采用Waters600E纯化系统进行多肽制备：使用C18反相 制备柱子，条件为：A相为95%的水（乙腈配比），B相为95%的甲醇（ 乙腈配比），然后各加0.1 %的TFA ，常规条件：从A相到B相为70分 钟梯度。检测波长：220nm,流速：36mL/min，先用A溶液平衡柱子，上 样后，从A到B溶液梯度洗脱，收集多肽洗脱峰，与分析仪器配合确定 样品的 目标峰，然后冻干，得到纯度>95%的纯化自组装短肽（见图3）。

2.3  质谱分析鉴定

质谱分析鉴定的实验过程：将冻干的纯化自组装短肽经过80%的甲醇溶 解，高速离心，取上清溶液进行质谱检测，检测结果见图4，根据图4 可确定其分子量为1712.9道尔顿(理论分子量为1712.77道尔顿)，表明 所合成短肽确为所设计的自组装短肽。

实施例3：载铜纳米生物材料的制备

1.  试剂与设备

1.1 试剂：实施例1制备的RP自组装短肽、实施例2制备的RAD16-II自 组装短肽；CuSO₄为分析纯；去离子水（18 MΩ）。

1.2 仪器：超净台；超声仪；4℃冰箱。

2、制备方法

（1）去离子水的灭菌处理

在纯水系统（Millipore Milli-Q system）中接取500 ml去离子水 （18 MΩ），采用高压灭菌法的标准流程进行灭菌，即将去离子水在 蒸汽压103.4kPa、温度121.3℃下处理30分钟，然后将灭菌去离子水在 4℃冰箱内密封保存备用；

（2）准备CuSO₄无菌贮备液

在室温、常压下将CuSO₄用步骤（1）灭菌处理的去离子水配制成浓度 为40 mM的CuSO₄溶液，然后在超净台的无菌环境中将CuSO₄溶液用0. 22μm的一次性滤器过滤除菌，并将除菌后的CuSO₄溶液在4℃冰箱内密 封保存备用；

（3）原料溶液的配制

在超净台的无菌环境中于室温、常压下将实施例1制备的RP自组装短肽 用步骤（1）灭菌处理的去离子水配制成浓度为8mM的溶液；

在超净台的无菌环境中于室温、常压下将实施例2制备的RAD16-II自组 装短肽用步骤（1）灭菌处理的去离子水配制成浓度为12mM的溶液；

在超净台的无菌环境中将步骤（2）准备的浓度为40mM CuSO₄无菌贮 备液用无菌去离子水稀释为浓度为320μM的CuSO₄溶液；

（4）混合液的配制

所述混合液由步骤（3）配制的CuSO₄溶液、RP自组装短肽溶液和RAD1 6-II自组装短肽溶液组成，CuSO₄溶液的量按混合液中CuSO₄的浓度为 80μM计量，RP自组装短肽溶液的量按混合液中RP自组装短肽的浓度为 2mM计量，RAD16-II自组装短肽溶液的量按按混合液中RAD16-II自组装 短肽的浓度为6mM计量，

在超净台的无菌环境中于室温、常压下将计量好的CuSO₄溶液、RP自组 装短肽溶液和 RAD16-II自组装短肽溶液加入反应容器中，并混合均匀；

（5）成胶

将步骤（4）所配制的混合液在室温、常压下超声20min，超声功率16 0W，然后在常压、4℃的环境中放置12小时，即形成的凝胶状的载铜纳 米生物材料。

实施例4：原子力显微镜检测载铜纳米生物材料的纳米结构

1. 材料与方法

1.1 实验材料：

实施例3制备的载铜纳米生物材料；CuSO₄溶液（浓度为80μM ）；去 离子水：18 MΩ; Millipore Milli-Q system。

1.2 主要实验仪器：

原子力显微镜 AFM（SPA400, SII Nanotechnology，Inc.）

1.3 实验方法

（1）实施例3制备的载铜纳米生物材料为凝胶状，为便于用原子力显 微镜AFM进行表征，需要将载铜纳米生物材料进行稀释，本实施例用去 离子水（18 MΩ）将载铜纳米生物材料稀释60倍，作为对照，80μM  CuSO₄溶液也同样采用去离子水（18 MΩ）稀释60倍。

（2）分别将5μl载铜纳米生物材料溶液均匀的涂于新剥光的各云母片 表面，涂片完成后约30s，以1000μl 去离子水冲洗除去未附着物；

分别将5μl CuSO₄溶液均匀的涂于新剥光的各云母片表面，涂片完成 后约30s，以1000μl 去离子水冲洗除去未附着物。

（3）将上述载铜纳米生物材料溶液和CuSO₄溶液的涂片在室温中空气 干燥。

（4）在气相中对步骤（3）干燥后的云母片进行AFM扫描，用SPI4000 的记录模式收集AFM图像。使用20μm扫描器（400）、Olympus Si-D F20 微悬臂，及弹簧常量为12.00N/m的针（Si，半径10nm，矩形基底 200.00um）。悬臂的自由共振频率为127.00kHz。相位图以512×512像 素的解析度记录。为显示自组装短肽的细微纳米结构，对样本采用5× 5 μm²、2×2 μm²的范围进行扫描。

原子力显微镜 (AFM) 观察结果显示，与CuSO₄溶液相比较，载铜纳 米生物材料样品形成致密的纳米纤维网状结构（见图5），此结果验证 载铜纳米生物材料分子具有分子自组装能力，而且其自组装能力没有 受到Cu²⁺的阻碍，即在Cu²⁺存在的情况下，上述样品仍然保持了自组装 形成纳米纤维，进而形成致密的纳米纤维网状结构，此结构为载铜纳 米生物材料在体内发挥缓释铜离子的功能奠定了材料结构的基础。

实施例5：下肢缺血动物模型的构建

1. 材料与仪器

1.1 实验材料

动物：12周龄的BALB/c雄性BALB/C小鼠，平均体重约为20余克， 购 自成都达硕生物科技有限公司。标准饲料及其他与动物接触的物品均 经高压灭菌处理。

主要试剂：体积百分比75%的乙醇、质量/体积百分比10%的水合氯醛、 青霉素（160U/mL）、碘伏。

器材：3-0手术缝合线、5-0手术缝合线、手术缝合针、眼科剪、1mL一 次性注射器、乳胶手套、脱毛器、脱毛膏、棉签、医用胶布、体式显 微镜、直型显微镊、弯型显微镊、显微剪刀、显微持针钳等。

1.2 主要实验仪器

激光多普勒血流监测仪 （Moor instruments）

2.  实验方法

（1）腹腔注射0.1mL质量/体积百分比10%的水合氯醛麻醉小鼠，使用 脱毛器和脱毛膏去除小鼠右下肢内侧鼠毛，洗去残留的脱毛膏，并在 手术区域涂上碘伏。

（2）从小鼠腹股沟皱褶中部沿股动脉向大腿剪开0.5cm 左右皮肤， 暴露股动脉、股静脉和股神经。

（3）在体式显微镜下分离股动脉，使用5-0手术线分别结扎股动脉近 心端、股深动脉分支的远心端和股深动脉，并剪断股深动脉。

（4）使用3-0手术线缝合皮肤。术后注射0.1mL青霉素。

（5）术后第三天采用激光多普勒血流监测仪测定分析下肢血流灌注量 ，选择血流灌注比值（缺血肢/正常肢）在50%以下作为合格的动物模 型；此外，再通过缺血肢病理观察，筛选出指尖发黑坏死的小鼠作为 合格的动物模型，用于后续实验。

实施例6：载铜纳米生物材料对下肢缺血动物模型的治疗

1. 材料与仪器

1.1 实验材料

实施例3所制备的载铜纳米生物材料。

1.2 主要实验仪器

激光多普勒血流监测仪（Moor instruments）。

2. 实验方法

（1）采用“实施例5”构建的小鼠下肢缺血动物模型；

（2） 将筛选出的小鼠模型随机分成2组，每组10只，分别为手术后 未治疗对照组（Control组）、手术后采用载铜纳米生物材料治疗组（ Cu-NM组）。

（4）在术后第三天，在Cu-NM组的小鼠缺血下肢（右肢）内收肌的两 个位点各注射25 μl 载铜纳米生物材料, 此后每两天注射一次， 每次注射条件与第一次相同，共计注射三次。

（5）在治疗后第7天、第28天，对小鼠缺血下肢进行病理评分，针对 缺血下肢的组织病变程度，具体评分标准如下：0=没有变化，1=指尖 坏死或脱落，2=脚坏死或脱落，3=膝部坏死或脱落，4=下肢全部坏死 或脱落。

3、实验结果

（1）未治疗对照组（Control组）和采用载铜纳米生物材料治疗组（ Cu-NM组）治疗后第28天缺血下肢的病理评分见图6、图7。

（2）未治疗组（Control组）和采用载铜纳米生物材料治疗组（Cu-N M组）治疗后第28天缺血下肢的血流灌注量测定见图8、图9。

实验结果显示，采用本发明所述载铜纳米生物材料干预治疗，从治疗 后第7天开始即显著减弱了缺血下肢的坏死程度，在治疗后第28天，C u-NM组较Control组显著减弱了小鼠缺血下肢的坏死或脱落；与病理评 分相一致，治疗后第28天，利用激光多普勒血流检测仪测定Control组 、Cu-NM组的血流灌注量，可观察到Cu-NM组较Control组的缺血下肢血 流灌注量有显著改善，显著性差异 (P <0.01)。