一种干酪乳杆菌中肌醇代谢基因簇的快速定性检测方法

摘要

本发明涉及一种干酪乳杆菌中肌醇代谢基因簇的快速定性检测方法，所述检测方法应用基于聚合酶链式反应技术（PCR），通过对干酪乳杆菌肌醇代谢基因簇侧翼保守区域的扩增和凝胶电泳图谱的分析来确定该代谢途径的有无，从而能够在一个工作日内快速完成对干酪乳杆菌中肌醇代谢基因簇分布规律的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别是干酪乳杆菌中肌醇代谢基因簇的快速定性检测。所述检测方法运用基于聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）技术对干酪乳杆菌群中肌醇代谢基因簇进行快速、定性检测。检测工作可在一个工作日内完成。 

背景技术

酸马奶是以新鲜马奶为原料，经乳酸菌和酵母菌等微生物共同自然发酵形成的酸性、低酒精含量的乳饮料。制作和饮用酸马奶盛行于我国的内蒙古、新疆等地区的蒙古族、维吾尔族、哈萨克族等游牧民族中。肌醇是酸马奶的重要组成成分之一，属于B族维生素类营养元素。对人体来讲，它是肝脏、骨髓生长的必须物质；对脂肪有亲和性，可促进机体产生卵磷脂，降胆固醇，抑制癌细胞生长，抗氧化，保护心肌细胞等。作为酸马奶中的“生物活素”，肌醇一方面是酵母的代谢中间产物，另一方面又可作为乳酸菌特别是干酪乳杆菌生长繁殖的重要碳源。在这种情况下，了解和掌握酸马奶中乳酸菌代谢肌醇的能力对其品质的控制就显得尤为重要。 

传统方法中，对不同乳酸菌肌醇代谢能力的定性检测仍然采用基于生理生化反应的方法。这种方法易受培养条件、菌种特性等因素影响，检测效率有限，而且受外界环境因素和培养基性能的影响大，检测结果缺乏稳定性和可靠性，且耗时耗力。PCR技术一经出现就被广泛应用于分子生物学和微生物学领域，避免了传统生化方法鉴定中交叉污染的问题。具有特异性强、重复性好、准确、快速等优点，逐渐成为分子生物学和微生物学领域定性检测的重要方法。 

综上所述，采用基于乳杆菌属特异性引物的PCR技术，建立简便、快速、准确的酸马奶中干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）肌醇代谢基因簇的定性测定方法，可以简化肌醇代谢能力的检测程序、提高检测效率。本发明针对干酪乳杆菌群中编码的肌醇代谢基因簇，依据参考文献自行设计了一种基于PCR技术的快速、定性检测方法，通过对电泳图谱的分析来确定干酪乳杆菌中肌醇代谢基因簇的分布 规律。这一方法的建立无疑将有助于传统酸马奶加工工艺的改进，也可为我国传统发酵乳制品中乳酸菌重要代谢途径的研究和开发利用奠定基础。 

发明内容

本发明应用聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）技术，通过对酸马奶源干酪乳杆菌肌醇代谢基因簇侧翼保守区域的扩增和对凝胶电泳图谱的分析来确定肌醇代谢基因簇的有无，从而完成对干酪乳杆菌群中肌醇代谢基因簇分布规律的检测。 

所述干酪乳杆菌群中肌醇代谢基因簇的快速定性检测方法具体操作步骤包括： 

从干酪乳杆菌中提取DNA， 

应用聚合酶链式反应（PCR）扩增干酪乳杆菌肌醇代谢基因簇侧翼区域， 

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，通过对干酪乳杆菌肌醇代谢基因簇侧翼区域的扩增和凝胶电泳图谱的分析来确定该代谢途径的有无，从而完成对干酪乳杆菌群中肌醇代谢基因簇分布规律的定性检测，其中扩增引物对为 

F：5’-ATTTAACCAAATTGACCGACACA-3’； 

R：5’-ATTCAGGAGAGGACAAAGATGCC-3’。 

更具体地，其操作步骤如下： 

a.干酪乳杆菌DNA的提取； 

细菌培养液5ml，10,000rpm离心1分钟，弃上清加入适量溶菌酶溶液，使其最终浓度为20mg/ml，彻底悬浮，37℃处理30-60分钟；加入20μl的20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀；加220μl缓冲溶液GB，振荡15秒；70℃放置30分钟；加入220μl无水乙醇，充分振荡15秒；将溶液加入吸附柱中，12,000rpm离心30秒；加500μl去蛋白液GD，12,000rpm离心30秒，弃废液；加700μl漂洗液GW，12,000rpm离心30秒，弃废液；加500μl漂洗液GW，12,000rpm离心30秒，弃掉废液；再次12,000rpm离心2分钟，将吸附柱置于室温数分钟；将吸附柱转入干净的离心管中，加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温置2-5分钟，12,000rpm离心30秒；离心得到的溶液再次加入吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，即得到干酪乳杆菌基因组DNA。 

b.肌醇代谢基因簇侧翼区域的扩增 

扩增体系： 

PCR扩增体系：0.2μlTaq聚合酶,2.5μl10×PCR缓冲液,2.5mMdNTP各2μl,25mMMgCl₂2μl，1μl上游引物,1μl下游引物,1μl基因组DNA和10.3μlddH₂O. 

PCR扩增条件： 

94℃变性5min；94℃30s，58.5℃30s，72℃40s，如此进行45次循环；72℃延伸10min，4℃10min； 

c.琼脂糖凝胶电泳 

将PCR产物于1%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20-30min，EB染色，紫外拍照，检测扩增效果，通过与对照菌株条带对比得出结果。 

其中，干酪乳杆菌Lactobacillus caseiAG8-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCCNo.7966，保藏日2013年07月25日，保藏地址为100101北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。 

附图说明

图1：肌醇代谢基因簇示意图，其中引物用黑色方框表示； 

图2：扩增2株干酪乳杆菌肌醇代谢基因簇侧翼区域电泳图.M:DNAmarker;泳道1：Zhang；泳道2：AG8-3。其中，不编码肌醇代谢基因簇的菌株才可得到1.5Kb的PCR产物。 

具体实施方式

干酪乳杆菌群中肌醇代谢基因簇的快速检测： 

1、实验方法 

1.1PCR引物设计与合成 

如图1所示，肌醇代谢基因簇由转录调节因子(iolR)、肌醇转运蛋白（iolT）、丙二酸半醛脱氢酶（iolA）、假想蛋白（iolB）、2-脱氧-5-D-葡萄糖酸激酶（iolC）、类乙酰乳酸合酶（iolD）、肌醇脱氢酶（iolG1）、肌醇单酮脱水酶（iolE）、果糖-二磷酸盐醛缩酶（iolJ）和丙二酸半醛脱羧酶（iolK）共11个基因组成，其侧翼 区域编码基因为醛酮还原酶（yvgN）和转录调节因子（gntR）基因。为了确保检测效率，PCR引物根据GenBank提供的干酪乳杆菌肌醇代谢基因簇及其侧翼区域相关序列（Accession No:CP001084），按照Primer Primer5.0软件的评价标准引物落在扩增效率较高的区域，由上海桑尼生物科技有限公司合成。 

引物序列： 

F：5’-ATTTAACCAAATTGACCGACACA-3’； 

R：5’-ATTCAGGAGAGGACAAAGATGCC-3’； 

1.2干酪乳杆菌DNA的提取。 

总DNA的提取参照QIAGEN的细菌基因组提取试剂盒说明书进行。 

待检菌株均分离自酸马奶，其中干酪乳杆菌Zhang保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心（保藏号为：CGMCC No.1697），干酪乳杆菌AG8-3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.7966，保藏日2013年07月25日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。细菌培养液5ml，10,000rpm离心1分钟，弃上清。加入适量溶菌酶溶液，使其最终浓度为20mg/ml，彻底悬浮，37℃处理30-60分钟。加入20μl蛋白酶K（20mg/ml）溶液，混匀。加220μl缓冲溶液GB，振荡15秒。70℃放置30分钟。加入220μl无水乙醇，充分振荡15秒。将溶液加入吸附柱中，12,000rpm离心30秒。加500μl去蛋白液GD，12,000rpm离心30秒，弃废液。加700μl漂洗液GW，12,000rpm离心30秒，弃废液。加500μl漂洗液GW，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。再次12,000rpm离心2分钟，将吸附柱置于室温数分钟。将吸附柱转入干净的离心管中，加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温置2-5分钟，12,000rpm离心30秒。离心得到的溶液再次加入吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，即得到干酪乳杆菌基因组DNA。 

1.3目的片断的PCR扩增 

PCR扩增体系：0.2μlTaq polymerase(5U/μl,Takara Tokyo,Japan),2.5μl10×PCR Buffer(without Mg²⁺),2μldNTP(2.5mM each),2μlMgCl₂(25mM),1μl上游引物(50pM),1μl下游引物(50pM),1μl基因组DNA和10.3μlddH₂O. 

PCR扩增条件：94℃变性5min；94℃30s，58.5℃30s，72℃40s， 如此进行45次循环；72℃延伸10min，4℃10min。 

1.4琼脂糖凝胶电泳检测 

取PCR产物5μl，同1μl上样缓冲液混合均匀，点样于琼脂糖凝胶孔中，在另一孔中加入5μlDL2000Marker,120V/cm电压下电泳30min。电泳结束后，在凝胶成像系统GDS-8000System(UVP Biomaging Systems)上留取照片，通过与对照菌株条带对比得出结果。 

因为在编码肌醇代谢基因簇的情况下，扩增产物大于14kb。所以可以认为在普通PCR条件下，只有不编码肌醇代谢基因簇的菌株才可得到1.5Kb的PCR产物。以具备肌醇代谢能力的干酪乳杆菌Zhang以及不具备肌醇代谢能力的干酪乳杆菌AG8-3为待检样本对引物进行测试。如图2所示，检测效果良好，这也说明该引物可以用于肌醇代谢基因簇分布规律的检测。