一种产磷脂酶C的重组大肠杆菌及制备磷脂酶C的方法和应用

摘要

本发明公开了一种产磷脂酶C的重组大肠杆菌及制备磷脂酶C的方法和应用，其步骤为：A、磷脂酶C基因的制备：PCR引物的设计及磷脂酶C基因片段的扩增。B、重组质粒的构建：经EcoR I和Not I酶切得大小为1158bp的磷脂酶C基因片段，将其克隆到高拷贝质粒pET28a上，得到重组质粒pET28a-P.f-PLC；C、工程菌的构建：用转化方法将质粒pET28a-P.f-PLC导入到E.coil BL21(DE3)。液体发酵能产生有活力的磷脂酶C，胞内外酶活力可达408.5U/ml。在油脂精炼、磷脂改性、医疗等领域具有一定的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种产磷脂酶C的大肠杆菌，同时还涉及一种产磷脂酶C的大肠杆菌的制备方法以及该工程菌发酵生产的磷脂酶C在植物油脂脱胶等方面的应用。 

背景技术

磷脂酶C(PLC，:EC3.1.4.3)是专一水解天然磷脂Sn-3位磷脂酰酯键的水解酶，在生物的生命活动中起着第二信使的作用，广泛分布于细菌、酵母菌、粘菌、果蝇、蛙及各种哺乳动物体中，可应用于医药、饲料改良和食品工业领域。医药方面，用于研制抗血小板聚集药物，预防血栓形成和心脑血管疾病。在饲料改良方面，磷脂酶添加于饲料中水解磷脂，改善饲料的利用效率和促进动物生长。在食品工业方面，PLC可被应用于油脂脱胶；同时由于磷脂酶可使面团形成胶状复合体，减少淀粉回生，应用于烘焙行业。 

近年来，随着PLC在食品、医药、饲料等领域的广泛应用，国内外学者对其进行了大量的研究。与其他来源的PLC相比，微生物具有生长繁殖快、培养周期短、产酶量高等特点。 

国内对磷脂酶C的研究虽起步较晚，但也取得了一定成果，例如：2005年陈涛等人对筛选到的产PLC菌株Bacillus cereus Shenzhen754-1进行三次紫外线和两次Co60-γ射线诱变处理，筛选出三株高PLC活性的诱变株，酶活分别达到14.878、16.450、16.400U/ml(陈涛，王常高，刘晓辉，何东平.高产磷脂酶C菌株的诱变选育.天然产物研究与开发，2005，17(6)：712-716.)；2007年高林对Bacillus cereus Shenzhen754-1进行培养条件的优化，将酶活提高至26U/mL(高林.磷脂酶C高产菌株的筛选、鉴定和培养条件的优化研究.安徽农业大学的硕士学位论文，2007)；2010年詹逸舒筛选到一株Bacillus cereus Z-13，用卵黄琼脂杯碟法测定该菌株所产生的PLC的沉淀圈(乳白色沉淀圈)，其直径可达30mm，酶活达到23.31U/ml(詹逸舒.产磷脂酶C菌株的筛选及其酶学性质的研究.湖南农业大学的硕士学位论文，2010)。 

与动植物来源的PLC相比，上述微生物来源的PLC具有更短的生产周期，但仍存在如下弊端：如野生菌株分离纯化耗资大，大多数具有潜在病原性，在食品安全性方面存在一定隐患；基因工程菌株其构建和产酶工艺较为复杂， 产酶量还有待提高。 

在植物油脂精炼中，需要将毛油中的磷脂除去(即脱胶)，如果不进行脱胶，油脂在加热到一定温度时就会发黑并产生黑烟，传统的脱胶工艺是采用碱化学的方法，即在毛油中加入NaOH，把磷脂转化成脂肪酸钠，在通过离心除去，此法油脂损耗和能耗较大、且产生的废水和皂角污染环境。而将磷脂酶C应用于植物油脂精炼，利用磷脂酶C将油脂中的磷脂转化成易于溶解在水中的磷酸酯和溶于油中的甘油二酯，再经过离心即可除去油脂中的磷酸脂，达到脱胶的目的，不产生含碱废水和皂角。酶法脱胶技术以其良好的经济效益、卓越的环保优势和简单的生产工艺已成为油脂精炼工艺的发展趋势。 

酶法脱胶工艺也随着磷脂酶制剂研究的不断深入而得到越来越广泛的应用，酶法脱胶技术相继在美国邦吉公司、德国邦吉曼海姆公司等油脂企业进行工业化应用。南海油脂工业有限公司是国内首个进行酶法脱胶工艺中试研究的企业。华南理工大学和诺维信公司进行合作，用酶法脱胶进行大量实验，结果证明酶法脱胶对不同质量的毛油具有相当强的适应性，对大豆油、菜籽油、葵花籽油、玉米油、米糠油等都适用。 

发明内容

鉴于上述和/或现有酶基因工程和酶工程领域中存在的问题，提出了本发明。 

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一株产磷脂酶C的重组大肠杆菌及用其制备磷脂酶C的方法。利用该菌株通过液体发酵来生产磷脂酶C，产酶量和酶活性高，安全性好，制酶工艺简单，成本低。 

本发明还有一个目的是在于提供了一种产磷脂酶C的大肠杆菌在植物油脂(大豆油、菜籽油、米糠油等)脱胶中的应用。利用大肠杆菌发酵产生的磷脂酶C与卵磷脂(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)发生反应，生成甘油二酯和水溶性磷酸酯，从而减少最终工序中的乳化情况。这样在离心分离过程中可以将胶质分离得更干净，同时也减少了中性油的损失。此外，磷脂酶C脱胶过程中生成的甘油二酯（DG）也是一种意外收获的油产物，在整个精炼工艺过程中都始终存在。水溶性磷酸酯经水化脱胶很容易除去，使油脂中的磷含量≤10ppm(相当于磷脂含量低于0.26‰)。与现有的化学法相比，具有环保、节能、出油率高的优点。 

本发明的技术方案如下： 

一种产磷脂酶C的重组大肠杆菌(Eschierichia coil)BL21(DE3)-pET-P.f-PLC，保藏编号为CCTCC No.M2013299。所述产磷脂酶C的重组大肠杆菌Eschierichia coil BL21(DE3)-pET-P.f-PLC，CCTCC No.M2013299，由下述方法制得： 

(1)以保藏编号为CCTCC No.M2013298的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的基因组为模板，克隆得到磷脂酶C基因，其碱基序列如SEQ IDNO：1所示； 

(2)将步骤(1)所得磷脂酶C基因克隆到表达载体pET-28a（+）上，得到重组载体； 

(3)将步骤(2)所得重组载体转化大肠杆菌感受态细胞，构建得到重组大肠杆菌。 

本发明还提供了一种用上述产磷脂酶C的重组大肠杆菌(Eschierichia coil)BL21(DE3)-pET-P.f-PLC，CCTCC No.M2013299制备磷脂酶C的方法，是以该重组大肠杆菌为发酵菌株进行液体发酵，制备磷脂酶C。 

其具体步骤如下： 

(1)种子培养：将所述产磷脂酶C的重组大肠杆菌BL21（DE3）-pET-P.f-PLC，CCTCC No.M2013299接种于种子培养基中，于30～37℃振荡培养8～12h，摇床转速150～200r/min； 

(2)液体发酵培养：将经过步骤(1)培养所得活化种子液按体积百分比3～10%的接种量接种至发酵培养基，于30～37℃振荡培养4～6h小时，摇床转速150～200r/min；再添加乳糖，于20～30℃振荡诱导培养14～22h，摇床转速150～200r/min；最后添加Triton X-100，于相同条件下继续振荡诱导培养18～36h，发酵完毕，得到发酵液； 

(3)粗酶液的提取：将步骤(2)所得发酵液离心；收集上清液，即为胞外粗酶液；收集菌体细胞沉淀并超声破碎，将所得超声破碎液离心，取上清，即为胞内粗酶液。 

其进一步的技术方案为： 

步骤(1)所述种子培养基成分按克/升计为：蛋白胨9～11g，酵母粉4～6g，NaCl9～11g，其余成分为水。 

步骤(2)所述发酵培养基成分按克/升计为：蛋白胨9～11g，酵母粉5～24g，甘油0～5g，其余成分为0.25mol/L Tris-HCl(pH7.2)。 

步骤(2)所述乳糖的添加量为每升所述发酵培养基0～5g。 

步骤(2)所述Triton X-100的添加量为每升所述发酵培养基0～10g。 

本发明所提供的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)-pET-P.f-PLC，已于2013年6月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC No.M2013299，地址：中国，武汉，武汉大学。该菌株以下简称：大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET-P.f-PLC，CCTCC No.M2013299。 

本发明有益的技术效果在于： 

与现有产磷脂酶C的野生分离菌株以及基因工程菌株相比，本发明构建了一株目的基因来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，可高产磷脂酶C的基因工程重组大肠杆菌Eschierichia coil BL21(DE3)-pET-P.f-PLC，CCTCC No.M2013299，利用该菌株通过液体发酵来生产磷脂酶C，产酶量高，其酶活性最高可达408.5U/ml，且安全性好；该制酶方法生产工艺简单、成本低、易于工艺放大，在油脂精炼、磷脂改性、医疗等领域具有一定的应用前景。 

磷脂酶C酶活的测定方法如下： 

(1)硼砂卵黄平板法性测定酶活。将发酵液进行超声破碎，取100～200μL破碎后的上清液加入等距放置在硼砂卵黄琼脂平板上的牛津杯中，于37°C温育12～24h，以生成的分解圈(透明圈或浑浊圈)的大小分别代表酶活的高低。 

(2)p-NPPC法定量测定酶活。p-NPPC是卵磷脂的一种底物结构类似物，磷脂酶C可水解p-NPPC生成对硝基苯酚，对硝基苯酚是一种黄色物质，在410nm处有最大吸收峰，利用分光光度法测定发酵液在410nm处的吸光值，可反映磷脂酶C水解p-NPPC产生对硝基苯酚的量，根据对硝基苯酚标准曲线可定量计算出相应酶活力大小；以1L反应液体系计，其组成如下：10mmolp-NPPC、0.25mol/L Tris-HCl(pH7.2)，1mL反应体系中加入100μL的发酵液，于37°C反应30min；酶活力单位定义如下：在pH7.2，温度为37°C的条件下，每分钟水解p-NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶的量为1个酶活力单位(U)。 

上述测定方法中，所述硼砂卵黄培养基成分如下：NaCl6.6g/L，硼酸10.9g/L，硼砂1.9g/L，琼脂10g/L，卵黄液10g/L，其余成分为水，pH7.2～7.4， 于1×10⁵Pa高压灭菌20min。摇匀后倾注平板，即得。 

一种产磷脂酶C的工程菌在除去植物毛油(大豆油、菜籽油、米糠油)中磷脂中的应用，包括，植物毛油的预热和酸预处理；加入如权利要求3所述的磷脂酶C进行反应；灭酶，离心分离完成脱胶。 

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述预热为预热到80℃；所述酸预处理为加入柠檬酸均质；所述加入如权利要求3所述的磷脂酶C进行反应为45℃条件下反应2小时；所述离心分离为5000rpm条件下离心5分钟取上层油相。 

取植物油毛油100g(磷含量400-600ppm)，预热至80℃，加入2.5mol/L柠檬酸0.125ml，均质1min，于该温度维持30min。冷却至40～45℃，加入4mol/LNaOH溶液和2～3％的蒸馏水混合均匀，再加入0.5ml的重组大肠杆菌发酵液(即磷脂酶C酶液)，40～45℃反应2～3小时。取样，测定含磷含量。 

采用这种方法可将植物油中的磷含量降到10ppm(相当于磷脂含量低于0.26‰)以下，满足物理精炼的要求。 

具体实施方式

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。 

下述实施例中所使用实验材料如下：大肠杆菌感受态细胞E.coli JM109和E.coli BL21(DE3)为实验室保存；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)为本实验室筛选，保藏编号为：CCTCC No.M2013298；pMD18T-simple Vector、T4DNA连接酶和10×T4连接酶Buffer购自宝生物工程（大连）有限公司；pET-28a(+)购自Novagen；限制性内切酶EcoR I、Not I以及共有Buffer购自New England Biolabs。 

实施例1磷脂酶C基因的克隆 

根据NCBI上提供的Pseudomonas fluorescens A506的磷脂酶C基因(NC_017911.1)的序列设计引物，其中， 

上游引物5'CGGAATTCATGTCAGGTCTTGAACTCGC3'，(下划线为EcoRI酶切位点)；下游引物5'TTGCGGCCGCTTAGTTGGCGGGTTGGTTTGGC3'， (下划线为Not I酶切位点)。 

以保藏编号为CCTCC No.M2013298的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的基因组DNA为模板，运用PCR的方法克隆得到磷脂酶C基因，并与载体pMD18T-simple连接构建克隆载体pMD-plc，将该克隆载体转化大肠杆菌感受态细胞E.coli JM109，挑选阳性克隆，测序验证，其碱基序列如SEQ IDNO:1所示，结果表明磷脂酶C基因克隆成功。Blast序列比对分析显示，该基因序列与已有磷脂酶C基因序列的同源性较低，最高为89%，拓宽了磷脂酶C的基因来源。 

实施例2质粒pET-P.f-PLC的构建 

用EcoR I和Not I对重组载体pMD-plc和表达载体pET-28a(+)进行双酶切，酶切反应体系为10μL：pET-28a(+)μL、EcoR I和Not I各0.5μL、EcoR I和Not I共用Buffer1μL。回收目的基因和载体DNA，并用T4DNA连接酶进行连接，连接反应体系10μL：目的基因5μL、载体DNA3μL、10×T4连接酶Buffer1μL、T4DNA连接酶1μL，于16℃反应12h。 

将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞E.coli JM109，转化方法如下： 

(1)取E.coli JM109100μL置于无菌1.5ml EP管中； 

(2)加入上述连接产物并轻轻混匀； 

(3)将上述EP管置于42℃恒温水浴，计时1.5min，勿摇动EP管； 

(4)转移EP管于冰浴中，冷却2min； 

(5)每管加入无菌SOB培养基800μL，置于37℃培养箱复苏1h； 

(6)以8000r/min的转速离心2min，吸去800μL上清培养基，用移液枪轻轻吹吸剩余培养基和细胞，并转移至含终浓度100μg/ml卡那霉素的LB固体平板，涂匀并于37℃培养箱培养16～24h； 

(7)挑取阳性克隆，并经EcoR I和Not I双酶切验证。 

实施例3重组大肠杆菌Eschierichia coil BL21(DE3)-pET-P.f-PLC，CCTCC No.M2013299的构建 

将构建好的重组质粒pET-plc转化大肠杆菌BL21(DE3)，转化方法如下： 

(1)取E.coli BL21(DE3)100μL置于无菌1.5ml的EP管中； 

(2)加入上述重组质粒pET-plc并轻轻混匀； 

(3)将上述EP管置于42℃恒温水浴，精确计时1.5min，勿摇动EP管； 

(4)转移EP管于冰浴中，冷却2min； 

(5)每管加入无菌LB培养基800μL，置于37℃培养箱复苏1h； 

(6)以8000r/min的转速离心2min，吸去800μL上清培养基，用移液枪轻轻吹吸剩余培养基和细胞，并转移至终浓度100μg/ml卡那霉素的LB固体平板，涂匀并于37℃培养箱培养16～24小时； 

(7)挑取转化子，酶切验证重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET-plc构建成功，与等体积的体积分数为30%的甘油混匀，于-70℃保藏。 

用重组大肠杆菌Eschierichia coil BL21(DE3)-pET-P.f-PLC，CCTCC No.M2013299制备磷脂酶C 

实施例4 

(1)种子培养：取50μL上述保藏的重组大肠杆菌Eschierichia coilBL21(DE3)-pET-P.f-PLC，CCTCC No.M2013299接种于种子培养基中，在回旋式摇床上于37℃振荡培养10h，摇床转速150r/min；上述种子培养基成分按克/升计为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，其余成分为水，于1×105Pa高压下灭菌20min。 

(2)液体发酵培养：将经过步骤(1)培养所得活化种子液按体积百分比5%的接种量接种至发酵培养基，发酵培养基装于250ml三角瓶，装液量为50ml，在回旋式摇床上于37℃振荡培养4h小时，摇床转速200r/min；添加乳糖至终浓度为0.1g/L，在回旋式摇床上于18℃振荡诱导培养30h，摇床转速为150r/min；发酵完毕，得到发酵液；上述发酵培养基成分按克/升计为：蛋白胨10g，酵母粉5g，其余成分为0.25mol/LTris-HCl(pH7.2)，于1×105Pa高压下灭菌20min。 

(3)粗酶液的提取：将步骤(2)所得发酵液于4℃离心10min，转速8000r/min；收集菌体细胞沉淀，用50mmol/LTris-HCl(pH7.2)重悬菌体，置于超声破碎仪中超声破碎10min，将所得超声破碎液离心，取上清，即为胞内粗酶液。利用p-NPPC法定量测得胞内粗酶液的酶活达到360U/ml。 

实施例5 

(1)种子培养：取50μL上述保藏的重组大肠杆菌Eschierichia coil BL21(DE3)-pET-P.f-PLC，CCTCC No.M2013299接种于种子培养基中，在回旋式摇床上于37℃振荡培养10h，摇床转速150r/min；上述种子培养基成分按克 /升计为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，其余成分为水，于1×105Pa高压下灭菌20min。 

(2)液体发酵培养：将经过步骤(1)培养所得活化种子液按体积百分比5％的接种量接种至发酵培养基，发酵培养基装于250ml三角瓶，装液量为50ml，在回旋式摇床上于37℃振荡培养4h小时，摇床转速200r/min；添加乳糖至终浓度为0.1g/L，在回旋式摇床上于18℃振荡诱导培养16h，摇床转速为150r/min；；再添加Triton X-100至终浓度为5g/L，同样条件继续发酵20h发酵完毕，得到发酵液；上述发酵培养基成分按克/升计为：蛋白胨10g，酵母粉5g，其余成分为0.25mol/L Tris-HCl（pH7.2），于1×105Pa高压下灭菌20min。 

(3)粗酶液的提取：将步骤(2)所得发酵液于4℃离心10min，转速8000r/min；收集菌体细胞沉淀，用50mmol/L Tris-HCl(pH7.2)重悬菌体，置于超声破碎仪中超声破碎10min，将所得超声破碎液离心，取上清，即为胞内粗酶液。利用p-NPPC法定量测得胞内粗酶液的酶活达到408.5U/ml。 

实施例6一种磷脂酶C在菜籽油脱胶中的应用，其步骤是： 

A、取100g菜籽毛油(磷含量为186ppm)，预热到80℃； 

B、加入的2.5mol/L柠檬酸0.125ml，均质1min后，保温30min； 

C、加入5mol/LNaOH0.25mL，蒸馏水3mL，磷脂酶C酶液(大肠杆菌BL21-pET-P.f-PLC)发酵得到，活力为360U/mL)500μL，2000rpm下均质1min，45℃条件下反应1小时。 

D、5000rpm离心5分钟，取上层油相，采用GB5537-2008《植物油脂检验磷脂测定法》测定脱胶处理后油品中的磷含量为5.449ppm，磷含量比脱胶前降低了97.07%左右，可满足物理精炼工艺的要求。 

实施例7一种磷脂酶C在大豆油脱胶中的应用，其步骤是： 

A、取100g大豆毛油(磷含量为642ppm)，预热到80℃； 

B、加入的2.5mol/L柠檬酸0.125ml，均质1min后，保温30min； 

C、加入5mol/L NaOH0.25mL，蒸馏水3mL，磷脂酶C酶液(大肠杆菌BL21-pET-P.f-PLC)发酵得到，活力为360U/mL)500μL，2000rpm下均质1min，45℃条件下反应1小时。 

D、5000rpm离心5分钟，取上层油相，采用GB5537-2008《植物油脂检验磷脂测定法》测定脱胶处理后油品中的磷含量为11.857ppm，磷含量比脱胶 前降低了98.15%左右，可满足物理精炼工艺的要求。 

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。