用于双色实时荧光PCR快速检测细菌的探针及其应用

摘要

本发明公开了一种用于双色实时荧光PCR快速检测细菌的探针及其应用，所述探针序列如下：革兰阴性细菌探针ACAGCCATGCAGCA，革兰阳性细菌探针ACAACCATGCACCA。本发明可以简便、快速检测细菌，检测灵敏度较高，且检测费用相对较低。

说明书

背景技术

传统微生物培养与鉴定方法有以下局限性：鉴定时间过长，病原微生物的 分离培养成功率不高，即鉴定的假阴性率较高，对于生长缓慢的微生物、苛养菌 等难培养微生物，培养的敏感性很差，多种病原菌共同存在时，尤其是同时存在 厌氧菌时，容易出现病原菌的漏检。因此，目前急需简便、快速、有效、相对价 廉的病原微生物快速检测技术。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一组用于双色实时荧光 PCR快速检测细菌的探针及其应用，本发明可以简便、快速检测细菌，检测灵敏 度较高，且检测费用相对较低。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一组用于双色实时荧光PCR快速检测细菌的探针，序列如下：

革兰阴性细菌探针：5’ACAGCCATGCAGCA3’  14碱基对，

革兰阳性细菌探针：5’ACAACCATGCACCA3’  14碱基对。

一种使用所述探针快速检测细菌的方法，包括以下具体步骤：

1、通用引物、革兰阴性细菌探针和革兰阳性细菌探针的设计与标记：

用临床常见病原菌的16SrRNA基因序列，查找其共同的保守区和变异区，设 计一对通用引物、一条革兰阴性细菌探针和一条革兰阳性细菌探针，序列如下：

引物1：5’GATGCAACGCGAAGAACCTTAC3’  22碱基对

引物2：5’TGCGCTCGTTGCGGGACTTAAC3’  22碱基对

革兰阴性细菌探针：5’ACAGCCATGCAGCA3’  14碱基对

革兰阳性细菌探针：5’ACAACCATGCACCA3’  14碱基对

MGB方法标记探针，革兰阴性细菌探针标记FAM，革兰阳性细菌探针标记HEX；

2、通用引物、革兰阴性细菌探针和革兰阳性细菌探针对临床病原菌的覆盖 范围是：40种革兰阴性细菌和21种革兰阳性细菌，见表1；

表161种临床病原性细菌

3、引物特异性和构建方法性能确认所用菌株和其他来源DNA：包括11种标准菌 株、临床分离的19种菌株，3种非细菌性病原体和人源基因组DNA，见表2，

表2  30种细菌和3种非细菌性病原体

4、所设计的通用引物细菌特异性和通用性验证

提取表2中各种细菌和非细菌病原微生物以及人基因组DNA，用步骤1中的 引物，按照以下实验步骤进行通用引物的特异性和通用性验证：

(1)菌株复活

挑取适量微生物室冰冻保存的菌株，按五区划线接种于营养琼脂平板；流感 嗜血杆菌接种于巧克力平板。CO₂培养箱过夜培养获得菌落。

(2)菌株DNA提取

用无菌环分别刮取平板上的1个菌落置于1ml无菌离心管中，充分混匀后， 离心，弃上清，取50ul菌株液加等量的细菌提取裂解液，100℃煮沸10min， 12000r／min离心5min，取上清液做PCR模板。

(3)反应体系

反应总体积50ul，10uM引物各2ul，25mM镁离子7ul，10mM dNTP4ul，1U 的Taq酶，buffer5ul，模板5ul。

(4)扩增条件

94℃预变性5min，94℃变性40sec，退火30sec，72℃延伸1min，72℃后 延伸5min，循环33次。

(5)扩增产物电泳分析

2％琼脂糖熔胶后加入2ul溴乙锭，灌胶后，取8.5ul扩增产物加1.5ul溴酚 兰后上样，75伏特电泳50min，用凝胶成像系统观察结果。

(6)得到PCR扩增产物电泳图显示所设计的引物对9种标准菌株和19种临床 分离菌株有扩增产物出现，产物片段与设计相符；对病毒、真菌、人基因组DNA 以及空白对照没有扩增产物；图1显示部分菌株的PCR扩增产物电泳图。

5、用通过验证的引物和标记探针，构建并优化MGB探针双色实时荧光PCR反 应体系，扩增条件如下：

反应总体积25ul，10uM引物各1.0ul，10uM G-Probe和G+Probe各0.5ul， 模板2.5ul，2.5×RealMasterMix10ul，20×Probe Enhancer Solution1.25ul， 超纯水补足。扩增条件为：94℃预变性2min，94℃20sec、60℃60sec为一个 循环，共40个循环；并检测细菌以及分析革兰阳性和阴性菌分类特异性。

附图说明

图1是通用引物特异性和通用性验证结果电泳图，1、肺克；2、大肠；3、 铜绿；4、大肠；5、肺克；6、奈瑟；7、金葡；8、白念；9、新隐；10、乙肝； 11、人DNA；12、空白。

图2大肠埃希菌双实时色荧光定量PCR检测结果。

图3金黄色葡萄球菌实时双色荧光定量PCR检测结果。

图4乙肝病毒双色荧光定量PCR检测结果。

图5新型隐球菌双色荧光定量PCR检测结果。

图6白色念珠菌双色荧光定量PCR检测结果。

图7人基因组DNA双色荧光定量PCR检测结果。

图8双色实时荧光定量对ATCC25922细菌敏感性检测的结果。

具体实施方式

实施例1：

1、通用引物、革兰阴性细菌探针和革兰阳性细菌探针的设计与标记：

用临床常见病原菌的16SrRNA基因序列，查找其共同的保守区和变异区，设 计一对通用引物、一条革兰阴性细菌探针和一条革兰阳性细菌探针，序列如下：

引物1：5’GATGCAACGCGAAGAACCTTAC3’  22碱基对

引物2：5’TGCGCTCGTTGCGGGACTTAAC3’  22碱基对

革兰阴性细菌探针：5’ACAGCCATGCAGCA3’  14碱基对

革兰阳性细菌探针：5’ACAACCATGCACCA3’  14碱基对

MGB方法标记探针，革兰阴性细菌探针标记FAM，革兰阳性细菌探针标记HEX。 由广州博芯生物科技公司协作(付费)合成并标记探针。

2、通用引物、革兰阴性细菌探针和革兰阳性细菌探针对临床病原菌的覆盖 范围是：40种革兰阴性细菌和21种革兰阳性细菌，见表1。

3、引物特异性和构建方法性能确认所用菌株和其他来源DNA：包括11种标准菌 株、临床分离的19种菌株，3种非细菌性病原体和人源基因组DNA，见表2；

4、所设计的通用引物细菌特异性和通用性验证

提取表2中各种细菌和非细菌病原微生物以及人基因组DNA，用步骤1中的 引物，按照以下实验步骤进行通用引物的特异性和通用性验证：

(1)菌株复活

挑取适量微生物室冰冻保存的菌株，按五区划线接种于营养琼脂平板；流感 嗜血杆菌接种于巧克力平板。CO2培养箱过夜培养获得菌落。

(2)菌株DNA提取

用无菌环分别刮取平板上的1个菌落置于1ml无菌离心管中，充分混匀后， 离心，弃上清，取50ul菌株液加等量的细菌提取裂解液，100℃煮沸10min， 12000r／min离心5min，取上清液做PCR模板。

(3)反应体系

反应总体积50ul，10uM引物各2ul，25mM镁离子7ul，10mM dNTP4ul，1U 的Taq酶，buffer5ul，模板5ul。

(4)扩增条件

94℃预变性5min，94℃变性40sec，退火30sec，72℃延伸1min，72℃后 延伸5min，循环33次。

(5)扩增产物电泳分析

2％琼脂糖熔胶后加入2ul溴乙锭，灌胶后，取8.5ul扩增产物加1.5ul溴酚 兰后上样，75伏特电泳50min，用凝胶成像系统观察结果。

(6)得到PCR扩增产物电泳图显示所设计的引物对9种标准菌株和19种临床 分离菌株有扩增产物出现，产物片段与设计相符；对病毒、真菌、人基因组DNA 以及空白对照没有扩增产物；图1显示部分菌株的PCR扩增产物电泳图。

5、用通过验证的引物和标记探针，构建并优化MGB探针双色实时荧光PCR反 应体系和扩增条件如下：

反应总体积25ul，10uM引物各1.0ul，10uM G-Probe和G+Probe各0.5ul， 模板2.5ul，2.5×RealMasterMix10ul，20×Probe Enhancer Solution 1.25ul， 超纯水补足。扩增条件为：94℃预变性2min，94℃20sec、60℃60sec为一个 循环，共40个循环。

6、MGB探针双色实时荧光PCR方法检测细菌及革兰阳性／阴性菌分类特异性分析

用上述PCR方法对11种标准菌株及19临床分离菌株进行检测，结果14株 革兰阳性细菌的G+探针PCR检测结果均为阳性，Ct值结果在17.0.0～23.0之间， G-探针PCR检测结果均为阴性(图2是其中的一种细菌检测结果)。16株革兰阴 性细菌G-探针PCR检测结果均为阳性，Ct值结果在11.0～23.0之间，G+探针 PCR检测结果均为阴性(图3是其中的一种细菌检测结果)。乙肝病毒、新型隐 球菌、白色念珠菌以及人基因组DNA经上述双色荧光定量PCR方法进行检测，结 果均为阴性(图4～7)，方法对细菌检测和革兰阳性、阴性菌分类均显示高度 特异，与病毒、真菌和人基因组DNA之间没有交叉反应。详见表3、4。

表3双色实时荧光PCR方法检测14株革兰阳性菌的Ct值

*为标准菌株

表4 双色实时荧光PCR方法检测16株革兰阴性菌的Ct值

*为标准菌株

7、MGB探针双色实时荧光PCR方法灵敏度分析

分别配制不同浓度细菌菌液：35个细菌／ml、175个细菌／ml、350个细菌／ml、 700个细菌／ml的大肠杆菌，提取细菌DNA进行所建方法的检测灵敏度分析，结 果见图8，显示所建方法最低可检测到35个大肠杆菌／ml。