使用释放过氧的无氮化合物减少乙醇发酵中污染性微生物的生长

摘要

使用释放过氧的无氮化合物的控制发酵过程中污染性微生物生长的方法。所述方法包括将释放过氧的无氮化合物加入发酵过程的一个或多个步骤中。在该方法中，可将释放过氧的无氮化合物加入发酵液体培养基的一种或多种组分中，所述培养基包含接种物、可发酵糖和工艺用水。

说明书

技术领域

本发明涉及控制发酵过程中的微生物污染的方法。这一方法尤其可用于食用或燃料级乙醇的生产。

背景技术

在过去十年中，乙醇作为运输燃料的应用显著提高。美国的乙醇生产从2000年的约64亿升提高至2009年超过370亿升。乙醇工厂的数量从2000年的54个提高至2009年的170个。在拉丁美洲和欧洲已经发生了类似的生产和工厂建设的增多。在2007年，美国国会颁布了能源独立和安全法案(Energy Independence and Security Act)(H.R.6)，其设定了到2022年1360亿升乙醇的可再生燃料标准。如果要达到这一标准，则乙醇工业将继续成长。

目前工业乙醇(例如燃料)和食用乙醇均通过发酵过程从农业(天然)原料中大规模制备，其中通过接种酵母将糖转化成乙醇和二氧化碳。许多原料可用于提供发酵糖，包括潜在的任何淀粉或纤维素材料，它们包括几乎所有植物，因为任何淀粉或纤维素可为糖前体。一些尤其适用于制备燃料乙醇的常见原料包括玉米、蜀黍、高粱、甘蔗、糖用甜菜和糖蜜。

用于乙醇生产的原料是天然产品，因此，在所述原料中可能在天然情况下存在广泛多种的微生物，诸如细菌、真菌和酵母。商业发酵过程的条件并非完全无菌，因此这些“污染性微生物”将在过程中存在。在商业乙醇生产中，最成问题的微生物是产乳酸细菌和产乙酸细菌。这类细菌从多种来源进入该工艺，所述来源包括原材料、设备、工艺用水、空气和接种酵母等。通过随进料物质(原材料、水、空气、酵母)引入或由于利于细菌生长的条件导致的天然扩增，这类细菌的浓度可在工艺环境中提高。用于酵母生产的最佳空气环境也极度有利于这些细菌的生长。细菌产生的有机酸抑制了酵母的生长并因此降低了乙醇生产率。细菌还消耗糖和其它营养物质，所述物质意在由酵母利用来产生所期望的产物，这导致了整个工艺经济效益更低。

大量的发酵过程使用抗生素作为抗微生物组合物。这类应用已经变得不受欢迎，这是因为抗生素耐药细菌的可疑发展以及抗生素残余物在发酵副产物中的积累所致。抗生素耐药细菌是人类健康的重大问题。

乙醇生产的副产物包括在对乙醇产物蒸馏后所收集的固体。这类固体包括含可溶物的干酒糟(DDGS)和含可溶物的湿酒糟(DWGS)。很多国家和地区正在考虑能限制或消除抗生素对乙醇生产的使用的管理措施。DDGS和DWGS作为动物饲料产品进行销售。

对抗微生物处理的需求不断增长，这不仅是由于乙醇产量的增长，还由于乙醇生产设施尺度的扩张。虽然数年之前生产150-200百万升/年(MMly)的工厂被认为是大型设施，但是现在380MMly(或更高)的设施是工业标准。在分批补料工艺中，单个发酵批次的体积已有显著提高。为容纳这一增加的容积，在最大的乙醇生产设施中进入发酵系统的原料(一旦其制备用于进入发酵，通常称为“醪”)的流速已从约2000-3000升/分钟提高至4500-6000升/分钟。

WO2007/149450描述了使用稳定的二氧化氯(SCD)来防止乙醇生产中的细菌污染。SCD在乙醇生产中显著的细菌生长发生前加入，其作为预防性而非治理性措施。污染性细菌在糖向酒精的发酵之前或其间的生长由此而基本被阻止，产生了增强接种酵母生长并且使接种酵母能够产生乙醇而不受细菌产生的有机酸的抑制的条件。

专利申请CA2,300,807描述了过氧化脲(UHP)在发酵过程中防止细菌生长的用途。UHP仅可商购有限的量，因为这种加合物有生产和储存的问题。在加入酵母前将UHP加入工序中，因此除去大量的细菌污染物群体，并且使接种酵母不受阻碍地将发酵原料转化成乙醇。仅在加入接种酵母前能够利用UHP，因为酵母能够代谢、并且因此中和UHP并使它对细菌失活。UHP在乙醇工业中的常遇到的储存条件下也是不稳定的。

尽管一些方法是已知的，但是对用于解决发酵工业中含碳水化合物的原料和发酵过程中的污染性微生物的改善方法存在着需求。改善的方法应优选地是无抗生素并且并不产生在发酵副产物中积累的残余物或不产生抗生素耐药细菌。该方法应在发酵工业中面对的广泛pH范围内和条件下有效。所述方法还应使用在用前具有合理储存寿命的处理。对于改善当今较大体积发酵过程的经济性也存在着需要。本发明满足这些需要。

发明内容

本发明提供了使用释放过氧的无氮化合物如过碳酸钠、过氧化钙、或过氧化镁来控制发酵过程中污染性微生物生长的方法。所述方法包括将释放过氧的无氮化合物加入发酵过程的一个或多个步骤中，其中发酵过程包括(i)提供接种物、可发酵糖和工艺用水；(ii)将接种物、可发酵糖和工艺用水单独或以任何组合引入发酵容器以提供发酵液体培养基；(iii)使接种物与可发酵糖在接种物将可发酵糖转化成乙醇的温度下，在发酵容器中接触。任选地，将营养物质加入接种物、可发酵糖和工艺用水的一种或多种中。还可将营养物质直接加入发酵容器。可向接种物、可发酵糖或工艺用水中(在这些物质各自引入发酵容器之前)加入释放过氧的化合物。作为另外一种选择，可将释放过氧的化合物直接加入发酵容器中。

释放过氧的化合物可与营养物质和可对发酵过程总体运行有益的其他产品一起配制。可使用营养物质如脲或磷酸氢二铵(用于为接种酵母提供氮源)或矿物如锌或镁。

本发明提供用于控制在发酵液体培养基中的反应物(如本文下文定义)中的、以及在发酵过程产物中的污染性微生物生长的方法。所述方法还控制了发酵系统的组件表面上的污染性微生物的生长。所述方法由或基本上由以下步骤组成，或包括以下步骤：向反应物或所述发酵液体培养基中或向所述发酵系统的表面上或容器中加入释放过氧的无氮化合物。

本发明还提供了方法，其可用于原位清洗(CIP)应用以处理发酵过程中使用的设备表面。“CIP”在本文是指可清洁表面而无需拆解所述设备。

所述方法包括加入有效量的释放过氧的无氮化合物，以控制污染性微生物的生长，而对用于发酵过程的接种物无有害影响。有效量会改变，但是可由本领域的技术人员根据本文公开来确定。可加入一定浓度范围的释放过氧的化合物，但是通常按照以发酵液体培养基的总重量计0.0001％至5％范围内的量加入。

本发明的方法还提供了在碳水化合物原料中控制至少一种污染性微生物生长的方法，其中所述提供可发酵糖的步骤包括提供碳水化合物原料并将原料与释放过氧的无氮化合物接触，其中所述原料的碳水化合物含量为至少1％，并且优选地为1重量％至70重量％(以原料总重量计)，其中释放过氧的化合物以有效量加入。通常释放过氧的无氮化合物按照以原料总重量计0.0001％至5％的释放过氧的化合物的量加入。

具体实施方式

本发明提供了用于控制污染性微生物的生长的方法，所述方法包括以下步骤、基本由以下步骤组成或由以下步骤组成：向发酵过程的一个或多个步骤中加入释放过氧的无氮化合物。向所述方法加入有效量的释放过氧的化合物如过碳酸钠以控制污染性微生物的生长，并且不抑制接种酵母将可发酵糖转化成乙醇和二氧化碳的能力。释放过氧的化合物可以发酵液体培养基的总重量计0.0001％至5％的量加入，发酵液体培养基包含接种物、可发酵糖和工艺用水。

本发明还在提供可发酵糖的步骤中提供了在碳水化合物原料中控制至少一种污染性微生物生长的方法，所述方法包括以下步骤、基本由以下步骤组成或由以下步骤组成：提供碳水化合物原料以及向所述原料中加入释放过氧的无氮化合物。

定义

以下的术语具有如下所提供用于本文的定义。

含水介质是指基本上是水的介质，例如大于80％，优选地大于90％，更优选地大于95％的含水量。含水介质可为大于99％的水。工艺用水是含水介质的一个例子。

碳水化合物原料是指用于制备或直接用作为可发酵糖的原料。即，碳水化合物原料是可发酵糖或包含可发酵糖的组合物或可转化成为可发酵糖的组合物。

碳水化合物原料可包含至多100重量％的碳水化合物。碳水化合物原料一般包含1％至70％的碳水化合物(以原料的总重量计)，优选地2％至40％，其作为含水介质中的溶液或悬浮液。原料中的碳水化合物量和组成可根据期望的最终用途而变化。例如玉米浆，它是得自湿磨方法的碳水化合物溶液，其可包含16.5％的碳水化合物。在湿磨方法中，将玉米浸渍或浸泡，然后分成多个组分。玉米浆是已将玉米长期浸泡后获得的含水液体，在此期间从玉米固体中提取用于发酵的可溶解组分，其溶于浸泡水中。来自湿磨方法的淀粉组分可包含至多40重量％的碳水化合物。

碳水化合物原料可包含其它组分，它们一般行使溶液和/或悬浮液助剂的功能。例如碳水化合物原料可包含酶、表面活性剂、分散剂、消泡组合物、矿物质、痕量元素以及它们中两种或更多种的组合。这些组分以及作为助剂的其它组分是本领域的技术人员熟知的。

应用于本文微生物生长的控制是指降低和/或防止靶向的不利污染性微生物生长。如本文使用，控制微生物的生长还包括将微生物群体维持于所期望的水平、将微生物群体降低至所期望的水平(部分地降低或甚至降低至不可检出的限度，例如，零群体)和/或抑制微生物的生长。

有效量在本文是指加入发酵过程中的无氮过氧化合物的量，以控制污染性微生物的生长，而对用于发酵过程的接种物无有害影响。

可发酵糖是反应物和用于乙醇发酵过程中的接种物的常用营养物质。可发酵糖是糖(例如葡萄糖)或淀粉，其通过酵母的作用转化成为乙醇和二氧化碳。公式(1)说明了葡萄糖(C₆H₁₂O₆)的工艺。

C₆H₁₂O₆→2C₂H₅OH+2CO₂(1)

如本文所用，可发酵糖是基本来自于任何植物来源的碳水化合物，包括糖、淀粉和/或纤维素，其通常以糖、淀粉和/或纤维素的水溶液或水悬浮液的形式提供。淀粉和/或纤维素可通过本领域中已知的方法(例如，使用酶)转化成为用于本发明的方法的可发酵糖。可发酵糖可来自淀粉来源或一种或多种纤维素物质来源，诸如玉米、高粱、小麦、木屑、蜀黍、大麦、粟、甘蔗、糖用甜菜、糖蜜、乳清、马铃薯、小麦秸秆、玉米秸秆、柳枝稷、藻类、海藻和/或其它生物来源。可发酵糖还可来自于果汁(例如，葡萄、苹果)。可发酵糖或者可来自非传统的原料，诸如木材废料、蔗渣、纸材废料、和市政固体垃圾。将这些来源转化成可发酵糖的方法是本领域技术人员已知的。参见J.Y.Zhu等人，Bioresource Technology(2010)vol.101(13)，第4992-5002页；以及A.L.Demain，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.”，(2009)，第36卷(3)，第319-332页以供参考。

方便地，可发酵糖可来自使用干磨或湿磨方法的玉米。在干磨方法中，将玉米研磨成为粗粉并且不经分离成为其组成性组分(基本上包含纤维、淀粉、油和蛋白质)便进行加工。在湿磨方法中，将玉米浸泡或浸没入水中并随后通过机械方式分离成为其组成性组分。将来自湿磨方法或来自干磨方法的粗粉(玉米面粉)的玉米淀粉组分与水和酶混合并进行烹制以增溶淀粉。

玉米淀粉是多糖，即，由单个葡萄糖单元制成的聚合物。通过酶(α-淀粉酶)将玉米淀粉转化成为较小(较短)的多糖，即，糊精。使用葡糖淀粉酶将较小的多糖转化成为葡萄糖(单糖)，由此而形成了可发酵糖。

作为玉米的替代品，可发酵糖可来自于糖蜜。糖蜜可获自包括甘蔗或糖用甜菜在内的多种来源，例如，作为制造结晶糖的工艺的副产物。糖蜜通常以糖浆而获得，在准备进行发酵中可向其中加入其它成分。这些其它成分包括甘蔗汁、甜菜汁、水和维生素或其它营养物质。是否加入一种或多种其它成分以及所加入的量应在糖蜜衍生的可发酵糖中有所变化。

作为玉米的替代品，可发酵糖可来自于甘蔗汁。甘蔗汁是使用水从甘蔗中提取的汁液。从甘蔗中对汁液的提取还通过物理压碎、水中扩散或本领域的技术人员一般熟知的其它方法实施。参见例如H.V.Amorim等人，“The Alcohol Textbook”(2009)，Nottingham University Press，Nottingham，第39-46页，和EPA Food and Agricultural IndustriesHandbook，第9.10.1.1章(甘蔗)和第0.10.1.2章(糖用甜菜)，可见于http://www.epa.gov/ttnchie1/ap42/ch09/(访问于2011年12月18日)。甘蔗汁可不经进一步加工而使用，并作为可发酵糖直接加入发酵容器中。

出于本文的目的，用于产生碳水化合物原料和可发酵糖的步骤是发酵过程的步骤。即，所述发酵过程包括产生碳水化合物原料的步骤和将淀粉和/或纤维素转化成为可发酵糖的步骤。

在发酵过程中，包括糖和淀粉在内的碳水化合物通常以约5％至约40％(重量/体积)的浓度存在于发酵液体培养基中，优选地以约10％至35％(重量/体积)的范围，其以发酵液体培养基的总体积计。

如本文所用，发酵液体培养基是指在发酵过程期间在已经加入全部反应物后的发酵容器内容物，并且其通常包含可发酵糖、接种物、任选的营养物质和工艺用水。

如本文所用，发酵过程是指包括将接种物(诸如酵母)在工艺用水中接触可发酵糖和任选的营养物质以产生乙醇的工艺。发酵过程可以是分批的或连续的。此外，出于本文的目的，发酵还包括用于制备或预处理一种或多种反应物的步骤，诸如通过天然来源制备可发酵糖的工艺和酵母增殖。

所述接触步骤在使接种物将糖转化成为乙醇和二氧化碳的温度下实施。

当通过干磨方法使用玉米作为原料生产乙醇时，发酵过程可包括一个或多个步骤：对玉米制浆、液化、糖化、制备接种酵母(增殖)、发酵醪(接种物作用于糖以生产乙醇的实际步骤)、分离并回收所得乙醇以及任选地循环利用接种酵母废料。发酵过程可包括一个或多个步骤：制备接种酵母、通过稀释、巴氏消毒或其它方法制备汁液、发酵、分离并回收乙醇以及任选地循环利用酵母。本领域的技术人员应当了解，这些工序可根据原料有效性和工厂设计与工厂位置而变。

如本文所用，发酵系统包括组件(设备)，诸如容器和管道，发酵过程的一种或多种反应物和产物在其内和通过其存留或流通。这类设备具有可存在细菌和其它污染性(不期望的)微生物的表面。发酵系统的一部分是发酵容器-在其中进行使可发酵糖与接种物反应以生产乙醇的发酵步骤的容器。

当通过干磨方法生产乙醇时，发酵系统可包括一种或多种容器，诸如浆液槽、液化槽、糖化槽、酵母增殖槽和发酵容器。这类容器及其用途对于本领域的技术人员是已知的。参见，例如R.J.Bothast和M.A.Schlicher，Applied Microbiology and Biotechnology(2005)，第67卷(1)，第19-25页。当通过湿磨方法生产乙醇时，发酵系统可包括一种或多种容器，诸如浸槽(steep tank)、分离槽、酵母增殖槽和发酵容器。本领域的技术人员应当了解，这些工序可根据原料有效性和工厂设计与工厂位置而变。

接种物是有目的地加入工艺来将原料(输入)转化成为所期望的产物(输出)的任何微生物。出于本文的目的，接种物是能够将可发酵糖转化成为乙醇的微生物。酵母是用于乙醇发酵的常用接种物。酵母是能够在有氧(具有氧气)或无氧(缺乏氧气)环境中生存并且生长的微生物。接种物还可选自能够将可发酵糖转化成为乙醇的真菌和藻类。例如，可使用产乙醇细菌作为接种物通过纤维素生产乙醇。当根据本文所述方法而使用时，接种物细菌并非如产乳酸和产乙酸细菌那样受到稳定的二氧化氯和过氧化物化合物的不利影响。

以下的讨论针对接种物是酵母的工艺。

出于本文的目的，接种酵母是针对反应系统中的特定转化而特意选择的酵母。例如，可选择接种酵母以在酵母增殖中产生附加酵母(例如用作面包酵母)；可选择接种酵母以代谢特定营养物质来产生酶。在这一具体的应用中，针对发酵可发酵糖来产生所期望质量和提高量的乙醇而选择接种酵母。接种酵母一般是由于它们完全发酵有效糖的能力、对高水平渗透胁迫、高温和高浓度乙醇的耐受而被选择的。酵母常用于乙醇发酵。酵母是能够在有氧(具有氧气)或无氧(缺乏氧气)环境中生存并且生长的微生物。用于本发明的方法的合适接种酵母包括但不限于啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae(S.cerevisiae))、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum(S.uvarum))、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe(S.pombe))和克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp)。

可将接种酵母作为接种物引入发酵容器，接种物是接种酵母的活化形式。即，在将接种酵母引入发酵容器前，通过在增殖槽中将酵母起始培养物接触营养组合物来增殖酵母(增加其量)以产生接种酵母。营养组合物包含一种或多种可发酵糖、酶、额外的营养物质和水以生长或活化酵母。增殖槽是与发酵容器相分离的容器并且在适当的温度条件下运行(例如，68-104°F，20-40℃)。各个接种物应具有增殖的优选温度。例如，30-32℃(86-90°F)的温度可能特别适合于增殖。虽然据了解酵母增殖可在发酵过程中于发酵容器内进行，但是酵母在增殖槽中的活化提供了高度活性的接种酵母。由此而将高度活性的酵母引入发酵容器。这类酵母增殖技术对于本领域的技术人员是已知的。参见例如E.Bellissimi等人，ProcessBiochemistry(2005)，vol.40(6)，第2205-2213页；以及M.Knauf等人，Sugar Industry(2006)，vo1.131，第753-758页。

对于连续发酵过程，通常没有单独的酵母增殖槽。在连续工艺中酵母可进行或可不进行循环利用。当无可用的循环利用时，酵母在称为主发酵的阶段连续生长并产生乙醇。当有可用的循环利用时，诸如在使用糖蜜或甘蔗汁作为可发酵糖的原料时的常见情况，通过与其它发酵组分相分离来循环利用酵母(通常使用离心)并且其通常在分离的槽(一般称为酵母循环利用槽)内使用酸来调理酵母细胞用于新的发酵循环。作为另外一种选择，可从发酵液体培养基中分离酵母，随后进行干燥并且固化为副产物。此类步骤是本领域技术人员熟知的。参见例如E.A.N.Fernandes等人，Journal ofRadioanalytical and Nuclear Chemistry(1998)vol.234(1-2)，第113-119页；以及L.C.Basso等人，FEMS Yeast Res.(2008)vol.，第1155-1163页。

相对于细菌，酵母具有中等至缓慢的发酵速度。为补偿其代谢率，在大规模工业乙醇生产中可能需要大量的酵母一般以通常约1×10⁵至1×10⁷细胞/克发酵液体培养基的量将接种酵母加入发酵过程。本领域的技术人员应当了解，这一量可根据所使用的发酵过程而变。

醪在本文用于指包含可发酵糖的组合物。醪包括在水中的混合谷物或其它可发酵碳水化合物的混合物，其在从可发酵糖与水的混合至任何调至和糖化之前直至完成发酵的任何阶段用于乙醇生产，如Jacques，K.A.，Lyons，T.P.，Kelsall，D.R，“The Alcohol Textbook”，2003，423-424，Nottingham University Press，UK中所定义。

微生物在本发明的上下文中分两种，即期望的和污染性的(非期望的)微生物。期望的微生物具有消耗营养物质以将可发酵糖转化成为乙醇的能力。期望的微生物包括接种物，诸如酵母，啤酒糖酵母，其用于葡萄糖发酵成为乙醇和二氧化碳。其它期望的微生物在其它生物精炼方法中使用。期望的微生物通常不存在于碳水化合物原料中。当期望的微生物存在于碳水化合物原料中时，所存在的存活细胞的数量通常过低而不能有利地与所述原料中还存在的其它微生物进行竞争。

污染性微生物是与接种物进行竞争并且消耗可发酵糖和营养物质的微生物。污染性微生物产生非期望的产物并且/或者以远低于接种物所产生的速度来产生乙醇。

污染性微生物包括细菌、真菌、野生的或污染的酵母以及能够代谢碳水化合物原料组分以维持微生物生存的其它微生物。污染性微生物污染碳水化合物原料、消耗原料以作为支持其生长食物来源、进行增殖并且因此而耗尽了所述原料。

污染性微生物如酵母污染菌常存在于工业和食用乙醇生产中，并且能够引起严重的污染事件，导致发酵过程中的乙醇产量降低。这些不良微生物可通过可发酵糖(原料)、工艺用水、空气、操作人员和大量的其它来源而引入所述工艺。

污染性微生物如细菌(包括乳酸菌(乳杆菌属的菌种))利用葡萄糖原料生成产物如乙酸和乳酸，它们不仅消耗原料并因此阻止原料转化成期望的产物，而且不利地影响生物精制过程中期望的微生物。例如，乙酸和乳酸不利地影响啤酒糖酵母将葡萄糖转化成乙醇的速率。其它污染性细菌包括片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)和梭菌属(Clostridium)。

营养物质是指支持接种酵母或其它接种物微生物的生长和/或存活的元素，例如营养物质可以是碳、氮、氧、硫、磷、镁和多种微量元素(诸如金属)的来源。碳源可以是醇，诸如甲醇，或是烃类，诸如辛烷。碳源还可以是可发酵糖。氮源可以是尿素、氨、铵盐或硝酸盐。诸如硫酸镁这样的盐可提供镁和硫。磷可以作为钠盐或钾盐来供应，而氧可通过将空气引入所述工艺来供应。可使用其它形式的气态氧，诸如纯氧或氧/氮混合物。其它元素可直接加入或可天然存在于工艺组分中。

释放过氧的化合物是释放过氧的无氮化合物。释放过氧的无氮化合物在本文定义为能够在加入水体系后释放过氧化氢或其它含氧自由基的任何无氮物质。释放过氧的化合物可为过碳酸盐、过硼酸盐或过氧化物的碱金属、碱土金属或过渡金属化合物，或者它们的两种或更多种的混合物，前提条件是混合物中的化合物是相容的。优选地释放过氧的化合物选自过碳酸钠、过硼酸钠、过氧化钠、过氧化钙、过氧化镁和过氧化锌。更优选地，释放过氧的化合物是过碳酸钠或过硼酸钠。释放过氧的化合物可以水合物形式使用，例如过碳酸钠水合物和一水合过硼酸钠。释放过氧的化合物溶解在含水体系中以产生过氧化物。例如，过碳酸钠通过以下反应产生碳酸钠和过氧化氢：

释放过氧的化合物可为纯化形式或部分制剂包封形式以提供增强的稳定性或延长的储存寿命。释放过氧的化合物可以粉末、小丸、小球、粉饼、或浆液形式提供。此外，释放过氧的化合物可与稳定剂、表面活性剂、附加营养物质、或接种酵母的附加氮源一起配制。本领域的技术人员将认识到包含释放过氧的化合物的不同制剂可为不同发酵过程优选的(例如根椐接种物、可发酵糖、可利用营养物质等等)。例如，用于生产乙醇的基于糖蜜的发酵中使用的优选制剂是释放过氧的化合物和维生素B混合物的组合，因为已知糖蜜含有比维持发酵酵母可能需要的维生素B更少的维生素B。

防腐和保存是指处理碳水化合物原料以防止污染性微生物(诸如细菌)对碳水化合物的反应或消耗。保存在至少一个月的时长上提供稳定的碳水化合物原料，其不发生实质的改变，诸如由于微生物代谢导致的碳水化合物的反应或消耗。改变的一个量度是保存原料的微生物群体。当恰当保存时，碳水化合物原料不发生大于1log₁₀CFU/ml或1log₁₀CFU/g的原料中的微生物群体增加。通常微生物群体用log₁₀CFU/ml(用于液体原料)和log₁₀CFU/g(用于固体/半固体原料)表示。log₁₀CFU/g的表达方式也可用于液体原料。

对于保存，变化的第二种度量是基于所述原料中特定酸类的浓度。酸是产生自污染性细菌对碳水化合物的反应和/或消耗的产物。例如，已知污染碳水化合物原料的某些细菌通过消耗碳水化合物而产生乳酸和乙酸。碳水化合物原料中提高浓度的乳酸和乙酸可用于显示所述原料是否适当地保存。当适当保存时，碳水化合物原料中的乳酸浓度低于0.60％(重量/体积)，并且碳水化合物原料中的乙酸的浓度低于0.30％(重量/体积)。

本领域的技术人员还应理解，可使用其它的改变量度。例如，检测到非期望化合物(例如来自碳水化合物原料代谢的产物)的存在可指示改变。检测方法可包括分光光度测定法、色谱法以及本领域的技术人员已知的其它方法。其它量度可包括碳水化合物原料的物理性能如比重或粘度的改变。

反应物是指接种物、可发酵糖、任选的营养物质以及发酵液体培养基中的其它任选组分。出于本文的目的，反应物还包括工艺用水。

生长控制方法

本发明用于控制一种或多种污染性微生物生长的方法包括以下步骤、基本由以下步骤组成或由以下步骤组成：将释放过氧的无氮化合物加入发酵过程的一个或多个步骤中。

可在将化合物引入发酵容器之前将释放过氧的化合物加入任何反应物中，例如接种物、可发酵糖或工艺用水。

发酵过程可以是分批的或连续的。在分批发酵中，优选地在加入可发酵糖之前，更优选地在加入任何反应物之前将释放过氧的化合物加入发酵容器。在连续发酵过程中，可在一个或两个酵母增殖步骤中或者在与发酵容器接触的步骤中加入释放过氧的化合物。如果使用了超过一个的系列发酵容器，优选地将释放过氧的化合物加入系列中的第一发酵容器或主发酵容器。

优选地在产生显著量的乙醇之前或产生与污染性细菌生长相关联的显著量的有机酸之前将释放过氧的化合物加入所述过程。“显著量的乙醇”是指发酵液体培养基中的乙醇量不超过10重量％，其以发酵液体培养基的总体积计。“显著量的有机酸”是指发酵液体培养基中的有机酸量不超过0.3重量％，其以发酵液体培养基的总体积计。优选地在发酵过程早期加入释放过氧的化合物，诸如在接种酵母增殖期间，或紧随接种酵母引入发酵容器之后。

在另一个实施例中，在将接种物引入发酵容器之前将释放过氧的化合物加入发酵过程中。在这个实施例中，在将这些反应物中的任一种引入发酵容器之前可将释放过氧的化合物加入可发酵糖或工艺用水或上述二者中，并且可在将接种物引入发酵容器之前将释放过氧的化合物/可发酵糖和/或释放过氧的化合物/工艺用水引入发酵容器中。例如，可将释放过氧的化合物加入提供可发酵糖的一个或多个步骤，诸如湿磨或干磨方法的一个或多个步骤。

当发酵过程包括基于甘蔗或基于糖用甜菜或基于糖蜜的糖时，通常具有成系列的发酵容器，其具有第一发酵容器、第二发酵容器或甚至第三发酵容器或更多的发酵容器以作为系列容器，其中作为发酵循环一部分发酵液体培养基连续地转移进入的各个发酵容器。在这个实施例中，可将释放过氧的化合物优选地加入第一发酵容器中。

作为另外一种选择，在使用甘蔗或糖用甜菜或糖蜜作为可发酵糖的发酵过程中，在将可发酵糖与接种物接触之前将释放过氧的化合物加入可发酵糖。可在可发酵糖储存期间加入释放过氧的化合物。本文将在储存期间加入释放过氧的化合物的这一步骤设想为提供可发酵糖的工艺步骤，其在将可发酵糖引入发酵容器之前进行。

也可在加入反应物之前将释放过氧的化合物加入空发酵容器中。

在另一替代方案中，对于甘蔗或糖蜜为可发酵糖并且在完成各个发酵循环后对接种物循环利用的分批工艺中，可在开始发酵过程的随后批次之前将释放过氧的化合物加入酵母处理阶段(酵母增殖)。即，可将释放过氧的化合物加入酵母再循环利用物流中，其常称为酵母乳。

在一个实施例中，可将释放过氧的化合物加入工艺用水中。本文将向工艺用水中加入释放过氧的化合物的这一步骤设想为提供工艺用水的工艺步骤，其在将工艺用水引入发酵容器之前进行。工艺用水包括任何水，其通过外部来源或从发酵过程其它部分进行循环利用而引入发酵过程。

在基于糖蜜的发酵过程中，工艺用水包括用于在发酵前稀释进料的糖蜜的水、作为酵母制备工艺部分而加入的水或从此前的发酵步骤循环利用的水(包括酵母再循环利用物流)。

在干磨发酵过程中，工艺用水包括加入浸槽、浆液槽、酵母增殖或发酵容器。工艺用水还可是干磨分批发酵过程中的再循环利用物流，其中再循环利用物流是在发酵完成后产生的物流，并且常称为回流或工艺冷凝物。干磨发酵过程的这些阶段对于本领域的技术人员是熟知的。参见，例如R.J.Bothast和M.A.Schlicher，Applied Microbiology and Biotechnology，如前文引用。

发酵过程可在接触步骤后进一步包括或替代性地包括将释放过氧的化合物加入该接触步骤的产物(其产物包含乙醇)，将乙醇从产物中分离。作为另外一种选择，发酵过程还可在接触步骤后包括将乙醇从剩余的产物中分离，其中剩余的产物被送入例如发酵池或酒糟水槽，并且向发酵池或酒糟水槽加入释放过氧的化合物。

释放过氧的化合物以提供控制一种或多种污染性微生物生长的有效量加入发酵过程中。通常以发酵液体培养基的总重量计，释放过氧的化合物以提供0.0001重量％至5重量％的浓度的量加入。优选地，以发酵液体培养基的总重量计，释放过氧的化合物以提供0.0005重量％至1重量％，更优选地0.002重量％至1重量％的释放过氧的化合物的浓度加入发酵过程中。最优选地，将释放过氧的化合物加入发酵过程中以提供以发酵液体培养基的总重量计0.005重量％至0.5重量％的释放过氧的化合物浓度。

释放过氧的化合物可为液体或固体形式，优选地为固体形式，更优选地为设计以提供最佳发酵性能的制剂部分。

保存方法

作为本发明用于在发酵过程中控制污染性微生物的生长的一个实施例，可加入释放过氧的化合物以作为提供可发酵糖中的步骤。更具体地，根据本文定义，发酵过程包括产生和储存碳水化合物原料的工序，其中碳水化合物原料包括可发酵糖或其用于制备可发酵糖。因此，提供可发酵糖的步骤可包括使碳水化合物原料与释放过氧的无氮化合物接触。因此，本发明的方法还适用于在碳水化合物原料的储存中防止降解。

原料中的碳水化合物含量为至少1重量％，并且优选地在1重量％-70重量％的范围内(以原料总重量计)。加入有效量的释放过氧的化合物。通常以原料的总重量计，释放过氧的化合物以提供0.0001％至5％的浓度的量加入。优选地，以原料的总重量计，释放过氧的化合物以提供0.001％至1％，更优选地0.01％至0.1％的浓度的量加入。

在这一方法中，将有效量的释放过氧的化合物与的碳水化合物原料接触以保护碳水化合物不发生非期望的微生物生长，并因此防止所述原料的劣化。原料劣化可通过存在的污染性微生物群体或微生物代谢物浓度如有机酸进行测定，所述微生物代谢物一般指示原料中非预期的或非期望的微生物活性。因此在加入组合物后基本上防止了储存或运输原料中的微生物增殖。

本发明还可用于在储存和运输期间控制污染性微生物，从而保存了碳水化合物原料。

令人惊讶地是，根据本发明处理的碳水化合物原料在至少一个月内保持稳定。“稳定”在本文是指加入的释放过氧的化合物保存碳水化合物原料，其中上文将“保存”定义为通过污染性微生物防止碳水化合物的反应或消耗。稳定的碳水化合物原料不发生大于1log₁₀CFU/ml或1log₁₀CFU/g的原料中微生物群体增加。CFU是菌落形成单位的缩写，它是原料中的微生物群体的量度。CFU用于测定每单位体积或每单位质量样品中存活的微生物细胞的数量或样品的微生物污染程度。改变的第二个量度是保存原料的pH。适当保存的原料的pH不应改变超过0.5个pH单位。然而，如上文所述，pH改变可能不足以在所有情况下监控碳水化合物原料的保存。

碳水化合物原料如上文所定义。

在本发明中，释放过氧的化合物作为防腐剂用于碳水化合物原料以阻止污染性微生物活性以及碳水化合物原料的随后劣化，其作为提供可发酵糖的步骤进行。污染性微生物包括细菌和酵母污染菌，它们分别公开于WO2007/149450和提交于2009年5月18日的美国专利公开申请12/467,728中。化合物抑制某些细菌的生长，所述细菌引起碳水化合物的非期望分解，例如单糖分解成有害的酸并且还选择性地降低酵母污染菌的活性。

实例

实例1

在该实例中，在糖蜜中测定酵母和乳酸菌对过碳酸钠的易感性。以1份糖蜜对3.1份水稀释糖蜜(B&G Foods，Inc.，Roseland，NJ)以模拟基于糖蜜原料的乙醇生产条件(常见于拉丁美洲和亚洲)。在实验中稀释糖蜜在使用前经121℃高压釜灭菌15分钟。乳酸菌培养物(LAB)(植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、和类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei))通过接种MRS肉汤(购自Difco Laboratories Inc.，Sparks，MD)并在32℃下搅拌培养过夜进行制备。选择细菌，因为它们以前已经被从污染乙醇发酵过程中分离出来。混合每种生物的培养物以形成细菌混合物并在糖蜜中稀释以提供1.0×10⁷、1.0×10⁶、和1.0×10⁵个细菌/mL，或者常表达为每毫升菌落形成单位数或CFU/mL)。用前制备2％的过碳酸钠(Alfa Aesar，Ward Hill，MA)溶液。将过碳酸盐加入包含25mL的接种糖蜜的试管中，其浓度为0、100、250、500和1000ppm。在32℃下搅拌培养试管。在大约2小时后，通过将糖蜜十倍比稀释到MRS琼脂板(DifcoLaboratories Inc.，Sparks，MD)表面上计算每个试管中存在的细菌含量。板在32℃下培养过夜。结果提供于表1中。

从表1中可看出，当LAB的起始浓度为1.0×10⁵CFU/mL时，500ppm的过碳酸盐剂量在两小导致细菌含量降低了大约3-对数。在1.0×10⁶或1.0×10⁷CFU/mL的初始浓度下，500ppm的过碳酸盐剂量导致2-对数的减少。然而，在1000ppm的剂量下，所有LAB测试含量降低至低于测定法的检出限(10CFU/mL)。

在该实例1的第二部分，酵母菌株Ethanol Red、FermPro S、和SuperStart(常用作乙醇工业中的发酵酵母)在酵母浸出粉胨葡萄糖肉汤(Yeast Peptone Dextrose broth，YPD，Difco Laboratories Inc.，Sparks，MD)中培养过夜。然后将各个菌株悬浮在如上稀释糖蜜中以提供大约1×10⁶CFU/mL并如上所述用不同浓度的过碳酸盐处理两个小时。结果提供于表2中。

从表2中可看出，所有三种酵母菌株对过碳酸钠处理的抗性远高于乳酸菌。在糖蜜中用500ppm过碳酸盐处理1.0×10⁶CFU/mL酵母导致EthanolRed和FermPro S小于1-对数的减少，并且导致SuperStart浓度大约1-对数的减少。与用上述LAB测试所发现的＞6个对数的减少相比，用1000ppm过碳酸盐处理酵母菌株Ethanol Red和FermPro S导致大约1-对数的减少。

因此，加入过氧化合物显著减少了存在的乳酸菌植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、和类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)。

实例2

任何细菌控制方法想要应用于燃料乙醇生产，它必须能够在广泛pH水平下使细菌失活。乙醇生产的pH根据进料和所需酶变化很大。在该实例中，展示在pH4.2和5.4下使用过碳酸钠使乳酸菌失活。

如实例1所述以1份糖蜜3.1份水来稀释糖蜜(B&G Foods，Inc.，Roseland，NJ)并灭菌。然后将制备的糖蜜分成两批并使用硫酸将pH分别调节至大约pH4.2和5.4。如实例1所述制备LAB培养物并接种到糖蜜中以形成大约1×10⁶CFU/mL。加入过碳酸钠(Alfa Aesar，Ward Hill，MA)至250、500、和750ppm。使用标准碘量滴定方法的滴定指示过碳酸钠包含以干固体计大约27.6重量％的过氧化氢。LAB含量通过稀释并转移到MRS琼脂表面、随后在32℃下培养来测定。在加入过碳酸钠大约2和24小时测量LAB。结果示于表3中。

表3

从表3中可看出，加入过碳酸钠(在所有过碳酸盐水平)导致存活LAB含量下降。提高过碳酸盐含量导致LAB灭活增加。在pH4.2的糖蜜样品中，在2小时加入250、500、和750ppm的过碳酸钠导致大约1-对数的LAB量减少。在24小时取样时，750ppm的过碳酸钠能够将LAB数减少超过3-对数单位。在使用调节至pH5.4的糖蜜的实验中，在2-小时取样时，500和750ppm的过碳酸钠能够将糖蜜中存在的LAB含量减少大约2-对数。在24-小时取样时，仅250ppm的过碳酸钠剂量能够使LAB含量减少几乎6-对数。在750ppm，剩余的LAB含量低于测定法的检出限。

实例3

在该实例中，使用过氧化钙(CaO₂)示出染料乙醇生产中存在的LAB分离物的失活。使用标准碘量滴定方法的滴定指示过氧化钙包含大约35.1重量％的过氧化氢，与之相比过碳酸钠包含27.6重量％的过氧化氢。为了比较过氧化钙与过碳酸钠的功效，调节过氧化钙量使得活性物质剂量(H₂O₂ppm)与实例2中相同。

如上制备糖蜜并使用硫酸调节至pH4.2和5.4。如实例1所示制备乳酸菌培养物并接种到糖蜜中至大约10E6CFU/mL。通过如实例1所述系列稀释接种的糖蜜至MRS琼脂表面上确认细菌含量。加入指示含量的过氧化钙。如上所述在加入后2和24小时测量细菌含量。结果示于表4中。

表4

类似于过碳酸钠的结果，过氧化钙能够在两个pH水平下显著降低糖蜜中的LAB含量。在pH4.2的糖蜜中，在2小时取样时197和393ppm的过氧化钙仅导致轻微的LAB含量降低。加入590ppm的过氧化钙能够减少LAB群体大约1个对数。在24小时，加入197ppm的过氧化钙导致大约1个对数的减少，而393和590ppm能够减少LAB群体超过6-对数单位。在pH5.4的糖蜜中，590ppm的过氧化钙在2小时的时间点能够将LAB含量从2.65×10⁶降低至8.0×10⁴CFU/mL。在24小时，393ppm的过氧化钙将LAB含量减少至低于检出限。

实例4

加拿大专利申请2,300,807描述了过氧化脲(UHP)在发酵过程中防止细菌生长的用途。类似于过碳酸钠和过氧化钙，UHP可用作释放过氧的化合物并使乙醇生产中的细菌污染物失活。然而，对于在工业环境中使用的任何方法，释放过氧的化合物必须是长时间储存稳定的。在甘蔗(用于乙醇生产的糖蜜来源)生长季亚洲和拉丁美洲的环境温度常达到40℃。在该实例中，测试多种释放过氧的化合物在40℃储存期间的稳定性。

使用干燥烘箱在40℃下贮存释放过氧的化合物样品。使烘箱平衡过夜。每种以下释放过氧的化合物的两克平行测定样品分散到铝制称重盘中：过碳酸钠(Alfa Aesar，Ward Hill，MA)、过碳酸钠FB400(SolvayChemicals，Inc.，Houston，TX)、过碳酸钠FB400C(Solvay Chemicals，Inc.)、过氧化钙(Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO)、过氧化镁(Sigma-Aldrich Co.)、和过氧化脲(Sigma-Aldrich Co.)。六天后，使用标准碘量滴定法分析样品的过氧化氢含量。结果提供于表5中。

从表5中可以看出，所有三个过碳酸钠样品在40℃下储存6和14天是稳定的，并且在储存第6天保持96％至99％的相对过氧化氢。过氧化钙在储存期间也是稳定的，并且保持97％的相对过氧化氢。过氧化镁是最稳定的测试释放过氧的化合物，在40℃下储存6天后保持100％的相对过氧化氢，并且在储存14天后保持99％-100％的相对过氧化氢。与之相反，过氧化脲在储存期间是不稳定的。在0天包含大约35％过氧化氢的样品在储存第6天减少至低于1％的过氧化氢。这种贮存稳定性的缺乏将使过氧化脲成为一种不实用的释放过氧的化合物，无法在乙醇生产期间灭活细菌污染物。

实例5

使用过碳酸钠作为释放过氧的化合物的一个附加有益效果是它能够减少发酵酵母中存在的污染性细菌群体。在这个实验中，使用UHP和过碳酸钠以使在10E6CFU/mL酵母的存在下，在pH5.0的稀释糖蜜中的乙醇生产细菌污染物失活。

如上文实例1所述制备乳酸菌(LAB)培养物。如前文实例所述，糖蜜用水以1∶3.1稀释。如实例1所述培养发酵酵母Ethanol Red。通过分别在MRS琼脂和YPD琼脂上稀释来测定乳酸菌和酵母菌群体。混合LAB的过夜培养物以制备细菌混合物并接种到调节至pH5.0的糖蜜(用水以1∶3.1稀释)中至大约6.11Log CFU/mL。将酵母培养物加入每个试管中，浓度为大约6.80Log CFU/mL。将UHP(Sigma-Aldrich Co.)和过碳酸钠(AlfaAesar，Ward Hill，MA)加入每个试管中至最终浓度等同于H₂O₂500ppm(UHP包含大约34.5％的H₂O₂，而过碳酸钠包含大约27.6％的H₂O₂)。加入的UHP量为1450ppm。加入的过碳酸盐量为1812ppm。然后在32℃下搅拌孵育所述试管。通过将糖蜜样品接种到包含10ppm两性霉素(Sigma-Aldrich Co.)的MRS琼脂板上监测在接种后2和6小时的LAB含量。两性霉素抑制酵母生长，仅有利于细菌计数。结果提供于表6中。

表6

从表6中可看出，在过氧化氢等同浓度下，过碳酸钠能够在32℃孵育2小时内将LAB菌落减少几乎5个对数单位。等同浓度的UHP仅减少LAB群体3个对数单位。孵育6小时，存在的LAB群体降低至低于过碳酸钠的检出限，而用UHP处理的糖蜜中的细菌仍旧是可检出的。这些结果显示过碳酸钠在控制乙醇发酵过程中的细菌群体方面是令人惊讶地更有效的，其中细菌群体必须在发酵酵母存在下被减少。