一种保护细菌低温冻融损伤的抗冻多肽及其制备方法

摘要

本发明公开了一种保护细菌低温冻融损伤的抗冻多肽及其制备方法，以鱼源胶原蛋白为原料，采用碱性蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到保护细菌低温冻融损伤的抗冻多肽，氨基酸全序列为：Gly-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg-Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Arg-Val-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Ala–Gly-Ala-Arg-Gly-Ala-Asp-Gly。本发明突破了国内外现存的抗冻蛋白（多肽）的研究思路和方法，克服从天然生物体中纯化抗冻蛋白数量的局限性以及国际FDA组织对转基因抗冻蛋白在食品应用中的安全性顾虑，获得基于食品源的高效抗冻多肽，为开发基于食品源的抗冻多肽以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定理论基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗冻多肽，更具体地涉及了一种利用碱性蛋白酶酶解鱼源胶原蛋白制备的抗冻多肽，属于生物技术领域。

背景技术

食品和医药产品在低温储存和运输过程中由于环境温度的波动变化而反复地遭受冰晶生长和重结晶的问题越来越受到人们的关注。温度的反复升降使冰晶不断生长、冻融和重结晶，严重破坏细胞和组织结构而失去产品应有的品质。世界范围内的科学家正面临严肃的挑战：如何控制冰晶生长及重结晶，实现低温冷链上的冰晶生长控制，是制约众多食品和医药产品品质的关键所在。 

抗冻蛋白, 也称“冰结构蛋白”，是一类附着在冰晶体表面而抑制冰晶的生长和重结晶的活性蛋白质。抗冻蛋白由于其具有控制冰晶生长、减少细胞损伤及保持产品原有组织结构、质地和品质的特点和突出意义而成为热点研究主题。 同样的研究还表明，抗冻蛋白的抗冻活性片断只存在于局部的特异多肽链结构域而并不是整体蛋白质在起作用，即使是纯化了的抗冻蛋白，抗冻活性往往不高，仍然需要探究其活性域来进一步提高抗冻效率。所以，如何获得食品源的结构紧凑的高活性抗冻多肽，就成为抗冻蛋白迫切的研究方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种保护细菌低温冻融损伤的抗冻多肽及其制备方法，突破了国内外现存的抗冻蛋白（多肽）的研究思路和方法，克服从天然生物体中纯化抗冻蛋白数量的局限性以及国际FDA组织对转基因抗冻蛋白在食品应用中的安全性顾虑，获得基于食品源的高效抗冻多肽，为开发基于食品源的抗冻多肽以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定理论基础。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种保护细菌低温冻融损伤的抗冻多肽的氨基酸序列为：Gly-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg-Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Arg-Val-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Ala–Gly-Ala-Arg-Gly-Ala-Asp-Gly。

制备如上所述的保护细菌低温冻融损伤的抗冻多肽的方法，以鱼源胶原蛋白为原料，采用碱性蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到所述的保护细菌低温冻融损伤的抗冻多肽。

所述的鱼源胶原蛋白包括来自鱼皮、鱼鳞的鱼源胶原蛋白。

酶解条件为：pH值为9.0，温度为45℃，时间为30分钟，酶与底物的质量比为1:20。

所述的分离纯化的具体步骤为：酶解产物首先利用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为2mL/min，洗脱峰在225nm下进行测量；收集具有最佳抗冻活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25阳离子交换色谱进行分离，洗脱液为NaCl浓度梯度为0-0.5 M的0.01mol/L pH7.0的磷酸缓冲液，流速为0.5mL/min；收集具有最佳抗冻活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色谱再进行进一步的分离，反相HPLC的分离条件是用体积分数为10%-90%的乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为1mL/min，收集体积分数为35%乙腈溶液处的洗脱峰。

本发明的显著优点在于：本发明立足于抗冻蛋白的抗冻活性片断只存在于特异的肽链结构域而不是整体蛋白质在起作用的理论基础，以来自于鱼源胶原蛋白为原材料，着眼于通过碱性蛋白酶的切割条件控制，切割为具有特定的肽链长度和结构域组成的活性多肽，而使抗冻活性得以高效地实现。本发明为开发基于食品源的抗冻多肽以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定理论基础。

附图说明

图1是纯化鱼皮胶原蛋白抗冻多肽的 CLC－HPLC-C18色谱图。

图2是纯化的特异性抗冻多肽对保加利亚乳酸杆菌的低温保护作用；其中，图中的 A、B分别表示空白保加利亚乳酸杆菌、添加0.5%（w/w）特异性抗冻多肽样品的保加利亚乳酸杆菌生长情况图。

具体实施方式

明胶酶解条件的优化

本技术所采用的酶和鱼（鱼皮、鱼鳞）胶原蛋白购自Sigma生物试剂公司（中国·上海）。采用单因素实验，分别对三个酶解因素进行考察，分别为酶解温度（37℃，45℃和50℃）、酶解时间（10，20，30，40和60分钟）以及酶-底物配比（1:100，1:50，1:20，1:15和1:10 w/w）。称取1.65克鱼源胶原蛋白溶解于6ml Mili-Q水中，然后用2mol/L NaOH将其pH调节至9.0。先将该溶液水浴加热到需要温度，接着再按不同的酶-底物配比加入相应量的酶，按照预定的反应时间开始反应。接着再在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再1000rpm离心10分钟。上清液收集后，分别对其抗冻活性进行测定，以确定最佳酶解条件。得到具有最大抗冻活性的酶解液的酶解条件是：酶解pH为pH7-10、温度30-55℃、酶解时间为20-60分钟、酶-底物配比为1:15-1：20（w/w）。

酶解产物的分离、纯化

先在最佳酶解条件下进行酶解，得到的酶解产物先经过Sephadex G-50凝胶色谱（长100cm，直径2.6cm）进行分离，洗脱液为去离子水，流速为2mL/min，洗脱峰在225nm下进行测量。收集具有最佳抗冻活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25阳离子交换色谱（长55cm，直径2.0cm）进行分离，洗脱液为NaCl浓度梯度为0-0.5 M的0.01mol/L pH7.0的磷酸缓冲液，流速为0.5mL/min。收集具有最佳抗冻活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色谱再进行进一步的分离，反相HPLC的分离条件是用10-90% 乙腈溶液作为洗脱液，流速为1mL/min，得到高纯度的特异性抗冻多肽。

抗冻活性的测试

本发明按照国际抗冻蛋白活性检测的标准，建立抗冻活性检测系统。抗冻活性采用检测抗冻多肽对低温冻融细菌的保护作用来测试。

将活化的保加利亚乳酸杆菌接种到液体培养基中37℃，130r/min培养过夜作为种子液，将种子液以1:100的比例接种到新的液体培养基中，37℃，130r/min摇床培养至OD₆₀₀=1.0左右。取若干1.5mL已灭菌的离心管，加入经过滤除菌的浓度为250μg/mL待测样品900μL，将菌液稀释10⁴倍，吸取100μL加入至待测样品中，混匀，涂布，37℃倒置培养18h，计菌落数。将剩余的样品-菌液混合液置于-20℃低温处理24h，取出融化并涂布，37℃倒置培养18h，计菌落数，每组做两个平行。然后根据以下公式计算保加利亚乳酸杆菌的存活率：

氨基酸序列测定

利用蛋白质测序仪(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. MA, U.S.A) 测定特异性抗冻多肽的氨基酸全序列。

为了进一步了解本发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例：

实施例1

称取1.65克鱼皮胶原蛋白溶解于6ml Mili-Q水中，然后用2mol/L NaOH将其pH调节至9.0。先将该溶液水浴加热到45℃，接着再按照酶-底物配比为1:20的比例加入相应量的酶，酶解时间为30分钟。接着在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再14000rpm离心10分钟，收集上清液备用。

将上清液用Sephadex G-50凝胶色谱（长100cm，直径2.6cm）进行分离，洗脱液为去离子水，流速为2mL/min，洗脱峰在225nm下进行测量，收集具有最好抗冻活性的洗脱峰。

对Sephadex G-50凝胶色谱分离的具有最好抗冻活性的洗脱峰再进行下一步的分离，用Sulfopropyl-Sepadex C-25阳离子交换色谱（长55cm，直径2.0cm）进行分离，洗脱液为NaCl浓度梯度为0-0.5M的0.01mol/L pH7.0的磷酸缓冲液，流速为0.5mL/min。收集各峰样品并测定抗冻活性，获得最好的抗冻活性的样品利用RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步的分离纯化。 洗脱液自含10%乙腈和90%水（v/v）的混合液开始，至90%乙腈和10%水（v/v）的混合液结束，进行梯度洗脱，收集35%乙腈和65 %水（v/v）处的洗脱峰,得到本发明的高纯度的特异性抗冻多肽，如图1所示。YP3峰为该特异性抗冻多肽的色谱峰。

纯化的特异性抗冻多肽具有很强的细菌低温保护的能力，由图2可以看出，与空白对照（图2A）相比，添加了0.5%(w/w)的特异性抗冻多肽，（图2B）。计算保加利亚乳酸杆菌的存活率为92.6％。

对纯化的特异性抗冻多肽利用蛋白质测序仪(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. MA, U.S.A) 测定特异性抗冻多肽的氨基酸序列。所述多肽的氨基酸全序列为：Gly-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg-Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Arg-Val-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Ala–Gly-Ala-Arg-Gly-Ala-Asp-Gly。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110>  福州大学

<120>  一种保护细菌低温冻融损伤的抗冻多肽及其制备方法

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  28

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  1

Gly Gln Arg Gly Gly Arg Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg Val Gly

1                        5                               10                            15     

Pro Ser Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Ala Asp Gly

                  20                            25