一种虫草菌丝体多糖分离纯化的方法

摘要

本发明一种虫草菌丝体多糖分离纯化的方法，属于生物工程技术领域。将虫草菌丝粉用石油醚脱脂后，95℃热水回流提取，离心浓缩获得虫草菌丝体水提液；再用不同倍数质量分数为95%乙醇分级沉淀，离心收集沉淀，透析，冷冻干燥，得到不同组分的虫草菌丝体粗多糖；由离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[Bmim]BF4）和无机磷酸盐NaH2PO4组成的离子液双水相体系进行萃取分离，下层无机盐相透析，浓缩，冷冻干燥，即得分离纯化的虫草菌丝体多糖。利用本发明制备的虫草菌丝体多糖能够最大限度分离纯化虫草菌丝体多糖，既不影响多糖天然结构又能保持其原有生物活性，且本发明的方法方法简便、成本低、灵活实用，利于推广、开发和应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从冬虫夏草菌丝体中分离纯化虫草菌丝体多糖的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

冬虫夏草(Cordyceps sinensis)，又名冬虫草或夏草冬虫，是我国特有的一种名贵药用真菌及传统的滋补佳品，内含丰富的生物活性物质，具有增强免疫力、抗肿瘤、延缓衰老等功能。目前研究认为，多糖是冬虫夏草的主要功效成分之一，虫草多糖除了抗肿瘤和免疫调节活性，又有降血糖血脂和抑制糖尿病作用，抗氧化活性，所以最具开发多种新产品，新用途的潜力。由于天然冬虫夏草资源有限，价格高昂，无法满足人们对珍稀虫草资源的广泛需求，对虫草菌人工发酵培养获取虫草菌丝体为虫草的产业化开发提供了可能。人工培养虫草菌体是以收获虫草菌丝体为目标，目前，商业化的虫草产品主要是虫草菌丝体胶囊或与其他中药成分混合的健康产品。

对于虫草菌丝体多糖分离纯化工艺的研究很多，如乙醇分级沉淀、离子交换色谱、凝胶过滤色谱和膜过滤等。其中，柱层析是分离纯化过程中应用最普遍的一种方法，但是纯化过程具有耗时长、费用高、产品回收率低、溶剂用量大和操作繁琐等缺点，限制了虫草菌丝体多糖的工业化生产和开发。此外，乙醇分级沉淀是一种简单且行之有效分离纯化的方法，但在提取多糖的同时蛋白质也随之沉淀下来，而且蛋白质含量随乙醇浓度增加而增加，这为后续多糖纯化带来一定困难。因此，一种高效、快速分离纯化虫草菌丝体多糖的方法显得尤为重要。

离子液体双水相体系综合了离子液体和双水相体系的优点，开辟了新的萃取分离体系。与传统的双水相体系相比，离子液体双水相体系分相时间短、黏度低、萃取过程不易乳化且离子液体可以回收利用，这些优点刚好克服了传统双水相体系的缺点，广泛地应用于蛋白质、抗生素、生物碱、药物和小分子有机化合物的分离和纯化。但是，关于离子液双水相体系结合常规方法如乙醇分级沉淀、透析等快速分离纯化多糖的研究文献或专利还未见报道。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种虫草菌丝体多糖分离纯化的方法。

本发明提供虫草菌丝体多糖分离纯化的方法，不影响天然多糖的结构和生物活性，并能作为药用、食用（保健品）原料。

本工艺的具体步骤是从液体发酵所得冬虫夏草菌丝体中通过热水提取、乙醇分级沉淀获得不同组分多糖混合物，通过离子液双水相体系萃取分离，透析，冷冻干燥，得到虫草菌丝体多糖。

一种虫草菌丝体多糖分离纯化的方法，按照下述步骤进行：

（1）脱脂：虫草菌丝粉用石油醚脱脂处理2次，自然晾干；

（2）热水提取：步骤（1）所得的脱脂后虫草菌丝粉95℃恒温水浴中回流提取8 h，重复2次，以5000 rpm离心15 min，收集上清液，浓缩，得虫草菌丝体水提液，4℃冰箱储存，备用；

（3）乙醇分级沉淀：步骤（2）所得的水提液加入1/5倍质量分数为95%的乙醇沉淀，4℃冰箱静置过夜，以8000 rpm离心30 min，收集沉淀，蒸馏水透析48 h，冷冻干燥；离心所得上清液中继续依次加入1/5、2/5、3/5、1和2倍质量分数为95%的乙醇，重复以上操作，得到不同倍数乙醇沉淀的虫草菌丝体粗多糖；

（4）离子液双水相体系萃取分离：步骤（3）所得的虫草菌丝体粗多糖配成质量浓度为10 mg/mL的水溶液，取1.0 mL加到由1.0 mL 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[Bmim]BF₄）、1.25 g NaH₂PO₄和3.0 mL水组成的离子液双水相体系中，充分振荡、溶解，25℃恒温水浴静置30 min，分离上下两相；

（5）透析和冷冻干燥：下层无机盐相透析，浓缩，冷冻干燥，得到白色絮状虫草菌丝体多糖；

（6）离子液体回收：上层离子液相用二氯甲烷萃取，减压蒸发，回收离子液体 [Bmim]BF₄。

本发明建立虫草菌丝体多糖分离纯化的方法，获取均一分子量的多糖，成分为葡萄糖、甘露糖和半乳糖，具有免疫调节和抗氧化活性。对进一步研究其化学结构、溶液构象和阐明其药理活性机制有重要意义。

附图说明

图1为1倍体积质量分数为95%乙醇沉淀组分纯化得到虫草菌丝体多糖的GPC-MALLS色谱图。

具体实施方式

实施例1：

1．脱脂：虫草菌丝粉装入脱脂布袋中，放入500 mL索氏提取器中，加入石油醚，45℃恒温水浴脱脂6 h，重复脱脂1次，倒出虫草菌丝粉，自然晾干。

2．热水提取：步骤1所得的脱脂后虫草菌丝粉按1:10（g/L）的料液比加入蒸馏水，充分混匀后，在95℃恒温水浴中回流提取8 h，重复提取2次。提取结束后，混合物用500 mL塑料离心杯，以5000 rpm，15 min离心，上清液45℃旋转蒸发器减压浓缩，浓缩至原体积的1/3，得到虫草菌丝体水提液，4℃冰箱储存，备用。

3．乙醇分级沉淀：步骤2所得的虫草菌丝体水提液加入1/5倍预冷的质量分数为95%乙醇沉淀，充分振荡，4℃冰箱静置过夜，以8000 rpm，30 min离心，收集沉淀，溶于水，蒸馏水透析48 h，进一步去除寡糖、无机盐、单糖、色素等小分子杂质，冷冻干燥；离心所得上清液继续依次加入1/5、2/5、3/5、1和2倍质量分数为95%的乙醇，重复以上操作，得到不同倍数95%乙醇沉淀的虫草菌丝体粗多糖。

4．离子液双水相体系萃取分离：步骤3所得的虫草菌丝体粗多糖溶于水配成质量浓度为10 mg/mL的水溶液，取 1.0 mL多糖溶液加到10 mL具刻度试管中，然后加入1.0 mL 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[Bmim]BF₄）、1.25 g无机磷酸盐NaH₂PO₄和3.0 mL水，充分振荡、溶解，25℃恒温水浴静置30 min，分离上下两相。

5．透析和冷冻干燥：步骤4所得下层无机盐相加入到截留分子量为8000~12000 Da的透析袋中，蒸馏水透析48 h，去除无机磷酸盐NaH₂PO₄，透析液45℃减压浓缩，冷冻干燥，得到白色絮状的虫草菌丝体多糖纯品，经凝胶渗透色谱-多角度激光光散射（GPC-MALLS）检测为单一峰（见图1），苯酚-硫酸法检测中性糖含量在96%以上。

6．离子液体回收：上层含有蛋白质等杂质的离子液相加入一定体积二氯甲烷，置于分液漏斗中，充分振荡，收集二氯甲烷相，45℃旋转蒸发器减压蒸发，得到离子液体[Bmim]BF₄。