一种小分子RNA及其制备方法和在特异性上调基因转录活性的药物中的应用

摘要

本发明公开了一种利用小分子RNA（包括微小RNA及小干扰RNA）通过靶向核心启动子特异性上调基因表达的方法及一系列调控靶基因。本发明提出当启动子中含有TATAbox序列时，靶位点为以TATAbox序列为中心上下游各延伸20碱基的范围；当启动子中不含有TATAbox序列时，靶位点为，以该基因转录起始位点，上游的1~50的序列。其中微小RNA(microRNA)hsa-let-7i、hsa-miR-138、hsa-miR-92a、hsa-let-7c及hsa-miR-181d分别特异性上调白介素2、胰岛素、降钙素、组蛋白和c-myc基因的表达。此外，针对随机选择的19个基因启动子，人工合成的小干扰RNA(siRNA)能够增强其中78.9%基因的转录活性。本发明的目的是提供一种利用小分子RNA特异性上调基因表达的方法，本发明在生物技术及生物医药领域具有较大应用价值和广阔的应用前景。

说明书

技术领域

    本发明涉及小分子RNA的领域，更具体地，涉及一种小分子RNA及其制备方法和在特异性上调基因转录活性的药物中的应用。

背景技术

    基因表达的精确调控对于生物的发育具有重要意义，基因调控失调会引起许多重要的疾病，如癌症，免疫性疾病，神经疾病，代谢疾病（如糖尿病）等。因此，精确调控基因表达的技术具有重要的研究及临床治疗应用价值。目前调控内源基因表达的方法主要是RNA干扰（RNA interference）技术。RNA干扰技术利用一段与目的基因同源的双链RNA分子，利用RNA沉默通路来抑制目的基因表达。RNA沉默通路的主要成员是DICER蛋白及RNA诱导的基因沉默复合体（RISC）,RISC的主要成员是AGO蛋白。双链RNA分子在细胞内首先被DICER切割成~22 bp的小片段，随后其中的反义RNA片段被招募至RISC中与靶mRNA结合并导致其降解。目前应用的比较广泛的RNA干扰手段是siRNA和shRNA。siRNA是一段合成的双链RNA分子，一般长度为19 nt，末端带悬垂修饰，其反义链与目的基因mRNA互补；shRNA一般为在表达载体插入一段目的基因的同源序列，在细胞内表达后被加工成短的siRNA，当shRNA通过慢病毒载体表达时，可以达到长时间稳定的基因抑制效果。然而RNA干扰技术只能达到沉默或者降低内源基因表达的效果，而目前尚无一种特异性的有效地上调内源基因表达的方法。而上调某些基因表达在生命科学研究及临床治疗应用中具有重要价值。例如，通过调控增强糖尿病病人胰岛素表达量可以缓解其症状并提高其生活质量。

    微小RNA(microRNA)是一类小分子调控RNA,在动物、植物真菌乃至病毒中广泛存在。微小RNA参与很多重要的调控通路，其调控异常将引起许多严重的疾病。微小RNA的调控通路与siRNA很相似，都是在RISC与靶mRNA结合抑制基因表达；不同之处在于微小RNA的作用主要是抑制mRNA翻译，而siRNA直接导致mRNA的降解。目前广泛认为微小RNA调控方式是在细胞质的RISC中结合到靶mRNA的3’非翻译区（3’ UTR）抑制mRNA翻译。近年来研究发现细胞中有很多微小RNA不仅仅分布在细胞质中，一些微小RNA在细胞核中有很高的富集，但这些微小RNA的功能却不清楚。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种能提高基因转录活性的小分子RNA。

    根据需求先提供一种上调内源基因表达用的小分子RNA的制备方法，包括以下步骤：

S1. 小分子RNA的靶点确定

当启动子中含有TATA box序列时，靶位点为以TATA box序列为中心上下游各延伸20碱基的范围；

当启动子中不含有TATA box序列时，靶位点为该基因转录起始位点上游1~50碱基的序列。

S2. 小分子RNA的设计及合成

小分子RNA的反义链与靶点序列互补，得核心序列，

S3. 修饰S2所得的核心序列，使得小分子RNA包含以下结构：

长度为19碱基3’端带dTdT悬垂的双链siRNA、长度小于或者大于19 碱基的双链siRNA、体外合成的微小RNA、体外合成的单链或双链反义RNA或者体外合成的经过化学修饰的siRNA，microRNA及反义RNA。

    再提供一种根据上述的制备方法所得的小分子RNA在调节基因转录活性及其药物中的应用。

    所述的调节基因转录活性是指结合TATA box序列或其他核心启动子，从而增强基因的表达。

    再提供一种根据上述制备方法制得的小分子RNA。

    所述的小分子RNA为hsa-let-7i、hsa-miR-138、hsa-miR-92a、hsa-let-7c或hsa-miR-181d，

     所述的hsa-let-7i的基因序列如SEQ NO:1 所示，

     所述的hsa-miR-138的基因序列如SEQ NO:2 所示，

     所述的hsa-miR-92a的基因序列如SEQ NO:3 所示，

     所述的hsa-let-7c的基因序列如SEQ NO:4 所示，

     所述的hsa-miR-181d的基因序列如SEQ NO:5 所示。

     最后提供一种上述的小分子RNA在调节基因转录活性及其药物中的应用。

     所述的调解基因转录活性是指提高白介素2、胰岛素、降钙素、组蛋白和c-myc的基因的转录活性。

   S5. 提供一种上述方法制得的小干扰RNA, 所述的小干扰RNA 为IL-2TATAcen、INS-TATAcen、LHB-TATAcen、POMC-TATAcen、NPPA-TATAcen、IL6-TATAcen、HIV-TATAcen、H4A1-TATAup、APOE-TATAcen、CIRBP-TATAup、BCL2L12-TATAcen、RHO-TATAcen、CALCA-TATAup、GAPD-TATAdn、或HBB-TATAcen，

       所述的IL-2TATAcen的基因序列如SEQ NO:6 所示：     

    所述的INS-TATAcen的基因序列如SEQ NO:7 所示：                                        所述的LHB-TATAcen的基因序列如SEQ NO:8 所示：

    所述的POMC-TATAcen的基因序列如SEQ NO:9 所示：

    所述的NPPA-TATAcen的基因序列如SEQ NO:10 所示： 

    所述的IL6-TATAcen的基因序列如SEQ NO:11 所示： 

所述的HIV-TATAcen的基因序列如SEQ NO:12 所示：        

所述的H4A1-TATAup的基因序列如SEQ NO:13 所示：

    所述的APOE-TATAcen的基因序列如SEQ NO:14 所示：

    所述的CIRBP-TATAup的基因序列如SEQ NO:15 所示： 

    所述的BCL2L12-TATAcen的基因序列如SEQ NO:16 所示： 

所述的RHO-TATAcen的基因序列如SEQ NO:17 所示：       

所述的CALCA-TATAup的基因序列如SEQ NO:18 所示：

    所述的GAPD-TATAdn的基因序列如SEQ NO:19 所示：

    所述的HBB-TATAcen的基因序列如SEQ NO:20 所示： 

    更进一步的提供一种上述的小干扰RNA在调解基因转录活性中的应用。

    所述的调解基因转录活性是指提高白介素2、胰岛素、LHB、POMC、NPPA、IL6、HIV-1病毒、H4A1、APOE、CIRBP、BCL2L12、RHO、CALCA、GAPD和HBB的基因的转录活性。

本发明的优点如下：

我们在研究中发现细胞中大量的微小RNA与聚合酶II核心转录因子结合，计算机预测表明其中许多微小RNA能够结合到基因启动子的TATA box序列上。其中微小RNA has-let-7i能够结合到白介素-2基因启动子TATA box序列并增强该基因的表达。其他微小RNA包括hsa-let-7i、hsa-miR-138、hsa-miR-92a、hsa-let-7c及hsa-miR-181d分别通过结合启动子上TATA box序列特异性上调白介素2（interleukin-2）、胰岛素（insulin）、降钙素（calcitonin）、组蛋白（H4A1）和c-myc 基因转录活性。此外，利用人工合成的靶向基因TATA box的siRNA我们发现能够上调近80%的基因转录活性。

1、本发明提供证据表明人类细胞内微小RNA hsa-let-7i 序列特异性靶向白介素2（IL2）基因启动子TATA box序列并增强白介素2的mRNA及蛋白表达水平。小鼠动物实验表明小鼠微小RNA mmu-let-7i能够增强小鼠血液中白介素2表达水平。

2、本发明提供证据表明hsa-let-7i增强白介素2表达水平是序列特异性的，其调控效果与微小RNA和基因启动子TATA box序列间的互补性呈正相关。

3、本发明提供证据表明微小RNA与基因启动子TATA box序列间能够直接结合，并且导致基因转录起始速率的提高。

4、 本发明提供证据表明细胞内的微小RNA包括hsa-miR-138、hsa-miR-92a、hsa-let-7c及hsa-miR-181d分别通过靶向TATA box序列特异性上调胰岛素（insulin）、降钙素（calcitonin）、组蛋白（H4A1）和c-myc 基因的转录活性。

5、本发明提供证据表明在以TATA box为中心上下游各20 bp范围内设计三条siRNA靶向启动子，这些siRNA能够上调近80%的基因的转录活性。

附图说明

图一为细胞内许多微小RNA与RNA聚合酶转录复合物结合。（A）外周单核细胞（PBMCs）中许多微小RNA与RNA聚合酶II结合。（B）microRNA芯片鉴定结果。（C）实时荧光定量PCR验证microRNA芯片结果。（D）实时荧光定量PCR鉴定microRNA与TATA box结合蛋白TBP结合。

图二为人CD4+细胞及小鼠动物实验表明hsa-let-7i能够增强白介素2(IL-2)表达。（A）计算机预测的hsa-let-7i与IL-2核心启动子结合情况。（B）hsa-let-7i模拟物能够增强IL-2启动子转录活性。（C）hsa-let-7i模拟物在Jurkat细胞中能够增强内源IL-2 mRNA表达。（D）hsa-let-7i模拟物在人原代CD4+细胞中能够增强内源IL-2 mRNA表达。（E）hsa-let-7i模拟物在人原代CD4+细胞中能够增强内源IL-2分泌。（F）hsa-let-7i模拟物在小鼠原代CD4+细胞中能够增强内源IL-2 mRNA表达。（G）hsa-let-7i模拟物在小鼠体内能够增强血液中IL-2表达水平。

图三为hsa-let-7i通过序列特异性靶向TATA box序列调控IL-2转录活性。（A）突变IL-2启动子上结合位点影响hsa-let-7i的调控效果。（B）突变hsa-let-7i影响其对IL-2调控效果。（C）分别突变hsa-let-7i及IL-2启动子上的结合位点并使二者重新匹配可以恢复hsa-let-7i调控效果。（D）let-7家族其他成员增强IL-2转录活性效果与其与hsa-let-7i序列相似性正相关。 

图四为微小RNA可与启动子DNA结合并增强基因转录活性。（A）IL-2核心启动子可与hsa-let-7i结合，当IL-2核心启动子序列突变后，这一结合受到影响。（B）IL-2核心启动子与hsa-let-7i结合受到RNA酶H的影响。（C）hsa-let-7i增强IL-2 启动子转录起始速率。（D）hsa-let-7i增强IL-2 启动子转录延伸过程。

图五为细胞内微小RNA hsa-miR-138、hsa-miR-92a、hsa-let-7c及hsa-miR-181d通过序列特异性结合TATA box区域增强胰岛素（insulin）、降钙素（calcitonin）、组蛋白（H4A1）和c-myc基因的启动子转录活性。（A）计算机预测微小RNA与基因启动子结合情况，hsa-miR-138、hsa-miR-92a、hsa-let-7c及hsa-miR-181d分别结合胰岛素（insulin）、降钙素（calcitonin）、组蛋白（H4A1）和c-myc 基因的TATA box序列。（B）微小RNA hsa-miR-138、hsa-miR-92a、hsa-let-7c及hsa-miR-181d分别上调胰岛素（insulin）、降钙素（calcitonin）、组蛋白（H4A1）和c-myc 基因的启动子转录活性。 

图六为靶向TATA box的人工合成小干扰RNA有效地增强启动子转录活性。（A）上部分表明靶向基因TATA box序列siRNA的设计位点示意图，下部分通过随机选择的19个包含TATA box序列的基因启动子进行测试，人工合成的siRNA包括IL-2TATAcen、INS-TATAcen、LHB-TATAcen、POMC-TATAcen、NPPA-TATAcen、IL6-TATAcen、HIV-TATAcen、H4A1-TATAup、APOE-TATAcen、CIRBP-TATAup、BCL2L12-TATAcen、RHO-TATAcen、CALCA-TATAup、GAPD-TATAdn、或HBB-TATAcen在双荧光素酶报告系统中能够增强其中15个（78.9%）基因的转录活性。人工合成的靶向IL-2 TATA box的siRNA增强内源性IL-2 mRNA（B）与蛋白（C）表达。

图七为靶向非TATA box基因核心启动子的小干扰RNA有效增强启动子转录活性及mRNA表达。（A）靶向非TATA box基因神经生长因子(NGF)和载脂蛋白B受体（APOBR）核心启动子的小干扰RNA对基因转录活性的影响。（B）靶向非TATA box基因Akt1、CDC25A、ERK2、Bmi-1及JNK的核心启动子的小干扰对基因mRNA表达的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

实施例1  微小RNA hsa-let-7i 通过靶向TATA box 上调白介素2表达

1.1 制备方法 

质粒、微小RNA模拟物、干扰RNA

    将pMIR-Reporter载体（Promega）上的CMV启动子用限制性酶切替换为人IL-2启动子转录起始位点（TSS）附近的-400 ~ +1bp段，构建成人IL-2启动子启动的荧光素酶报告载体。将hsa-let-7i 的前体序列插入PLKO.1 载体（Sigma），并将载体上的嘌呤霉素基因替换成GFP，构建成PLKO-let-7i载体。野生型hsa-let-7i、 mmu-let-7i 、突变型hsa-let-7i、agomir-hsa-let-7i及相应的阴性对照从上海吉玛公司（Genepharma）或广州锐博公司（Ribobio）购买。

抗体和试剂

    anti-HA（MMS-101P）和anti-Pol II（8WG16）单克隆抗体从Covance公司购买，anti-TBP单克隆抗体（ChIP Ab+）从Upstate （Millipore）购买，anti-actin抗体 (D6A8) 从CST （Danvers, MA）购买，anti–human CD3和anti–human CD28 从BD（Palo Alto, CA）购买，anti–mouse CD3和anti–mouse CD4从eBioscience （San Diego, CA）购买。 PMA和离子霉素从Sigma购买。RNA-ChIP所用的EZ-Magna ChIP A/G kit (10086) 从Millipore购买。

细胞培养

    Jurkat和HEK293T细胞系购自ATCC，并按其操作规范培养。用淋巴细胞分离液从健康人全血中分离得到人外周血淋巴细胞（PBMCs），再用CD4+ T Cell Isolation Kit II (BD)从中分离出初始CD4+ T细胞，PBMCs和 CD4+ T细胞均用含有10%胎牛血清、50 U/ml 青霉素和50 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养。

转染和感染 

用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）将野生型hsa-let-7i和阴性对照微小RNA模拟物转染进人或鼠的CD4+ T细胞，使其终浓度为50 nM，48-72小时后，用anti-CD3 (1μg/ml) 和anti-CD28（5μg/ml）刺激12-24 小时。agomir-hsa-let-7i及相应的阴性对照按终浓度为50 nM的剂量直接加到CD4+ T细胞培养基中，并按同样方法刺激。用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)转染HEK293T细胞。用Lipofectamine 2000将pCMV-ΔR8.2、 VSV-G 和PLKO.1三个质粒共转染进HEK293T细胞（60%密度），48小时后收集含有慢病毒的上清并加入4μg/ml的聚凝胺来感染Jurkat细胞。用流式细胞分选仪（BD Bioscience, Palo Alto, CA）分选出被感染的GFP+细胞，并用5ng/ml PMA和1 μM离子霉素刺激。

微小RNA芯片和数据分析

用Serum/Plasma Focus miRNA PCR Panel (V1.R) (Exiqon)检测微小RNA的表达，按说明进行数据分析。

实时定量反转录PCR分析

    用TRIzol reagent (Invitrogen)提取Jurkat和CD4+ T细胞的总RNA，用PrimeScript RT reagent Kit (Takara)按照说明书进行反转录合成cDNA，接着用SYBR Premix ExTaq II Kit (Takara) 按照说明书进行定量PCR，用看家基因GAPDH或β-actin作为内参。

微小RNA及其靶点的计算机预测

    从Eukaryotic Promoter Database (EPD, http://epd.vital-it.ch/)上下载基因的核心启动子序列（-49 to +1），含有“ATAA”保守基序的为含有TATA-box的启动子。从miRBase (http://www.mirbase.org/)上下载微小RNA的成熟序列，用RNA-hybrid网络服务器(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid)预测微小RNA在基因的核心启动子序列上的靶点，选取MFE值低于-25 kcal/mol的靶点。

双荧光素酶报告分析

    转染前一天向48孔板的每孔中铺~20,000 HEK293T细胞，用Lipofectamine 2000向每孔中转染5-10ng IL-2启动子启动的虫荧光素酶报告载体和2ng海肾荧光素酶载体，并共转染微小RNA前体载体或对照载体、或微小RNA模拟物或小干扰RNA及相应的阴性对照（终浓度为50 nM），24-48 小时后用Dual-Glo luciferase assay system（Promega）检测双荧光素酶的活性。

RNA-染色质免疫共沉淀

将人PBMCs用anti-CD3 (1μg/ml) 和anti-CD28（5μg/ml）刺激48小时后，用预冷的PBS洗一次，用1%甲醛交联后加入0.125M甘氨酸终止，超声裂解后取上清，分别加入anti-RNA Pol II (5 μg)、anti-TBP (5 μg)或血清反应阴性的鼠IgG (5 μg)和50ul蛋白A/G磁珠（Millipore），4℃孵育过夜。用0.5 ml下列预冷缓冲液洗孵育后的混合物：低盐洗液、高盐洗液、LiCl洗液、TE洗液（Millipore），用苯酚/氯仿/异戊醇提取RNA，用TURBO DNAfree kit (Ambion)除去RNA中的DNA，接着混合1 μl RNA、1 μl 32P-γ-ATP （3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, Perkin Elmer）、2 μl 10 x激酶反应缓冲液、1 μl T4多核苷酸激酶（Takara）和15 μl dH2O在 37 °C孵育1小时，将标记的RNA进行变性PAGE电泳，最后用X射线胶片曝光3小时。

基因转录起始速率分析

向HEK293T细胞中转染IL-2启动子启动的虫荧光素酶报告载体及let-7i模拟物或阴性对照（终浓度为50 nM），20小时后收集细胞，加入5 μl 10mCi/ml [α-32P] UTP，用DNase I和蛋白酶K处理后用苯酚/氯仿/异戊醇提取RNA，在尼龙膜上37℃杂交固定过夜，~200 bp GAPDH或RFP探针分别作为上样量和阴性对照。杂交液成分：50% 甲酰胺、6X SSC、10X Denhardt’s 溶液、0.2% SDS。用2X SSC和0.2% SDS将膜洗三次后用磷屏（GE Healthcare）曝光。

微小RNA与核心启动子的体外结合实验

在室温混合20ul反应体系以组装RNA聚合酶II前起始复合物（PIC）：20 mM HEPES、5 mM MgCl2、8%甘油、100 mM KCl、4 μg 乙酰化的BSA、2 μg Poly(dI-dC)·Poly(dI-dC) (Sigma)、20 μg HeLa细胞核提取物、0.4 pmol 放射性同位素标记的双链寡核苷酸，未标记的IL-2核心启动子双链寡核苷酸作为竞争物。加入2-5μg特异性抗体在冰上反应1小时后，用4.5%非变性PAGE在150V条件下进行3.5小时的电泳。进行leti-7i与IL-2核心启动子的体外结合时，放射性同位素标记的双链寡核苷酸变成生物素标记的IL-2核心启动子和非特异性双链寡核苷酸，孵育15分钟组装好PIC后，将复合物加入100 μg MyOne链亲合素C1免疫磁珠(Invitrogen)，洗三次后用20 μl 缓冲液[1M NaCl、5 mM Tris-HCl (pH 7.5)、0.5 mM EDTA]重悬，在室温轻轻旋转孵育15分钟以固定PIC，将磁珠在室温下用0.5 ml 0.1x SSC/0.1% SDS洗三次、每次10分钟，用RNA酶H在37°C下处理10分钟，用40μl洗脱液溶解杂交得到的微小RNA，用Trizol提取RNA并进行实时定量反转录PCR检测。

动物实验

通过尾静脉注射25 nmol agomir-mmu-let-7i或阴性对照处理雌性BALB/cA小鼠（8-10周），48小时后检测血清中的IL-2。

1.2 结构

所获得微小RNA结构如下

hsa-let-7i

5’ ugagguaguaguuugugcuguu 3’

mmu-let-7i

5’ ugagguaguaguuugugcuguu3’

1.3 效果证明及应用

我们发现细胞中大量的微小RNA与聚合酶II核心转录因子RNA聚合酶II结合（图一A），微小RNA芯片分析鉴定了其中许多微小RNA基因（图一B），其中包括hsa-let-7i。此外，我们利用实时荧光定量PCR验证了其中部分与RNA聚合酶II或TATA box结合蛋白（TBP）结合的微小RNA,包括hsa-let-7i（图一C和D）。

微小RNA hsa-let-7i 序列特异性靶向白介素2（IL2）基因启动子TATA box序列并增强白介素2的mRNA及蛋白表达水平。小鼠动物实验表明小鼠微小RNA mmu-let-7i能够增强小鼠血液中白介素2表达水平。计算机预测表明其中许多微小RNA能够结合到基因启动子的TATA box序列上，其中微小RNA has-let-7i能够结合到白介素-2基因启动子TATA box序列上（图二A）。荧光双报告结果表明has-let-7i增强白介素-2基因启动子转录活性（图二B）。在淋巴细胞系Jurkat细胞中，has-let-7i增强白介素-2 mRNA表达（图二C）；在原代CD4+细胞中，has-let-7i增强白介素-2 mRNA及蛋白表达表达（图二D、E）。此外，在小鼠原代CD4+细胞中，mm-let-7i白介素-2 mRNA表达（图二F）。小鼠动物实验表明，mm-let-7i增强小鼠血液中白介素-2表达水平（图二G）。

微小RNA hsa-let-7i增强白介素2表达水平是序列特异性的，其调控效果与微小RNA和基因启动子TATA box序列间的互补性呈正相关。突变白介素-2启动子上的结合位点后，hsa-let-7i上调白介素-2启动子转录活性的效果受到影响（图三A）。相应地，突变hsa-let-7i序列，hsa-let-7i上调白介素-2启动子转录活性的效果也受到影响（图三B）。当同时突变白介素-2启动子上的结合位点和hsa-let-7i序列，并使二者重新匹配时，hsa-let-7i上调白介素-2启动子转录活性的效果得到恢复（图三C）。Let-7i家族其他成员包括hsa-let-7a, hsa-let-7b, hsa-let-7d, hsa-let-7f, hsa-let-7g都能够上调白介素-2启动子转录活性，效果与其与hsa-let-7i的序列相似度相关（图三D）。这些结果表明hsa-let-7i上调白介素-2启动子转录活性是序列特异性的。

微小RNA与基因启动子TATA box序列间能够直接结合，并且导致基因转录起始速率的提高。体外结合实验表明，hsa-let-7i能够与野生型白介素-2启动子DNA结合，而不与突变的白介素-2启动子DNA结合（图四A）。使用RNase H处理后，白介素-2启动子DNA富集到的hsa-let-7i减少，表明两者通过DNA:RNA杂合链结合（图四B）。基因转录起始速率分析表明hsa-let-7i增强白介素-2启动子转录起始速率（图四C），转录延伸速率随之增加（图四D）。

实施例2  微小RNA hsa-miR-138、hsa-miR-92a、hsa-let-7c及hsa-miR-181d分别通过靶向TATA box序列特异性上调胰岛素（insulin）、降钙素（calcitonin）、组蛋白（H4A1）和c-myc 基因的转录活性。

2.1 制备方法

微小RNA及其靶点的计算机预测

    根据实施例1中方法预测并筛选微小RNA与基因启动子结合位点。

质粒、微小RNA模拟物

根据实施例1的方法构建成人胰岛素、CALCA、c-myc、H4-A1等启动子的报告载体。将hsa-mir-181d 的前体序列插入PLKO.1 载体（Sigma）。野生型hsa-miR-138、hsa-miR-92a、hsa-let-7c及相应的阴性对照从广州锐博公司（Ribobio）购买。

双荧光素酶报告分析

根据实施例1中方法，转染所述基因启动子的荧光素酶报告载体和海肾荧光素酶载体，并共转染微小RNA前体载体或对照载体、或微小RNA模拟物或小干扰RNA及相应的阴性对照，24-48 小时后检测双荧光素酶的活性。

2.2 结构

所获得微小RNA结构如下

hsa-miR-138

5’agcugguguugugaaucaggccg 3’

hsa-miR-92a

5’uauugcacuugucccggccugu 3’  

hsa-let-7c

5’ugagguaguagguuguaugguu 3’    

hsa-miR-181d-5p

5’aacauucauuguugucggugggu 3’  

2.3 效果证明及应用

计算机预测表明微小RNA包括hsa-miR-138、hsa-miR-92a、hsa-let-7c及hsa-miR-181d分别能够结合调胰岛素、降钙素、组蛋白（H4A1）和c-myc 基因TATA box序列（图五A）。荧光双报告结果表明hsa-miR-138、hsa-miR-92a、hsa-let-7c及hsa-miR-181d分别能够增强胰岛素、降钙素、组蛋白（H4A1）和c-myc 基因的转录活性（图五B）。

实施例3  人工合成靶向基因TATA box的小干扰RNA特异性增强78.9%基因的转录活性

3.1 制备方法

靶向TATA box小干扰RNA序列设计

在以TATA box序列为中心上下游各延伸20碱基的范围内设计三个包TATA box互补序列的小干扰RNA。

质粒、小干扰RNA模拟物

根据实施例1的方法构建成人白介素2、胰岛素、LHB、POMC、NPPA、IL6、HIV-1病毒、H4A1、APOE、CIRBP、BCL2L12、RHO、CALCA、GAPD和HBB启动子的报告载体。小干扰RNA由及相应的阴性对照由广州锐博公司（Ribobio）合成。

双荧光素酶报告分析

根据实施例1中方法，转染所述基因启动子的荧光素酶报告载体和海肾荧光素酶载体，并共转染微小RNA前体载体或对照载体、或微小RNA模拟物或小干扰RNA及相应的阴性对照，24-48 小时后检测双荧光素酶的活性。

3.2 结构

所获得小干扰RNA序列如下

IL-2TATAcen

5’agaugcaauuuauacuguu 3’

INS-TATAcen

5’cgcuggcuuuauagucuca 3’

LHB-TATAcen 

5’uaucuggcuauauaccucg 3’

POMC-TATAcen

5’ucuguccuuauauacuugc 3’

NPPA-TATAcen

5’cgccucuuuuuauagcccc 3’

IL6-TATAcen

5’uggaaaccuuauuaagauu 3’

HIV-TATAcen            

5’cagcugcuuauauguagca 3’

H4A1-TATAup   

5’Ucuuuauacgacaguuggc 3’

APOE-TATAcen

5’uuguccaauuauagggcuc 3’

CIRBP-TATAup 

5’ucuuauauacgcuuccgcc 3’

BCL2L12-TATAcen  

5’uacaaacuuuauuaguucg 3’

RHO-TATAcen          

5’uccccagacccuuauaaag 3’

CALCA-TATAup      

5’ugcucuuauucccgccgcu 3’

GAPD-TATAdn  

5’ugcucaauuuauagaaacc 3’

HBB-TATAcen          

5’ugcccugacuuuuaugccc 3’

3.3 效果证明及应用

根据制备方法，我们针对19个包含TATA box的基因设计了1-3个小干扰RNA（图六A），荧光双报告结果表明小干扰RNA增强基因转录活性2倍以上的有5个基因；增强基因转录活性1倍以上的有3个基因；增强基因转录活性30%以上的有7个基因。共有15个基因转录活性增强30%以上，占所有验证基因的78.9%（图六A）。在mRNA及蛋白表达水平的验证表明小干扰RNA能够显著增强白介素2 mRNA表达水平（图六 B）及蛋白表达（图六C）。 

实施例4  人工合成靶向基因TATA box的小干扰RNA特异性增强非TATA box基因的转录活性

4.1 制备方法

靶向非TATA box基因核心启动子小干扰RNA序列设计

在转录起始位点上游1-50碱基范围内设计一个靶向核心启动子的小干扰RNA。

质粒、小干扰RNA模拟物

根据实施例1的方法构建成人NGF、APOBR启动子的报告载体。小干扰RNA由及相应的阴性对照由广州锐博公司（Ribobio）合成。

双荧光素酶报告分析

根据实施例1中方法，转染所述基因启动子的荧光素酶报告载体和海肾荧光素酶载体，并共转染微小RNA前体载体或对照载体、或微小RNA模拟物或小干扰RNA及相应的阴性对照，24-48 小时后检测双荧光素酶的活性。

小干扰RNA转染及实时荧光定量PCR检测

根据例1中方法，转染所述小干扰RNA及相应的阴性对照至HEK293T细胞系中，48 小时后用实时荧光定量PCR检测AKT1、CDC25A、ERK2、BMI-1及JNK基因mRNA表达水平。

4.2 结构

所获得小干扰RNA序列如下

si-NGF

5’ gagcugcucucacacaggcuu 3’

si-APOBR

5’ uaaugaccguccccacccacc 3’

si-AKT1 

5’ uccgccccgcgcccgcccc 3’

si- CDC25A

5’ ugcccagcuccggguagca 3’

si- ERK2

5’ uccggcgggcgggcggagg 3’

si- BMI-1

5’ ugaggcgggcgggcggggg 3’

si- JNK              

5’ ugucaccgcgcacgcccgc 3’

  4.3 效果证明及应用

根据制备方法，我们针对7个非TATA box基因的核心启动子各设计了1个小干扰RNA，荧光双报告结果表明小干扰RNA增强NGF、APOBR的基因转录活性（图七A）。在mRNA表达水平的验证表明小干扰RNA能够显著增强AKT1、CDC25A、ERK2、BMI-1及JNK mRNA表达水平（图七 B）。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  中山大学

 

<120>  一种小分子RNA及其制备方法和在特异性上调基因转录活性的药物中的应用

 

<130> 

 

<160>  27   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  22

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

ugagguagua guuugugcug uu                                              22

 

 

<210>  2

<211>  23

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

agcugguguu gugaaucagg ccg                                             23

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

uauugcacuu gucccggccu gu                                              22

 

 

<210>  4

<211>  22

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

ugagguagua gguuguaugg uu                                              22

 

 

<210>  5

<211>  23

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

aacauucauu guugucggug ggu                                             23

 

 

<210>  6

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

agaugcaauu uauacuguu                                                  19

 

 

<210>  7

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

cgcuggcuuu auagucuca                                                  19

 

 

<210>  8

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

uaucuggcua uauaccucg                                                  19

 

 

<210>  9

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

ucuguccuua uauacuugc                                                  19

 

 

<210>  10

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

cgccucuuuu uauagcccc                                                  19

 

 

<210>  11

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

uggaaaccuu auuaagauu                                                  19

 

 

<210>  12

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  12

cagcugcuua uauguagca                                                  19

 

 

<210>  13

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  13

ucuuuauacg acaguuggc                                                  19

 

 

<210>  14

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  14

uuguccaauu auagggcuc                                                  19

 

 

<210>  15

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  15

ucuuauauac gcuuccgcc                                                  19

 

 

<210>  16

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  16

uacaaacuuu auuaguucg                                                  19

 

 

<210>  17

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  17

uccccagacc cuuauaaag                                                  19

 

 

<210>  18

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  18

ugcucuuauu cccgccgcu                                                  19

 

 

<210>  19

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  19

ugcucaauuu auagaaacc                                                  19

 

 

<210>  20

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  20

ugcccugacu uuuaugccc                                                  19

 

 

<210>  21

<211>  21

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  21

gagcugcucu cacacaggcu u                                               21

 

 

<210>  22

<211>  21

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  22

uaaugaccgu ccccacccac c                                               21

 

 

<210>  23

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  23

uccgccccgc gcccgcccc                                                  19

 

 

<210>  24

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  24

ugcccagcuc cggguagca                                                  19

 

 

<210>  25

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  25

uccggcgggc gggcggagg                                                  19

 

 

<210>  26

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  26

ugaggcgggc gggcggggg                                                  19

 

 

<210>  27

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  27

ugucaccgcg cacgcccgc                                                  19