诊断Avellino角膜营养不良的系统

摘要

本发明涉及诊断Avellino角膜营养不良的系统，并且更特别地涉及诊断Avellino角膜营养不良的系统，其中根据输入的第一PCR扩增值和第二PCR扩增值的比例确定样品是否正常或Avellino角膜营养不良。该系统能够以更简单和准确的方式不受医生技术影响地诊断Avellino角膜营养不良。特别是，本发明的系统使整个过程系统化，从而提供了准确的诊断。另外，该系统还能容易地用于许多测试对象。

说明书

技术领域

本发明涉及诊断Avellino角膜营养不良的系统，更特别地涉及一个诊断 Avellino角膜营养不良的系统，其中根据输入的第一PCR扩增值和第二PCR 扩增值的比例确定样品是否正常或Avellino角膜营养不良。

背景技术

角膜营养不良是常染色体显性遗传病，开始时在角膜中央混浊，逐渐传 开，并最终随着患者年龄增长而丧失视力。这一疾病包括Avellino角膜营养 不良，颗粒状角膜营养不良，I型点阵角膜营养不良，Reis-圆盾角膜营养不 良等等，均是编码βIG-H3蛋白质的基因突变引起的。

患有Avellino角膜营养不良的杂合患者随着年龄的增长表现出严重的视 力丧失，并且杂合患者从6岁开始表现出完全丧失视力。Avellino角膜营养 不良是1988年新命名的疾病，是由于发现具有遗传特性而从通常称为颗粒角 膜营养不良的病中分出来的。同时该疾病已知在世界范围中是最常见的角膜 营养不良，根据遗传分析，在韩国流行率是1/340到1/1000（杂合体病例）， 表明这是一种常见的营养不良疾病(Holland,E.J.等人，Ophthalmology，99： 1564，1992；Kennedy,S.M.等人，Br.J.Ophthalmol.,80:489,1996;Dolmetsch,A.M. 等人，Can.J.Ophthalmol.,31:29,1996;Afshari,N.A.等人，Arch.Ophthalmol., 119:16,2001;Stewart,H.S.Hum.Mutat.,14:126,1999)。

本发明人已经发现，如果杂合Avellino角膜营养不良患者进行LASIK外 科手术，约2年后，角膜的混浊度开始逐渐增加并且最终导致视力丧失(Jun, RM等人，Ophthalmolgy,111:463,2004)。过去，进行眼外科手术的期望是 LASIK或Excimer激光外科将能消除患有角膜营养不良的患者的视力模糊。 并且，即便在韩国也已经进行了约300,000例LASIK外科手术，根据患有 Avellino角膜营养不良的杂合患者的最小估计值1/1000计算，这将导致300 人丧失视力。已经进行LASIK外科手术的患者多处在具有劳动力的20多岁 和30多岁；所以，他们丧失视力导致严重的社会和经济问题。另外，自LASIK 外科手术2000年在美国批准后，已经在非裔美籍人中发现进行LASIK外科 手术的Avellino角膜营养不良患者丧失视力，这意味着在世界范围内可能存 大量类似病例。

但是，尽管为了防止LASIK外科手术引起的Avellino角膜营养不良恶化 需要准确地诊断Avellino角膜营养不良，但Avellino角膜营养不良的诊断仅 仅通过显微镜观察角膜浊度来进行，从而使医生会错过患者的潜伏症状而对 其进行LASIK外科手术，进而引起视力丧失。所以，非常需要快速而准确地 诊断角膜营养不良。

另外，在常规诊断中，诊断结果可能会随例如医生的技术和患者的病况 而变化。所以，需要开发出可靠性和准确度都有所提高的诊断方法。

因此，为了提供诊断包括Avellino角膜营养不良在内的要求在强化视力 的外科手术之前能够准确诊断的角膜营养不良的新系统，本发明人进行了大 量努力。结果，本发明人发现，当将第一PCR扩增值与第二PCR扩增值进 行比较，如果第一PCR扩增值是第二PCR扩增值的5-9倍，样品DNA是正 常的，如果第一PCR扩增值与第二PCR扩增值的比例为1：1.5至1.5:1，则 样品DNA是Avellino角膜营养不良杂合体，如果第二PCR扩增值是第一PCR 扩增值的5-9倍，则样品DNA是Avellino角膜营养不良纯合体，其中第一 PCR扩增值是通过向样品DNA中加入能够扩增转化生长因子b-诱导(TGFBI) 基因的外显子4的引物对和能够检测外显子4不含突变的TGFBI基因的探针 而测定的，所述第二PCR扩增值是通过向样品DNA中加入能够扩增TGFBI 基因的外显子4的引物对和能够检测外显子4含突变的TGFBI基因的探针而 测定的。基于这样的发现，完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的一个目的是提供诊断Avellino角膜营养不良的新系统，该系统 能够以更简单和准确的方式不受医生技术影响地诊断Avellino角膜营养不 良。

技术方案

为了实现以上目的，本发明提供了诊断Avellino角膜营养不良的系统， 该系统包括：

(a)客户组(client group)，其包括至少一个客户，将关于样品和分析请求 的信息通过网络传递至包括输入工具(input means)的服务器以请求诊断服 务，并接收和存储Avellino角膜营养不良的测定数据，所述数据是响应请求 从包含输出工具的服务器传递的；

(b)输入工具，用于接收关于样品、分析请求、第一PCR扩增值和第二 PCR扩增值的信息，其中第一PCR扩增值是通过向样品DNA中加入能够扩 增转化生长因子b-诱导(TGFBI)基因的外显子4的引物对和能够检测外显子4 不含突变的TGFBI基因的探针而测定的，所述第二PCR扩增值是通过向样 品DNA中加入能够扩增TGFBI基因的外显子4的引物对和能够检测外显子 4含突变的TGFBI基因的探针而测定的；

(c)分析工具(analysis means)，其中当第一PCR扩增值是第二PCR扩增 值的5-9倍时，样品DNA被测定为正常，当第一PCR扩增值与第二PCR扩 增值的比例是1：1.5至1.5：1时，样品DNA被测定为Avellino角膜营养不 良杂合体，当第二PCR扩增值是第一PCR扩增值的5-9倍时，样品DNA被 测定为Avellino角膜营养不良纯合体；和

(d)输出工具(output means)，用于输出来自分析工具的测定结果。

本发明还提供了包括所述用于诊断Avellino角膜营养不良的系统的计算 机可读介质或媒介。

本发明还提供了包括上述用于诊断Avellino角膜营养不良的系统的计算 机。

本发明同时提供了利用上述诊断Avellino角膜营养不良的系统或上述计 算机可读介质或媒介诊断Avellino角膜营养不良的方法。

本发明的其它特征和实施方案通过下面的详细说明和附加的权利要求书 将更加明显。

附图说明

图1是显示利用PCR扩增数据诊断Avellino角膜营养不良的方法的流程 图。

图2显示了在系统操作员服务器上显示的在线请求信息。

图3显示了利用原始数据计算DNA浓度和纯度的结果。

图4显示了利用第一PCR扩增值和第二PCR扩增值制作的等位基因差 示图，和结果表。

图5是说明用于医疗机构的遗传分析结果的报告的扫描图。

图6是说明用于个人的遗传分析结果的报告的扫描图。

最佳实施方式

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所 属技术领域的普通技术人员通常理解的意义相同。通常，本文所用的术语是 已知的且经常用于本技术领域。

用于本发明的详细说明的主要术语的定义如下。

如本文所用，“Avellino角膜营养不良”还被称为II型颗粒状角膜营养不 良，是常染色体显性遗传病，该病在角膜中央存在混浊症状。这是遗传异常 引起的疾病，其中转化生长因子b诱导(TGFBI)基因的外显子4中的序列CGC 突变成CAC，从而使BIGH3蛋白质的第124位氨基酸精氨酸突变成组氨酸 (R124H)。

如本文所用，术语“杂合体”指突变只存在于由父母传递的一对基因中 的一个基因中的情况。术语“Avellino角膜营养不良杂合体”指突变只存在 于由父母传递的一对转化生长因子b诱导(TGFBI)基因的一个基因中的情况。

如本文所用，术语“纯合体”指突变存在于由父母传递的一对基因中的 情况。术语“Avenillo角膜营养不良纯合体”指突变存在于由父母传递的一 对转化生长因子b诱导(TGFBI)基因中的情况。

如本文所用，“程序”或“计算机程序”通常指遵从特定程序语言的规则 的语法单元，并且由宣告(declaration)和陈述(statement)或指令(instruction)构 成，可分为需要解决或执行某种功能、任务或问题的“代码段”。

如本文所用，“系统”或“计算机系统”通常指一个或多个计算机、周围 设备和进行数据加工的软件。“使用者”或“系统操作员”通常包括为了数据 加工和信息交换目的而使用通过“使用者设备”(例如，计算机，无线设备等) 进入计算机网络的人。“计算机”通常是可以进行包括大量运算操作和逻辑操 作而没有人干预的基本运算的功能单元。

如本文所用，“计算机可读介质”可以是硬盘、软盘、压缩盘、磁性光盘、 随机存取存储器、只读储存器或闪存等等，但不限于此。另外，用于本发明 的计算机可读介质可以包括单个计算机或分布在网络中。在本文中，网络可 以是任何常规网络系统，如LAN(局域网)或WAN(广域网)。可以用于本发明 的网络或服务器可以是已知的网络或服务器形式，如万维网程序或万维网服 务器。

在一个方面，本发明涉及诊断Avellino角膜营养不良的系统，该系统包 括：

(a)客户组，其包括至少一个客户，将关于样品和分析请求的信息通过 网络传递至包括输入工具的服务器以请求诊断服务，并接收和存储Avellino 角膜营养不良的测定数据，所述数据是响应请求从包含输出工具的服务器传 递的；

(b)输入工具，用于接收关于样品、分析请求、第一PCR扩增值和第二 PCR扩增值的信息，其中第一PCR扩增值是通过向样品DNA中加入能够扩 增转化生长因子b-诱导(TGFBI)基因的外显子4的引物对和能够检测外显子4 不含突变的TGFBI基因的探针而测定的，所述第二PCR扩增值是通过向样 品DNA中加入能够扩增TGFBI基因的外显子4的引物对和能够检测外显子 4含突变的TGFBI基因的探针而测定的；

(c)分析工具，其中当第一PCR扩增值是第二PCR扩增值的5-9倍时， 样品DNA被测定为正常，当第一PCR扩增值与第二PCR扩增值的比例是1： 1.5至1.5：1时，样品DNA被测定为Avellino角膜营养不良杂合体，当第二 PCR扩增值是第一PCR扩增值的5-9倍时，样品DNA被测定为Avellino角 膜营养不良纯合体；和

(d)输出工具，用于输出来自分析工具的测定结果。

图1是显示利用PCR扩增数据诊断Avellino角膜营养不良的方法的流程 图，本发明将参考图1来叙述。

优选地，本发明的系统可以包括至少包含一个客户的客户组，其将关于 样品和分析请求的信息通过网络传递至包括输入工具的服务器以请求诊断服 务，并接收和存储Avellino角膜营养不良的测定数据，所述数据是响应请求 从包含输出工具的服务器传递的。

作为样品的信息，可以输入一种或多种样品、客户名称、客户机构名称、 收集日期、收集时间和联系方式。本文所用的样品可以是一种或多种口腔粘 膜细胞、血液和发根。另外，分析请求可以包括遗传测试书面同意书。

另外，可以输入样品的DNA在260nm处的吸光值和在280nm处的吸光 值作为数据，第一计算工具根据吸光值计算样品DNA的浓度和纯度。另外， 本发明的系统可以根据样品和对照组总数计算探针、引物对和蒸馏水的量的 第二计算工具。另外，所计算的样品DNA的浓度和纯度可以用于确定样品 DNA的量。

探针包括可以检测外显子4不含突变的TGFBI基因的探针，和可以检测 外显子4含有突变的TGFBI基因的探针。引物对指能够扩增TGFBI基因的 外显子4的引物对。同时，作为进行PCR的试剂，可以使用Taq聚合酶、dNTP、 MgCl₂、PCR缓冲液等等。

能够扩增TGFBI基因的外显子4的引物对是能够扩增TGFBI基因的密 码子124的位置的引物对并且优选地是SEQ ID NOS：1和2所示的引物对。 另外，能够检测外显子4不含突变的TGFBI基因的探针是能够检测在密码子 124含有“CGC”的TGFBI基因的探针，并且优选地是DEQ ID NO:3所示 的探针。另外，能够检测外显子4含有突变的TGFBI基因的探针是能够检测 在密码子124含有“CAC”的TGFBI基因的探针，并且优选地是SEQ ID NO:4 所示的探针。

扩增TGFBI基因的密码子124的引物对

SEQ ID NO:1:5’-TCCACCACCACTCAGCTGTA-3’

SEQ ID NO:2:5’-CCATCTCAGGCCTCAGCTT-3’

检测在密码子124含有“CGC”的TGFBI基因的探针

SEQ ID NO:3:5’-CACGGACCGCACGGA-3’

检测在密码子124含有“CAC”的TGFBI基因的探针

SEQ ID NO:4：5’-CACGGACCACACGGA-3’

本发明用于诊断Avellino角膜营养不良的系统可以另外包括一个PCR仪 器，其根据所计算的探针、引物对和蒸馏水的量，输出第一PCR扩增值和第 二PCR扩增值，其中第一PCR扩增值是通过向样品DNA中加入能够扩增转 化生长因子b-诱导(TGFBI)基因的外显子4的引物对和能够检测外显子4不 含突变的TGFBI基因的探针而测定的，所述第二PCR扩增值是通过向样品 DNA中加入能够扩增TGFBI基因的外显子4的引物对和能够检测外显子4 含突变的TGFBI基因的探针而测定的。PCR仪器可以包括其中设定的实时 PCR程序。

为了快速处理，在样品DNA中同时加入能够扩增TGFBI基因的外显子 4的引物对，能够检测外显子4中不含突变的TGFBI基因的探针和能够检测 外显子4中有突变的TGFBI基因的探针以进行PCR，从而可以同时得到第 一PCR扩增值和第二PCR扩增值。

将输出的第一PCR扩增值和第二PCR扩增值输入输入工具。当分析工 具测定第一扩增值是第二PCR扩增值的5-9倍时，样品被测定为正常，当第 一PCR扩增值与第二PCR扩增值的比例是1：1.5至1.5:1，样品被测定为 Avellino角膜营养不良杂合体。另外，当第二PCR扩增值是第一PCR扩增值 的5-9倍时，样品被测定为Avellino角膜营养不良纯合体。优选地，当第一 PCR扩增值是第二PCR扩增值的7-8倍时，样品被测定为正常，当第二PCR 扩增值是第一PCR扩增值的7-8倍时，样品被测定为Avellino角膜营养不良 纯合体。

本发明的系统可以进一步包括一个显示工具(display means)，其提供二维 等位基因差示图，其中第一PCR扩增值和第二PCR扩增值沿两条轴作图。 在二维等位基因差示图中，第一PCR扩增值沿X轴作图，第二PCR扩增值 沿Y轴作图。当PCR扩增值位于图右较低部分时，样品被测定为正常，当 PCR扩增值位于图左较高部分时，样品被测定为Avellino角膜营养不良纯合 体。

实施例

以下将参考实施例对本发明作进一步详细描述。对于本领域技术的普通 技术人员显然的是，这些实施例仅用于说明而不构成本发明范围的限制。

实施例1：诊断Avellino角膜营养不良的实施例

1-1：输入关于样本和分析请求的信息

包括个体客户或从个体客户收集样品的医疗机构的客户组将关于样品和 分析请求的信息传递到系统的操作员服务器上。

本文中，作为样品信息，输入样品种类、客户名称、机构名称、收集日 期、收集时间和联系方式等等，样品的种类根据收集的形式，选自全血、口 腔表皮和发根。另外，在准备分析请求之前，准备遗传测试书面同意书。

如图2中显示了关于展示在系统操作员的服务器上的在线请求信息。

1-2：样品DNA的浓度和纯度的计算

根据本发明的诊断Avellino角膜营养不良的系统包括用于计算样品DNA 的浓度和纯度的第一计算工具。

可以将能够检测样品DNA在260nm处的吸光值和280nm处的吸光值的 Genios仪器(TECAN,奥地利)与本发明的系统连接。在与所述仪器连接的系 统操作员的仪器(计算机)中执行XFluor4程序(TECAN,奥地利)，以测定吸光 值并计算DNA的浓度和纯度。

具体地，在‘XFluor4->Edit->Measurement parameter’中，选择 ‘Absorbance’。然后，在‘Meas.params’中,将光吸收波长设定为260nm， “Number of reads”设置在2左右，然后点击OK按钮。然后，当点击 ‘XFluor4->Start measurement’，测定260nm处的吸光值。

同时，在‘XFluor4->Edit->Meas.params’中，将光吸收波长设定为280nm, ‘Number of reads’设置在2左右，然后，点击OK按钮。然后，点击 ‘XFluor4->Start measurement’，测定280nm处的吸光值。

在OD₂₆₀=1时，双链DNA的浓度约50ng/ul。所以，通常通过在260nm 处的值减去空白值，将结果乘以50，计算DNA的浓度。此外，在测定了260nm 和280nm处的吸光值后，根据两者(OD₂₆₀/OD₂₈₀)的比例可以测定DNA的纯 度。通常，当OD₂₆₀/OD₂₈₀的比例在1.8和2.0之间时，认为DNA的纯度好。

图3显示了利用原始数据计算DNA的浓度和纯度的结果。

1-3：计算用于PCR扩增的样品、引物对、蒸馏水等等的量，和PCR扩增值的输出

本发明诊断Avellino角膜营养不良的系统包括用于计算PCR扩增的样品 DNA量的第二计算工具和PCR仪器。

在制备之前，通过将样品、正常对照(NN)组、Avellino角膜营养不良杂 合体(HN)、Avellino角膜营养不良纯合体(HH)和阴性对照(NTC)的数量相加， 然后加0.2ul降低损失，从而计算探针、引物对和蒸馏水的量。根据计算的 样品DNA的浓度和纯度确定样品DNA的量。

扩增TGFBI基因的外显子4的突变区域(即，密码子124位置)的引物对， 与具有突变的正常基因片段结合的探针(即，用于检测在密码子124含有 “CGC”的TGGBI基因的探针)和与含有突变的基因片段结合的探针(即，用 于检测在密码子124含有“CAC”的TGFBI基因的探针)如下。本文中，用 VIC标记与没有突变的正常基因片段结合的探针，用FAM标记与有突变的 基因片段结合的探针。另外，结合最小沟结合物(MGB)以促进与互补基因片 段的结合。

扩增TGFBI基因的密码子124位置的引物对

SEQ ID NO:1:5’-TCCACCACCACTCAGCTGTA-3’

SEQ ID NO:2:5’-CCATCTCAGGCCTCAGCTT-3’

检测在密码子124含有“CGC”的TGFBI基因的探针

SEQ ID NO:3:5’-CACGGACCGCACGGA-3’

检测在密码子124含有“CAC”的TGFBI基因的探针

SEQ ID NO:4:5’-CACGGACCACACGGA-3’

然后，为了从PCR仪器(Applied Biosystems)得到PCR值，进行了实时 PCR程序。具体地，当双击RT-PCR仪器中的2.0版step-one软件并点击 ‘Advanced setup’时，出现了‘Experiment Properties’。然后，选择‘Step one^TMInstrument(48wells),Genotyping’。在‘Experiment Properties’行下的‘Plate  Setup’中，点击‘ACD probe’进行‘SNP Assay’。在显示48孔平板的屏幕上 A栏的第1行命名为ACD1，A栏的第2行命名为ACD2，并且以这种方式， 对48个孔均进行命名。在‘Run Method’中循环次数改成36次。

在PCR反应中，使用了含有0.0625μl的引物、5μl的探针、2.9375μl的 蒸馏水和2μl的样品DNA的总混合物。实验条件设置如下。

温度条件

读之前：60℃30秒；

保持：95℃10分钟；

循环，36个循环，每个包括95℃3-15秒和60℃30-60秒；和

读后：60℃30秒。

1-4：根据PCR扩增值确定Avellino角膜营养不良

如图4所示，将实施例1-3中的VID阳性值(通过加入用于扩增TGFBI 基因的外显子4的引物对和结合正常基因片段的探针测定的第一PCR扩增值) 和FAM阳性值(通过加入扩增TGFBI基因外显子4的引物对和结合突变基因 片段的探针测定的第二PCR扩增值)以等位基因差示图表示。

当通过本发明的系统的分析工具，第一PCR扩增值为第二PCR扩增值 的5-9倍时，样品DNA被测定为正常。当第一PCR扩增值与第二PCR扩增 值的比例是1：1.5至1.5-1时，样品DNA被测定为Avellino角膜营养不良杂 合体，当第二PCR扩增值是第一PCR扩增值的5-9倍时，样品DNA被测定 为Avellino角膜营养不良纯合体。样品是否正常以图4左边的颜色来表示。

1-5：Avellino角膜营养不良测定结果的输出和传递

如图5所示，在屏幕上输出实施例1-4中的测定结果。如图6所示，可 以针对每个个体记录输出结果。这样的结果通过网络传递到发送样品和分析 请求信息的客户组。

工业应用

如上所述，本发明用于诊断Avellino角膜营养不良的系统是新诊断系统， 该系统能够以更简单和准确的方式不受医生技术影响地诊断Avellino角膜营 养不良。特别是，它使整个过程系统化，并因此提供了准确的诊断。另外， 该系统也可以容易地施用于许多测试对象。

虽然参考具体特征对本发明进行了详细地描述，但对本领域的技术人员 显而易见的是，这一描述仅仅针对优选的实施方案，不限制本发明的范围。 所以本发明的实质范围将由附加的权利要求书和它的等同物确定。

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附电子文件。