类固醇激素的涡旋辅助中空纤维膜液相微萃取方法

摘要

本发明公开了一种类固醇激素的涡旋辅助中空纤维膜液相微萃取的方法，即利用涡旋为辅助手段加快被分析物在各相中的传质平衡，超分子溶剂为萃取剂对多种类固醇激素进行萃取，是一种新型的中空纤维膜液相微萃取技术；与传统的基于中空纤维膜液相微萃取技术相比，该方法萃取时间缩短，操作简单，富集倍数高，能有效地与干扰物质分离，适用于不同样品中类固醇激素的检测，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学前处理与预富集技术领域，涉及一种有效的新型类固醇激素的涡旋辅助中空纤维膜液相微萃取的方法。 

背景技术

雌激素和肾上腺皮质素都属于类固醇激素，在维持生命、调节性功能，对机体发展、免疫调节、皮肤疾病治疗及生育控制方面有明确的作用，具有极重要的医药价值。目前，中国，日本，欧盟都对雌激素和肾上腺皮质素规定了最大残留量，而且我国还将部分肾上腺皮质素规定为违禁药物。 2002年3月，我国农业部公布《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》，并将8种同化性激素（去甲雄三烯醇酮、甲基睾丸酮、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙、醋酸甲羟孕酮、苯甲酸雌二醇、己烯雌酚和玉米赤霉醇）列为禁用兽药。 

目前，类固醇激素检测使用的样品前处理和预富集技术主要有分散液-液微萃取(DLLME)、固相萃取(SPE)、固相微萃取（SPME）、浊点萃取（CPE）、超声波提取 (USE)等。本发明采用的中空纤维膜液相微萃取技术，集采样、萃取、浓缩为一体，能有效地与干扰物质分离，是一种简便、快速、有效的分析方法。在已有技术的基础上，一是采取涡旋代替搅拌作为辅助手段，操作更简便，大大缩短了萃取时间；二是采用超分子溶剂作为萃取剂，由于氢键作用力和分子间作用力，有效的提高了萃取率，较传统的搅拌辅助中空纤维膜液相微萃取具有更明显的优势。 

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的类固醇激素的涡旋辅助中空纤维膜液相微萃取的方法，该方法对基体复杂的样品采用中空纤维膜液相微萃取对目标物进行前处理和富集，萃取多种类固醇激素，具有操作简单，快速，富集倍数高等特点。 

本发明方法按如下步骤进行： 

（1）样品处理：将含有类固醇激素样品加入沉淀剂，混匀，离心，取出上清液，备用； 

（2）截取2-8cm的中空纤维膜，在丙酮中超声处理5-10min，风干备用； 

（3）超分子溶剂制备：将萃取剂和辅助萃取剂加入到蒸馏水中，涡旋混合1-5min，离心分相，上层溶液即为超分子溶剂，其中萃取剂、辅助萃取剂和水的体积比为2：8：90；

（4）将风干的中空纤维膜在步骤（3）所制得的超分子溶剂中浸泡0.5-1.0min；

（5）用微量注射器向中空纤维膜空腔中注满超分子溶剂，两端热封后，置于盛有步骤（1）处理后样品溶液中，涡旋处理1-5min；

（6）萃取完毕后，取出纤维膜剪开两端置于干净容器中，用微量注射器吸取洗脱剂将萃取剂从纤维膜中冲出，定容至50μL，结合后续仪器进行含量测定。

本发明方法中所述类固醇激素为雌二醇、雌酮、己烯雌酚、黄体酮、地塞米松、曲安奈德、丙酸倍率米松、丁酸氢化可的松、苯丙酸诺龙、泼尼松、醋酸可的松、甲基泼尼松龙中的一种或几种。 

本发明中所述沉淀剂为乙腈、硫酸锌、氯化钠、醋酸铅中一种或几种，乙腈添加量为0.2-2.5mL/mL，硫酸锌、氯化钠、醋酸铅的添加量为0.02-0.5g/mL。 

本发明中所述步骤（1）、（3）中离心时间为5-15min，离心速率3000-6000r／min。 

本发明中所述超声频率30-80Hz。 

本发明中所述中空纤维膜为聚丙烯材质，壁厚200-300μm，孔径0.2-0.3μm。 

本发明中所述萃取剂为正丁醇、异丁醇、戊醇、己醇、庚醇、正辛醇、异辛醇、癸醇、十一醇、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸中的一种。 

本发明中所述辅助萃取剂为1-丁基-3-甲基-咪唑四氟硼酸盐、四氢呋喃、氢氧化四丁氨基中的一种，洗脱剂为甲醇、乙醇、乙腈中的一种。 

相对于现有技术，本发明具有以下显著优点： 

1、本方法采用超分子溶剂代替传统的有机醇为萃取剂对多种类固醇激素(雌二醇、雌酮、己烯雌酚、黄体酮、地塞米松、曲安奈德、丙酸倍率米松、丁酸氢化可的松、苯丙酸诺龙、泼尼松、醋酸可的松、甲基泼尼松龙)进行萃取，利用氢键和分子间作用力，有效的提高了被分析物的萃取率；

    2、本发明提供了一种新型的中空纤维膜液相微萃取体系，采用涡旋作为辅助手段，与传统的搅拌辅助萃取相比，萃取时间大大缩短，操作更简便，有机溶剂用量少，富集倍数高，集采样、萃取、浓缩为一体；由于超分子溶剂在中空纤维膜内部，对机体复杂的样品净化效果较好，是一种简便、快速、有效的分析方法。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于此。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于此。 

实施例1：利用本发明方法萃取人体血液中肾上腺皮质激素(地塞米松，丙酸倍率米松，丁酸氢化可的松，苯丙酸诺龙，醋酸可的松，甲基泼尼松龙)，具体操作如下： 

（1）取0.5mL的血样于5ml离心管中，按每个标准品100ng/mL的添加量，加入地塞米松、丙酸倍率米松、丁酸氢化可的松、苯丙酸诺龙、醋酸可的松、甲基泼尼松龙混标后，混匀，离心，取上清液加入1.2mL乙腈、0.2g硫酸锌，稀释至刻度，混匀，在转速5000r/min条件下离心分离5min，取出上清液用蒸馏水稀释至5mL，备用；

   （2）截取2cm的中空纤维膜（聚丙烯材质，壁厚200-300μm，孔径0.2-0.3μm），置于丙酮中在80Hz超声5min，风干备用； 

（3）超分子溶剂制备：将0.1ml正丁醇和0.4ml 1-丁基-3-甲基-咪唑四氟硼酸盐加入到4.5ml蒸馏水中，涡旋混合1min，3000rmp下离心8min分相，上层溶液即为超分子溶剂；

    （4）将风干的中空纤维膜在步骤（3）所配超分子溶剂中浸泡0.5min，使超分子溶剂充分浸入中空纤维膜外孔壁中；

    （5）用微量注射器向纤维膜空腔中注满步骤（3）所配超分子溶剂，两端封闭，置于盛有步骤（1）处理后样品溶液中，涡旋混合2min；

（6）取出纤维膜剪开两端置于干净离心管中，用微量注射器吸取甲醇将萃取剂冲出，定容为50μL，结合高效液相色谱进行含量测定；

（7）液相色谱条件，流动相：乙腈，甲酸；梯度洗脱：0-6 min，80% (v/v)乙腈，6.5-8 min，90% (v/v)乙腈；流速：0.8 mL min-1；进样量：10 μL；柱温：35℃；检测波长：240 nm；

（8）工作曲线制作：取1μg/mL的标准母液按比例配制成1.00、10.00、50.00、100.00、150.00、200.00、250.00、300.00 ng/mL等不同浓度的地塞米松，曲安奈德，丙酸倍率米松，丁酸氢化可的松，苯丙酸诺龙，醋酸可的松，甲基泼尼松龙混合标样，进行色谱分析；

（9）相同色谱条件下，将步骤（6）经中空纤维萃取后的样品进行测定，结果见表1；

表1：HPLC测定结果

                                                    

实施例2：利用本发明方法萃取人体尿液中的雌激素(雌二醇、雌酮、己烯雌酚、黄体酮)，具体操作如下：

（1）取5mL尿样于离心管中，按每个标准品100ng/mL的添加量，加入雌二醇、雌酮、己烯雌酚、黄体酮混标后，加入1.0mL乙腈、0.1g氯化钠，混匀，在转速3000r/min条件下离心分离10min，取出上清液用蒸馏水稀释至5mL，备用；

   （2）截取5cm的中空纤维膜，置于在丙酮中在60Hz超声7min，风干备用；  

   （3）超分子溶剂制备：将0.2ml癸酸和0.8ml 1-丁基-3-甲基-咪唑四氟硼酸盐加入到9ml蒸馏水中，涡旋混合3min，4500rmp下离心10min分相，上层溶液即为超分子溶剂； 

   （4）将风干的中空纤维膜在步骤（3）所配超分子溶剂中浸泡1min，使超分子溶剂充分浸入中空纤维膜外孔壁中；

   （5）用微量注射器向纤维膜空腔中注满步骤（3）所配超分子溶剂，两端封闭，置于盛有步骤（1）处理后样品溶液中，涡旋混合5min；

（6）取出纤维膜剪开两端置于干净离心管中，用微量注射器吸取乙腈将萃取剂冲出定容为50μL，结合高效液相色谱进行含量测定；

（7）液相色谱条件，流动相：乙腈，水；梯度洗脱：0-4.5 min，35% (v/v)乙腈，4.5-12 min，55% (v/v)乙腈；流速：1.0 mL min-1；进样量：20 μL；柱温：25℃；检测波长：280 nm；

（8）工作曲线制作：取1μg/mL的标准母液按比例配制成1.00、10.00、50.00、100.00、150.00、200.00、250.00、300.00 ng/mL等不同浓度的雌二醇、雌酮、己烯雌酚、黄体酮混合标样，进行色谱分析；

（9）相同色谱条件下，将步骤（6）经中空纤维萃取后的样品进行测定，结果见表2；

表2：HPLC检测结果

    

实施例3：利用本发明方法萃取牛奶中的雌激素(雌二醇、雌酮、己烯雌酚)，具体操作如下：

（1）取5mL奶样于5mL离心管中，按每个标准品100ng/mL的添加量，加入雌二醇、雌酮、己烯雌酚混标后，加入2.0mL乙腈和0.5g醋酸铅，混匀，在转速4500r/min条件下离心分离5min，取出上清液用蒸馏水稀释至5mL，备用；

    （2）截取8cm的中空纤维膜，置于丙酮中40Hz超声9min，风干备用； 

（3）超分子溶剂制备：将0.15ml异辛醇和0.6ml四氢呋喃加入到6.75ml蒸馏水中，涡旋混合5min，4000rmp下离心10min分相，上层溶液即为超分子溶剂；

    （4）将风干的中空纤维膜在步骤（3）所配超分子溶剂中浸泡1min，使超分子溶剂充分浸入中空纤维膜外孔壁中；

    （5）用微量注射器向纤维膜空腔中注满步骤（3）所配超分子溶剂，两端封闭，置于盛有步骤（1）处理后样品溶液离心管中，涡旋混合4min；

（6）取出纤维膜剪开两端置于干净离心管中，用微量注射器吸取乙醇将萃取剂冲出定容为50μL，结合高效液相色谱进行含量测定；

（7）液相色谱条件，流动相同实施例2中步骤（7），工作曲线制作方法同实施例2中步骤（8）；

（8）相同色谱条件下，将步骤（6）经中空纤维萃取后的样品进行测定，结果见表3；

表3：HPLC检测结果

    

实施例4：利用本发明方法萃取人体尿液中肾上腺激素(地塞米松，曲安奈德，丙酸倍率米松，丁酸氢化可的松，苯丙酸诺龙)，具体操作如下：

（1）取5mL尿样于5mL离心管中，按每个标准品100ng/mL的添加量，加入地塞米松、曲安奈德，丙酸倍率米松，丁酸氢化可的松，苯丙酸诺龙混标后，混匀，加入1.5mL乙腈和0.3g氯化钠，混匀，在转速3500r/min条件下离心分离7min，取出上清液用蒸馏水稀释至5mL，备用；

    （2）截取4.5cm的中空纤维膜，在丙酮中30Hz超声10min，风干备用； 

    （3）超分子溶剂制备：将0.5ml己酸和2ml氢氧化四丁氨基加入到9ml蒸馏水中，涡旋混合4min，4500rmp下离心8min分相，上层溶液即为超分子溶剂；

    （4）将风干的中空纤维膜在步骤（3）所配超分子溶剂中浸泡0.6min，使超分子溶剂充分浸入中空纤维膜外孔壁中；

    （5）用微量注射器向纤维膜空腔中注满步骤（3）所配超分子溶剂，两端封闭，置于盛有步骤（1）所制样品溶液离心管中，涡旋混合1min；

（6）取出纤维膜剪开两端置于干净离心管中，用微量注射器吸取乙腈将萃取剂冲出定容为50μL，结合高效液相色谱进行含量测定；

（7）液相色谱条件，流动相同实施例1中步骤（7），工作曲线制作方法同实施例1中步骤（8）；

（8）相同色谱条件下，将步骤（6）经中空纤维萃取后的样品进行测定，结果见表4；

表4：HPLC检测结果

    

实施例5：利用本发明方法萃取人体尿液中肾上腺激素(丁酸氢化可的松、苯丙酸诺龙、泼尼松、醋酸可的松、甲基泼尼松龙)，具体操作如下：

（1）取8mL尿样于5离心管中，按每个标准品100ng/mL的添加量，加入丁酸氢化可的松、苯丙酸诺龙、泼尼松、醋酸可的松、甲基泼尼松龙混标后，混匀，离心，取上清液加入1.4mL乙腈和0.2g氯化钠，混匀，在转速5000r/min条件下离心分离10min，取出上清液用蒸馏水稀释至5mL，备用；

    （2）截取5.5cm的中空纤维膜，在丙酮中50Hz超声8min后风干； 

（3）超分子溶剂制备：将0.1ml十一醇和0.4ml1-丁基-3-甲基-咪唑四氟硼酸盐加入到4.5ml蒸馏水中，涡旋混合2min，3000rmp下离心8min分相，上层溶液即为超分子溶剂；

    （4）将风干的中空纤维膜在步骤（3）所配超分子溶剂中浸泡0.8min，使萃取剂充分浸入中空纤维膜外孔壁中；

    （5）用微量注射器向纤维膜空腔中注满步骤（3）所配超分子溶剂，两端封闭，置于盛有步骤（1）所制样品溶液离心管中，涡旋混合3min；

（6）取出纤维膜剪开两端置于干净离心管中，用微量注射器吸取乙腈将萃取剂冲出定容为50μL，结合高效液相色谱进行含量测定；

（7）液相色谱条件，流动相同实施例1中步骤（7），工作曲线制作方法同实施例1中步骤（8）；

（8）相同色谱条件下，将步骤（6）经中空纤维萃取后的样品进行测定，结果见表5；

表5：HPLC检测结果

    

实施例6：利用本发明萃取废水中的雌激素(雌二醇、雌酮、己烯雌酚) ，具体操作如下：

（1）取10mL废水样于离心管中，同实施例1加入雌二醇、雌酮、己烯雌酚混标；

    （2）截取5cm的中空纤维膜，在丙酮中40Hz超声8min后风干； 

    （3）加0.2mL异辛醇，0.8mL四氢呋喃和9mL蒸馏水于离心管中，涡旋混合5min后在3500rmp下离心10min，上层溶液为超分子溶剂；

    （4）将风干的中空纤维膜在步骤（3）所配超分子溶剂中浸泡1min，使超分子溶剂充分浸入中空纤维膜外孔壁中；

    （5）用微量注射器向纤维膜空腔中注满步骤（3）所配超分子溶剂，两端封闭，置于盛有步骤（1）所制样品溶液离心管中，涡旋混合4min；

（6）取出纤维膜剪开两端置于干净离心管中，用微量注射器吸取乙醇将萃取剂冲出定容为50μL，结合高效液相色谱进行含量测定；

（7）液相色谱条件，流动相同实施例1中步骤（7），工作曲线制作方法同实施例1中步骤（8）；

（8）相同色谱条件下，将步骤（6）经中空纤维萃取后的样品进行测定，结果表6；

表6：HPLC检测结果

    

实施例7：利用本发明萃取人体血液中的雌激素(雌二醇、己烯雌酚、黄体酮)，具体操作如下：  

（1）取1.0mL的血样于5mL离心管中，按每个标准品100ng/mL的添加量，加入雌二醇、己烯雌酚、黄体酮混标后，混匀，离心，取上清液加入1.8mL乙腈、0.4g硫酸锌，稀释至刻度，混匀，在转速6000r/min条件下离心分离5min，取出上清液用蒸馏水稀释至5mL，备用；    

（2）截取8.0cm的中空纤维膜，在丙酮中60Hz超声8min后风干； 

   （3）超分子溶剂制备：将0.4ml辛酸和1.6ml四氢呋喃加入到18ml蒸馏水中，涡旋混合1min，5500rmp下离心5min分相，上层溶液即为超分子溶剂；

   （4）将风干的中空纤维膜在步骤（4）所配超分子溶剂中浸泡0.5min，使超分子溶剂充分浸入中空纤维膜外孔壁中；

   （5）用微量注射器向纤维膜空腔中注满步骤（3）所配超分子溶剂，两端封闭，置于盛有步骤（1）所制样品溶液离心管中，涡旋混合3.5min；

（6）取出纤维膜剪开两端置于干净离心管中，用微量注射器吸取乙腈将萃取剂冲出定容为50μL，结合后续高效液相色谱仪进行含量测定；

（7）液相色谱条件，流动相同实施例2中步骤（7），工作曲线制作方法同实施例2中步骤（8）；

（8）相同色谱条件下，将步骤（6）经中空纤维萃取后的样品进行测定，结果见表7；

表7：HPLC检测结果

    

实施例7：萃取效果用高效液相色谱法紫外检测器测定验证并与液液萃取和搅拌辅助中空纤维膜液相微萃取比较结果见表8：

表8：本发明方法与其他萃取方法比较结果

由表8结果可知：利用本发明萃取人体血液中的雌激素(雌二醇、己烯雌酚、黄体酮)并结合高效液相色谱法进行检测，检测结果说明方法具有可靠性。本发明萃取雌激素的方法方便快速，富集倍数高，其优点是其它方法很难达到的。