以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备及其应用

摘要

本发明公开了一种以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备及其应用，该疫苗的制备包括以下步骤：(1)首先通过分子生物学方法构建整合了微基因与自转运系统的重组疫苗载体；(2)将步骤(1)所述的重组疫苗载体电转化入减毒沙门氏菌SL7207中，构建出重组口服肿瘤疫苗。本发明首次将微基因与自转运系统整合到同一个载体上，通过电转化沙门氏菌获得了口服肿瘤疫苗，通过小鼠肿瘤模型，验证了该疫苗对肿瘤的免疫预防效果；从而可以将其应用在制备肿瘤的免疫预防药物领域中。

说明书

技术领域

本发明涉及一种小鼠肿瘤疫苗的制备，特别涉及一种以减毒沙门氏菌为载体的基于微基因与自转运系统的口服肿瘤疫苗的制备及其应用。 

背景技术

免疫系统主要通过CD8+ T细胞介导细胞毒T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte, CTL) 效应来杀灭肿瘤细胞。越来越多的研究表明，CD4+ T细胞在抗肿瘤免疫方面也起着关键的作用。CD4+ T细胞可通过TRAIL依赖机制控制记忆性CD8+ T细胞的产生，肿瘤特异性的CD4+ T细胞能维持CD8+ T细胞的免疫记忆、提高CD8+ T细胞的肿瘤浸润水平。然而，目前往往需要将多种疫苗联合使用，才能诱导出高水平的CD4+ 和CD8+ T细胞应答；而且，目前设计的疫苗往往需要通过注射的途径进行多次免疫，这些都限制了肿瘤疫苗的实际应用。 

肿瘤的微基因疫苗是将肿瘤的多个表位串联构建而成的DNA疫苗。该疫苗胞内合成抗原，易被MHCⅠ类分子递呈，能激发CD8+ T细胞反应。而且，微基因疫苗以表位为基础，去除无关成分，比传统的DNA疫苗效率、纯度和安全性更高。在表位上游加入编码泛素标签基因，可以进一步提高蛋白酶体对表位的降解并可诱导出比传统DNA疫苗更强的CD8+ T细胞反应。 

AIDA-Ⅰ表面展示系统是一种高效的细菌自转运蛋白系统，由信号肽、N端的“乘客”蛋白及C端的β结构域三个功能区组成。该蛋白的C端β结构域可在革兰氏阴性菌表面形成桶状结构，不需要其它辅助因子和能量，即可通过桶状结构将其N端的“乘客”蛋白牵引到革兰氏阴性菌的外膜上，展示于细菌表面的抗原，由于空间构象优势，更易被免疫系统识别，能诱导机体产生高水平的CD4+ T细胞反应。 

微基因疫苗能够激发高水平的CD8+ T细胞应答，而AIDA-I系统在激发CD4+ T细胞反应方面亦具有优势，但是目前未见将AIDA-I表面展示系统与微基因疫苗整合于同一肿瘤疫苗载体中的报道。 

另外，活疫苗载体包括病毒及细菌载体，与病毒载体相比，沙门氏菌感染的组织更广，因此可以将抗原递呈到更多的组织部位；而且可以通过抗生素来控制感染的程度和范围，因而比病毒载体更加安全。沙门氏菌可以与DC及巨噬细胞的多种toll 样受体(toll-like receptor, TLR)结合，具有免疫佐剂的作用。 

发明内容

本发明的发明目的是提供一种以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备方法，由此制备的肿瘤疫苗能同时激发机体高水平的CD4+ 和CD8+ T细胞应答，可用于制备肿瘤的免疫预防药物。 

本发明的思路为通过PCR方法从大肠杆菌E393中扩增出AIDA-1表达元件，将黑色素瘤的Melan-A基因克隆入AIDA-1表达元件中；同时从pVAX1质粒中扩增出CMV真核表达元件，并将泛素化标签和黑色素瘤的2个CD8表位克隆入CMV真核表达元件；将上述的两种表达元件整合到同一个质粒载体中，构建出目标重组质粒；将得到的目标重组质粒电转化入减毒沙门氏菌得到口服肿瘤疫苗。 

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤： 

(1) 包含Melan-A抗原的AIDA-I表面展示原件的构建：

通过PCR方法从大肠杆菌E393中扩增出AIDA-1表达元件的质粒pMK90，用KpnI和XbalI双酶切该质粒，回收载体大片段；设计特异性引物Seq NO.1和SeqNO.2，以B16细胞的cDNA为模板，扩增出Melan-A基因，分别用KpnI和XbalI双酶切，回收产物并将其与上述回收的载体大片段连接；将连接产物转化至DH10B的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；取该质粒进一步测序鉴定其编码基因序列，取测序鉴定正确的阳性质粒命名为pBMA；

(2) 微基因疫苗片段的构建：

 获取CMV真核表达元件：根据pVAX1载体的序列，设计引物Seq NO.3和Seq NO.4，通过PCR扩增出CMV真核表达元件；利用凝胶回收试剂盒回收CMV真核表达元件；将回收所得PCR产物与pMD19-T simple克隆载体连接、4℃连接过夜；取连接产物转化至DH10B的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；取该质粒进一步测序鉴定其编码基因序列，取测序鉴定正确的阳性质粒命名为pCMV；

 泛素化标签与黑色素瘤CD8表位融合基因的获取：合成引物Seq NO.5和Seq NO.6，以小鼠的肝脏DNA为模板，进行PCR扩增，获得的PCR产物经HindIII和XhoI双酶切，回收产物；

将pCMV用HindIII和XhoI双酶切，回收载体片段，并与中的回收产物连接、转化至DH10B的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；取该质粒进一步测序鉴定其编码基因序列，取测序鉴定正确的阳性质粒命名为pU；

(3) 整合了微基因与AIDA-1自转运系统的重组疫苗载体的构建：

用AgeI分别酶切pU与pBMA，然后将pU经AgeI酶切后的小片段及pBMA经AgeI酶切后的大片段分别回收并连接，连接产物转化至DH10B的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；取该质粒进一步测序鉴定其编码基因序列，取测序鉴定正确的阳性质粒为目标载体pV；

(4)以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备：通过电转化的方法将pV转化入减毒沙门氏菌SL7207，通过PCR鉴定出阳性转化子，即为所述的以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗；

所述引物Seq NO.1为ggtacctgccccaagaagaca；

Seq NO.2为tctcagaggtgaataaggtggc；

Seq NO.3为accggtggagttccgcgttaca；

Seq NO.4为accggtcagtagaagccatagag；

Seq NO.5为aagcttatgcagatctttgtgaag；

Seq NO.6为：

ctcgagtcataaccacacaaaaaaatcgtacactgagtaagcagctaataaatggtaccgatgccagttagcaccccgaagtctcaac。

上述技术方案中，步骤(1)中，以B16细胞的cDNA为模板，PCR扩增出Melan-A基因的条件为：94℃ 4min；94℃ 15s，62℃ 30s，72℃ 1min ，3个循环；94℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 1min ，5个循环；94℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 1min ，5个循环；94℃ 15s，56℃30s，72℃ 1min ，5个循环；94℃ 15s，54℃30s，72℃ 1min ，25个循环； 72℃ 10min；12℃ 30min；步骤(2)中，PCR扩增出CMV真核表达元件的条件为：94℃ 4min；94℃ 30s，62℃ 1min，72℃ 2min，3个循环；94℃ 30s，60℃ 1min，72℃ 2min ，5个循环；94℃ 30s，58℃ 1min，72℃ 2min ，5个循环；94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 2min ，5个循环；94℃ 30s，54℃ 1min，72℃ 2min ，25个循环； 72℃ 10min；12℃ 30min；步骤(2)中，以小鼠肝脏DNA为模板扩增泛素化标签与黑色素瘤CD8表位融合基因，条件为：94℃ 4min；94℃ 30s，62℃ 45s，72℃ 1min，3个循环；94℃ 30s，60℃ 45s，72℃ 1min ，5个循环；94℃ 30s，58℃45s，72℃ 1min，5个循环；94℃ 30s，56℃ 45s，72℃ 1min，5个循环；94℃ 30s，54℃ 45s，72℃ 1min，25个循环； 72℃ 10min；12℃ 30min；步骤(3)中，pV电转化入沙门氏菌的具体方法为：取10mL对数生长期的沙门氏菌，4℃ 以1500g～2000g的离心力离心10min，弃去上清；用20mL 0～4℃含有10%甘油的无菌超纯水的WB缓冲液重悬沉淀；4℃ 以1500g～2000g的离心力离心10min，弃去上清；用10mL0～4℃的WB缓冲液重悬沉淀；4℃ 以1500g～2000g的离心力离心10min，弃去上清，用1mL 0～4℃的WB缓冲液重悬沉淀；取50uL的悬液加入到冰浴的0.2cm电转杯中，再加入20pg～0.1mg的pV质粒，混匀；将电转杯放入Bio-Rad Gene Pulser仪中，以2.5 kV，25 mF，200 V的条件进行电击；取出电转杯，并加入1mL的LB培养基混匀，转移至10mL的试管中，于37℃摇床中培养60～90min，取100mL的菌液涂布于含50～100mg/mL氨苄西林的固体LB平板，即完成了电转化。 

上述技术方案中，根据NCBI所公布的Melan-A序列BC111114.1设计特异性引物Seq NO.1和SeqNO.2；根据pVAX1载体的序列，设计了针对CMV真核表达元件的引物Seq NO.3和Seq NO.4；根据小鼠泛素标签序列NM_024277.2及黑色素瘤CD8表位TWHRYHLL与SVYDFFVWL，合成了一对引物Seq NO.5和Seq NO.6，CD8两个表位间以AAY相连，即TWHRYHLLAAYSVYDFFVWL。 

上述引物的序列号如下： 

引物编号序列Seq NO.1ggtacctgccccaagaagacaSeq NO.2tctcagaggtgaataaggtggcSeq NO.3accggtggagttccgcgttacaSeq NO.4accggtcagtagaagccatagagSeq NO.5aagcttatgcagatctttgtgaagSeq NO.6ctcgagtcataaccacacaaaaaaatcgtacactgagtaagcagctaataaatggtaccgatgccagttagcaccccgaagtctcaac

本发明中，扩增出AIDA-1表达元件的质粒pMK90属于现有技术，已被Casali L等人公开（参见：Casali L，Konieczny M，Schmidt MA，et al. Invasion activity of a mycobacterium tuberculosis peptide presented by the Escherichia coli AIDA autotransporter. Infec Immun, 2002, 70(12): 6846-52）。

本发明还公开了一种采用上述制备方法制备得到的以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗。该疫苗经体内试验检证明具有肿瘤免疫预防效果，因此，本发明同时要求保护上述以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗在制备肿瘤预防及治疗药物中的应用；所述的肿瘤为黑色素瘤。 

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点： 

本发明首次制备了以减毒沙门氏菌为载体的基于微基因与自转运系统的口服肿瘤疫苗，将微基因疫苗和AIDA-I表面展示肿瘤抗原构建于同一载体上，通过小鼠肿瘤模型，验证了该疫苗具有同时激活CD4+ T和CD8+ T细胞免疫应答，具有肿瘤免疫预防效果；从而可以将其应用在制备肿瘤的免疫预防药物领域中，特别是黑色素瘤。

附图说明

图1为实施例一中整合了微基因与AIDA-1转运系统的口服肿瘤疫苗载体的构建示意图； 

图2为实施例二中肿瘤体积与时间的关系图；

图3为实施例三中口服肿瘤疫苗对脾脏中T细胞免疫应答的影响图；

图4为实施例三中口服肿瘤疫苗对肿瘤部位T细胞浸润的促进作用图；

图5为实施例三中口服肿瘤疫苗对肿瘤浸润性T细胞分泌IFN-γ的影响图； 

* 表示差异具有显著性： * p<0.05，** p<0.001。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述： 

实施例一：整合了微基因与AIDA-1转运系统的口服肿瘤疫苗载体的构建

附图1为整合了微基因与AIDA-1转运系统的口服肿瘤疫苗载体的构建示意图，具体步骤为：

1、PMK90载体的构建：取大肠杆菌E393，煮沸10分钟作为PCR模板，构建出携带AIDA-1表达原件的质粒pMK90并在AIDA-I的C末端引物AgeI位点，用KpnI和XbalI双酶切该质粒，回收载体大片段待用；

2、以B16细胞的cDNA为模板，用引物Seq NO.1和SeqNO.2扩增出Melan-A基因；用KpnI和XbalI双酶切，回收产物并将其与上述回收的载体大片段连接；将连接产物转化至DH10B的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；取该质粒进一步测序鉴定其编码基因序列，取测序正确的命名为pBMA；

3、用引物Seq NO.3和Seq NO.4，以PVAX1质粒为模板，通过PCR扩增出CMV真核表达元件，以小鼠肝脏DNA为模板，用引物Seq NO.5和Seq NO.6扩增出融合了泛素化标签和黑色素瘤CD8+ T细胞表位的基因，并将该基因克隆至CMV真核表达元件中；

4、将上述中获得的包含有泛素化标签和黑色素瘤CD8+ T细胞表位的CMV真核表达元件克隆至pBMA中，构建出目的载体pV。

以上试验中所采用的分子生物学方法均按照《分子克隆实验指南（第三版）》操作；步骤1中构建出携带AIDA-1表达原件的质粒pMK90的方法根据Casali L等人公开的文献操作（参见：Casali L，Konieczny M，Schmidt MA，et al. Invasion activity of a mycobacterium tuberculosis peptide presented by the Escherichia coli AIDA autotransporter. Infec Immun, 2002, 70(12): 6846-52）。 

步骤2中，以B16细胞的cDNA为模板，PCR扩增出Melan-A基因的条件为：94℃ 4min；94℃ 15s，62℃ 30s，72℃ 1min ，3个循环；94℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 1min ，5个循环；94℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 1min ，5个循环；94℃ 15s，56℃30s，72℃ 1min ，5个循环；94℃ 15s，54℃30s，72℃ 1min ，25个循环； 72℃ 10min；12℃ 30min；步骤3中，PCR扩增出CMV真核表达元件的条件为：94℃ 4min；94℃ 30s，62℃ 1min，72℃ 2min，3个循环；94℃ 30s，60℃ 1min，72℃ 2min ，5个循环；94℃ 30s，58℃ 1min，72℃ 2min ，5个循环；94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 2min ，5个循环；94℃ 30s，54℃ 1min，72℃ 2min ，25个循环； 72℃ 10min；12℃ 30min；步骤3中，以小鼠肝脏DNA为模板扩增泛素化标签与黑色素瘤CD8表位融合基因，条件为：94℃ 4min；94℃ 30s，62℃ 45s，72℃ 1min，3个循环；94℃ 30s，60℃ 45s，72℃ 1min ，5个循环；94℃ 30s，58℃45s，72℃ 1min，5个循环；94℃ 30s，56℃ 45s，72℃ 1min，5个循环；94℃ 30s，54℃ 45s，72℃ 1min，25个循环； 72℃ 10min；12℃ 30min。 

实施例二：以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的肿瘤预防效果 

(1) 以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备：

取10mL对数生长期的沙门氏菌，4℃ 以1500g～2000g的离心力离心10min，弃去上清；用20mL冰冷的（0～4℃）WB缓冲液（含有10%甘油的无菌超纯水）重悬沉淀，4℃ 以1500g～2000g的离心力离心10min，弃去上清；用10mL冰冷的（0～4℃）WB缓冲液重悬沉淀，4℃ 以1500g～2000g的离心力离心10min，弃去上清，用1mL冰冷的（0～4℃）WB缓冲液重悬沉淀；取50uL的悬液加入到冰浴的0.2cm电转杯中，再加入20pg～0.1mg的实例一制备的质粒pV，轻轻混匀；将电转杯放入Bio-Rad Gene Pulser仪中，以2.5 kV，25 mF，200 V的条件进行电击；迅速取出电转杯，并加入1mL的LB培养基混匀，转移至10mL的试管中，于37℃摇床中培养60min～90min，取100mL的菌液涂布于含50～100mg/m1氨苄西林的固体LB平板，于37℃细菌生化培养箱中培养。48小时后，取单个菌落进行PCR鉴定，阳性者即可作为疫苗使用；

(2) 以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的免疫预防试验：

实验分组：试验分3组，分别为免疫10% NaHCO₃、携带空载体的减毒沙门氏菌SL7207 （Vector）和携带pV的减毒沙门氏菌SL7207（Vaccine）。C57BL/6小鼠分别用1×10⁸个疫苗菌（悬于30uL10% NaHCO₃）或30uL的30uL10% NaHCO₃免疫2次，免疫间隔期为2周。最后一次免疫后两周，小鼠腹部皮下接种5×10⁴个B16-F10细胞，观测肿瘤生长情况。附图2为肿瘤体积与时间的关系，可以看出接种携带pV的SL7207（Vaccine），肿瘤生长速度较其它组均有显著下降，差异显著；该结果表明，本发明公开的以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗具有很好的肿瘤免疫预防效果。

实施例三：以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗诱导了CD4+ T细胞和CD8+ T细胞抗肿瘤免疫应答 

取实施二中的小鼠，在接种肿瘤18天后处死，收集小鼠脾脏及肿瘤细胞，通过细胞计数及流式细胞术分析CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的应答。

附图3为上述口服肿瘤疫苗对脾脏中T细胞免疫应答的影响图，可以看出接种携带pV的SL7207（Vaccine）组小鼠脾脏中IFN-γ阳性的CD4+ T细胞显著高于其它组，IFN-γ阳性的CD8+ T数量也明显升高；表明口服本发明公开的口服肿瘤疫苗可以促进CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的免疫应答。 

附图4为上述口服肿瘤疫苗对肿瘤部位T细胞浸润的促进作用图，可以看出携带pV的SL7207（Vaccine）组中，肿瘤中浸润的淋巴细胞T细胞和NK细胞比例明显升高； 

附图5为上述口服肿瘤疫苗对肿瘤浸润性T细胞分泌IFN-γ的影响图，可以看出胞内染色的结果表明pV的SL7207（Vaccine）组中IFN-γ阳性的CD4+ T和CD8+ T细胞显著高于其它组；表明口服本发明公开的口服肿瘤疫苗可以促进CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的免疫应答。

以上结果说明本发明公开的以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗可以诱导CD4+ T细胞和CD8+ T细胞抗肿瘤免疫应答。 

序列表

<110> 苏州大学

<120>以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备及其应用

<160> 6

 

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggtacctgccccaagaagaca                               21

 

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tctcagaggtgaataaggtggc                               22

 

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

accggtggagttccgcgttaca                               22

 

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

accggtcagtagaagccatagag                                       23

 

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

aagcttatgcagatctttgtgaag                            24

 

<210> 6

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ctcgagtcataaccacacaaaaaaatcgtacactgagtaagcagctaataaatggtaccgatgccagttagcaccccgaagtctcaac    88