一株红球菌以及用于制备光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途

摘要

本发明涉及一株红球菌以及用于制备光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途，该红球菌（Rhodococcus baikonurensis），实验室编号为ECU1014，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7649，利用该菌株的静息细胞作为生物催化剂制备光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途。本发明所述的菌株用于不对称还原制备光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的生物工艺具有产物浓度高，反应条件温和，原子经济性强，不需要额外添加昂贵的辅酶，操作简便，易于放大等特点，在(R)-硫辛酸中间体的生产中具有很好的工业应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一株红球菌以及用于制备光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途，该菌株在2013年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.7649。 

背景技术

α-硫辛酸是一种能消除老化与致病的自由基的类似维他命的化合物，可协助辅酶进行有利于机体免疫力的生理代谢，是一种万能抗氧化剂药物。文献报道α-硫辛酸对肝脏疾病、糖尿病、艾滋病、肿瘤等许多疾病的治疗都有一定的效果。(R)-α-硫辛酸是人体内硫辛酸的天然形式，(S)-α-硫辛酸基本没有生物活性但也无副作用。如能得到光学纯的(R)-α-硫辛酸，患者服用药物剂量可减少一半，显然更有价值的(R)-α-硫辛酸替代外消旋的硫辛酸是必然趋势。(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯是(R)-α-硫辛酸合成的重要手性中间体，其合成方法有两类：化学合成和生物合成法。与化学合成法相比，生物合成的方法具有反应条件温和、催化效率高、选择性高等多种优点。生物合成法又包括两种方法，一是通过脂肪酶催化外消旋的酯或者羟基酸进行动力学拆分，二是通过还原酶对潜手性酮进行不对称还原。后者由于其理论产率可达100%，远高于前者的50%理论产率，更受研究者的青睐。 

目前仅有3篇文献报道用不对称还原制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯的方法。在这3篇文献中，底物浓度最高的达到200mM(45g/L)，但它需要添加高达4mM的昂贵辅酶，反应时间长达24h，转化率只有95%，产物的ee值没有提及(WO2007028729)；Müller等应用来自于Thermoanaerobacter  brocki的醇脱氢酶不对称还原6-羰基-8-氯辛酸甲酯得到相应的(R)-6-羟基-8-氯辛酸甲酯，虽然其产物光学纯度达到99.5%，是目前文献报道的最高水平，但其底物浓度仅为2.2g/L，反应需要添加0.5mM的辅酶和1mM的二硫苏糖醇(DTT)，并且转化率仅有85%(US7157253B2)。Olbrich等利用Geotrichum candidum野生菌细胞还原5g/L的6-羰基-8-氯辛酸甲酯制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸甲酯，得率仅为62%，产物的ee值仅为88%(US7135328B2)。 

以上方法普遍存在转化率低、反应时间长、需要添加昂贵辅酶、成本高等严重缺陷，与工业化生产的要求相距甚远。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，已报道的酶促不对称还原制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯的方法中普遍出现的转化率低，反应时间长，需要添加昂贵辅酶及其它添加剂等问题。 

本发明提供一株红球菌以及用于制备光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途 

本发明通过下述具体技术方案以解决上述技术问题： 

本发明的发明人从土壤中，经过初筛、复筛及分离纯化，获得一株能高效率不对称还原制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯的红球菌(Rhodococcus baikonurensis)，实验室编号为ECU1014，该菌株在2013年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.7649。 

Rhodococcus baikonurensis ECU1014（CGMCC No.7649）具有如下特征： 

1.大小形态 

球状，2～3μm，革兰氏染色阳性； 

2.适合生长环境 

可在温度25～35℃，pH5～9环境中生存； 

3.平板培养菌落特性 

淡粉色，潮湿状，底部有隆起，边缘粗糙，不透明。 

经16S rDNA鉴定，确认该菌株为(Rhodococcus baikonurensis)，标号为Rhodococcus baikonurensis ECU1014。 

本发明的红球菌株Rhodococcus baikonurensis ECU1014可以不对称合成光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇，包括下列步骤： 

1.菌株的培养 

将所述的红球菌Rhodococcus baikonurensis ECU1014采用本领域常规的方法，在发酵培养基中进行扩增培养24～36h，温度20～50°C; 

再以上述培养液做为种子，基于发酵培养基体积的接种量为1～10%(v/v)，接种至50mL的发酵培养基中，在20～50℃下100～160rpm摇床上培养24～48h，离心得到静息细胞； 

所述的发酵培养基可采用常规的培养基，其中各组分的含量如下：葡萄糖10～50g，蛋白胨1～20g，KH₂PO₄1～10g，K₂HPO₄1～10g，NaCl0.1～2g，MgSO₄0.1～2g，水1000mL，pH3～8。 

2.底物的生物转化 

将收获的静息细胞，悬浮于pH为5.5～7.0的缓冲液中，静息细胞的含量为1～300g(湿重)/L；在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NAD⁺的存在下，对潜手性羰基化合物进行不对称还原反应，制得光学活性手性醇。 

所述的前手性羰基化合物在反应液中的浓度较佳的为1～15mmol/L(6-羰基-8-氯辛酸乙酯为1～300mmol/L)。葡萄糖脱氢酶的用量较佳的为0.2～3kU/L(以6-羰基-8-氯辛酸乙酯作为底物时为0.2～60kU/L)。葡萄糖的用量较佳的为0.3～4.5g/L(以6-羰基-8-氯辛酸乙酯作为底物时为0.3～90g/L)。外加NAD⁺的用量较佳的为0～1.0mmol/L。所述的缓冲液可为本领域常规磷酸盐缓冲液，如磷酸-磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳的为0.05～0.1mol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的不对称还原反应较佳的是在振荡或搅拌条件下进行。所述的不对称还原反应的温度较佳 的为20～35℃。所述的不对称还原反应的时间较佳的以反应完全为准。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取手性醇产物。 

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。 

本发明的积极进步效果在于：本发明针对已报道的生物催化不对称合成(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯的研究中存在产物浓度不高，转化率低，反应时间长，需要额外添加昂贵辅酶等问题，筛选得到一株红球菌作为催化剂，不对称还原6-羰基-8-氯辛酸酯及其它潜手性酮。在催化浓度高达300mmol/L(66g/L)的底物时，转化率仍可达99%以上，反应时间为36h，产物的ee值为93%，且不需要额外添加昂贵的辅酶。相对于已报道的其它不对称还原制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯的方法，具有一定的工业应用前景。 

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术内容作进一步的描述。其目的仅在于更好地理解本发明的内容，而非限制本发明的保护范围。 

实施例1菌株的筛选 

配制富集培养基，成分如下：(NH₄)₂SO₄1.0g/L，KH₂PO₄3.0g/L，K₂HPO₄6.0g/L，MgSO₄0.5g/L，CaCl₂0.05g/L；另配制丰富培养基，组成如下：葡萄糖15g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，KH₂PO₄1.0g/L，K₂HPO₄1.0g/L，MgSO₄0.5g/L，pH7.0。在250mL的三角烧瓶内装50mL的富集培养基和2mM的底物作为碳源，加入土样后，于30℃，180rpm培养1～6天。之后将该培养液涂布于丰富培养基平板上，30℃培养1～3天，长出的单菌落进行平板划线分离纯化。底物为6-羰基-8-氯辛酸乙酯。 

将得到的单菌落接种到液体丰富培养基中，在30℃，180rpm培养2天后，取一定量的湿细胞(0.1～0.5g)悬浮于1mL磷酸缓冲液(PBS，50mM，pH6.0)中，添加底物6-羰基-8-氯辛酸乙酯(10mM，以乙醇助溶)和5%葡萄糖，在30℃，1100rpm条件下反应24h。反应结束后，使用薄板层析(TLC)分析产物/底物比例，选择产物比例高的菌株进行复筛。 

复筛中，菌体的培养方法和条件同上，反应结束后离心(12,000rpm，5min)，收集的上清液用乙酸乙酯萃取两次，取上层有机相，用无水NaSO₄干燥过夜，进行气相色谱分析，测定底物转化率和还原产物的ee值。 

筛选结果是编号为ECU1014的菌株催化还原时具有最高的转化率与ee值。 

产物ee值的具体分析条件如下： 

使用气相色谱仪进行分析，色谱柱为手性毛细管柱CP-Chirasil-DEXCB，以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，反应产物乙酰化后进行分析，柱温160℃。 

实施例2–8静息细胞催化羰基化合物的不对称还原 

在1mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH6.0)中加入0.01g Rhodococcus baikonurensis ECU1014的静息细胞和2U的葡萄糖脱氢酶粗酶液(制备方法参见：Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology2011,38,633–641)，分别加入终浓度为10mmol/L的潜手性羰基化合物(实施例2–8)，以及终浓度为0.5mmol/L的NAD⁺和3g/L的葡萄糖。在30°C，1100rpm振荡反应24h。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜后分析测定底物转化率和还原产物的ee值，结 果见表1。 

产物ee值的具体分析条件如下： 

使用气相色谱仪进行分析，色谱柱为手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB，以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，其它条件如下： 

实施例2：反应产物乙酰化后进行分析，柱温80℃； 

实施例3：柱温160℃； 

实施例4：反应产物乙酰化后进行分析，柱温160℃； 

实施例5：反应产物乙酰化后进行分析，柱温160℃； 

实施例6：反应产物乙酰化后进行分析，柱温160℃； 

实施例7：反应产物乙酰化后进行分析，柱温160℃； 

实施例8：反应产物乙酰化后进行分析，柱温160℃； 

表1.催化羰基化合物不对称还原反应的结果 

实施例9静息细胞催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯的不对称还原 

在10mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH6.0)中加入0.5g Rhodococcus baikonurensis ECU1014的静息细胞和100U的葡萄糖脱氢酶粗酶液，加入终浓度为50mmol/L的6-羰基-8-氯辛酸乙酯和15g/L的葡萄糖。反应在30℃下进行，pH控制为6.0，反应至产物的浓度不再增加为止，此时反应时间为12小时。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB)分析测定底物转化率和还原产物的ee值。具体分析条件为：以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，柱温160℃。转化率为99%，产物ee值为93%(R)。 

实施例10静息细胞催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯的不对称还原 

在100mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH6.0)中加入30g Rhodococcus baikonurensis ECU1014的静息细胞和6kU的葡萄糖脱氢酶粗酶液，加入终浓度为300mmol/L的6-羰基-8-氯辛酸乙酯和90g/L的葡萄糖。反应在30℃下进行，pH控制为6.0，反应至产物的浓度不再增加为止，此时反应时间为36小时。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB)分析测定底物转化率和还原产物的ee值。转化率为99%，产物ee值为93%。旋转蒸发除去溶剂，获得产品34g。 

¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ4.13(q,J=7.1Hz,2H),3.93–3.81(m,1H),3.77–3.62(m,2H),2.32(t,J=7.3Hz,2H),1.97–1.80(m,2H),1.77–1.58(m,3H),1.55–1.45(m,3H),1.44–1.35(m,1H),1.26(t,J=7.1Hz,3H). 

¹³C NMR(CDCl₃,400MHz):δ14.3,24.7,25.0,34.2,37.1,39.7,42.0,60.4,68.5,173.8。