一种基于HPLC技术的石蒜中茉莉酸类化合物含量的检测方法

摘要

本发明公开了一种基于HPLC技术的石蒜中茉莉酸类化合物含量的检测方法，通过石蒜样品的茉莉酸类化合物提取与纯化，标准品分离图谱的建立，茉莉酸类化合物含量的测定，较为快速准确地同时检测植物中多种茉莉酸类激素。检测结果可靠，各种化合物分离度较好。可以用于检测植物体中的茉莉酸类内源激素，为研究各种茉莉酸类激素在植物生长发育和次生代谢过程中所发挥的作用，同时为植物体中茉莉酸类化合物的代谢途径研究提供技术平台。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用高效液相法HPLC测定植物体中激素的方法，尤其涉及的是一种基于 HPLC技术的石蒜中茉莉酸类化合物含量的检测方法。

背景技术

茉莉酸类化合物是广泛存在于植物体的一类激素，在植物体中含量甚微，目前可用于检 测植物体中的茉莉酸类激素的方法主要有：气质联用（GC-MS），液质联用（HPLC-MS）和酶联 免疫检测技术（ELISA），UPLC-MS-MS等方法，也有液相色谱电化学检测方法（liquid  chromatography-electrochemical detection，HPLC-ECD）。

在现有的检测技术中，单独的HPLC检测法还不能够准确且快速地检测植物中的多种茉莉 酸类激素。GC-MS检测法，虽然灵敏性好，但测定茉莉酸类化合物时需先要进行衍生化。所 采用的衍生化是酯衍生化，茉莉酸会转变成酯类化合物，而内源茉莉酸类激素包含有茉莉酸 甲酯和二氢茉莉酸甲酯等化合物，所以GC-MS方法也具有一定的局限性。酶联免疫法检测方 法（ELISA）和液相色谱电化学检测方法（HPLC-ECD）具有较高的特异性。但茉莉酸类化合物 种类较多，ELISA法不能够同时检测多种激素，重复性较差；已报道的HPLC-ECD方法是将茉 莉酸与多巴胺反应，生成具有电化学信号的物质，该方法只能检测茉莉酸的含量。其他的检 测方法的步骤均复杂或对仪器设备的要求较高，不便于激素的快速准确地测定。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于HPLC技术的石蒜中茉莉酸类化 合物含量的检测方法，较为快速准确地同时检测植物中四种茉莉酸类激素。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：

（1）样品的提取与纯化

取待测样品的新鲜植物叶10g，加入20～30ml体积浓度为80%的甲醇溶液，加入吸附剂， 冰浴研磨成匀浆，离心后取上清旋转蒸发至水相；加入磷酸盐缓冲液，脱色后萃取，然后复 溶，经Spe C18小柱纯化后，使用0.45μm滤膜过滤，滤液作为试样溶液；

（2）检测装置的设定

色谱柱为Eclipse XDB-C18，250mm×4.6mm，5μm；流动相A甲醇，B pH3.6的乙酸 水溶液；等度洗脱A：B=1:1，流速为1mL/min，检测波长235nm，柱温为25℃，待基线平稳， 进样量为10μL；

（3）标准曲线绘制

分别准确称取茉莉酸JA、二氢茉莉酸DJA、茉莉酸甲酯MeJA和二氢茉莉酸甲酯DMeJA的 标准品，加入甲醇溶解，摇匀配制成质量浓度为1.0～1.2mg/ml的标准品溶液；分别取各标 准品溶液，加甲醇逐级稀释，制得质量浓度分别为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、20μ g/ml、10μg/ml、5μg/ml的标准系列溶液；分别精密量取10μl进样于高效液相色谱仪， 记录色谱图，分别以各标准品的含量x为横坐标，以峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，横 坐标标准品的含量在5～200微克/毫升，得到标准品茉莉酸、二氢茉莉酸、茉莉酸甲酯和 二氢茉莉酸甲酯的保留时间RT分别为：茉莉酸RT为4.380min，二氢茉莉酸的RT为6.256min， 茉莉酸甲酯的RT为8.603min，二氢茉莉酸甲酯的RT为13.196min；

（4）检测待测样品石蒜组织中的茉莉酸类含量

将石蒜样品经步骤（1）提取与纯化后按照步骤（2）和步骤（3）进行HPLC检测，进样 10μl，积分同一保留时间下的峰面积，一次性检测得到待测石蒜样品中四个茉莉酸类激素及 其含量。

所述步骤（1）中，取新鲜植物叶10g，加入20～30ml体积浓度为80%的甲醇溶液，4℃ 下静置过夜，加入交联聚乙烯基吡咯烷酮PVPP溶液，冰浴研磨成匀浆，离心后取上清旋转蒸 发至水相；加入磷酸盐缓冲液，然后再加入等体积的石油醚脱色，保留水相，重复三次，当 醚相无颜色时调节水相的pH至8.0，然后使用等体积的乙酸乙酯进行萃取，重复两次，合并 酯相，旋转蒸发，浓缩至干，然后加入到1ml体积浓度为60%甲醇中复溶，经Spe C18小柱 纯化后，使用0.45μm滤膜过滤，滤液作为试样溶液。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明的方法可以同时检测多种茉莉酸类激素，且 检测结果可靠，各种化合物分离度较好。可以用于检测植物体中的茉莉酸类内源激素，为研 究各种茉莉酸类激素在植物生长发育和次生代谢过程中所发挥的作用，同时为植物体中茉莉 酸类化合物的代谢途径研究提供技术平台。

附图说明

图1是本发明茉莉酸JA、二氢茉莉酸DJA、茉莉酸甲酯MeJA和二氢茉莉酸甲酯DMeJA标 准品的高效液相色谱图；

图2是本发明待测石蒜样品的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施， 给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本实施例包括以下步骤：

（1）样品的提取与纯化

取待测样品的新鲜植物叶10g，加入25ml体积浓度为80%的甲醇溶液，4℃下静置过夜， 加入交联聚乙烯基吡咯烷酮PVPP溶液，冰浴研磨成匀浆，离心后取上清旋转蒸发至水相；加 入磷酸盐缓冲液，然后再加入等体积的石油醚脱色，保留水相，重复三次，当醚相无颜色时 调节水相的pH至8.0，然后使用等体积的乙酸乙酯进行萃取，重复两次，合并酯相，旋转蒸 发，浓缩至干，然后加入到1ml体积浓度为60%甲醇中复溶，经Spe C18小柱纯化后，使用 0.45μm滤膜过滤，滤液作为试样溶液；

（2）检测装置的设定

本实施例的HPLC装置：Agilent1200高效液相色谱仪工作站,Agilent1200系列泵，可 变波长检测器，色谱柱为Eclipse XDB-C18，250mm×4.6mm，5μm；流动相A甲醇，B pH3.6 的乙酸水溶液；等度洗脱A：B=1:1，流速为1mL/min，检测波长235nm，柱温为25℃，待基 线平稳，进样量为10μL；

（3）标准曲线绘制

分别准确称取茉莉酸、二氢茉莉酸、茉莉酸甲酯和二氢茉莉酸甲酯的标准品，加入甲醇 溶解，摇匀配制成质量浓度为1.0～1.2mg/ml的标准品溶液；分别取各标准品溶液，加甲醇 逐级稀释，制得质量浓度分别为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、 5μg/ml的标准系列溶液；分别精密量取10μl进样于高效液相色谱仪，记录色谱图，分别 以各标准品的含量x为横坐标，以峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，如图1所示，图中JA、 DJA、MeJA和DMeJA分别是茉莉酸、二氢茉莉酸、茉莉酸甲酯和二氢茉莉酸甲酯；横坐标标 准品的含量在5～200微克/毫升，得到标准品茉莉酸、二氢茉莉酸、茉莉酸甲酯和二氢茉 莉酸甲酯的保留时间RT分别为：茉莉酸RT为4.380，二氢茉莉酸的RT为6.256，茉莉酸甲 酯的RT为8.603，二氢茉莉酸甲酯的RT为13.196；

（4）检测待测样品石蒜组织中的茉莉酸类含量

将石蒜样品经步骤（1）提取与纯化后按照步骤（2）和步骤（3）进行HPLC检测，进样 10μl，积分同一保留时间下的峰面积，一次性检测得到待测石蒜样品中四个茉莉酸类激素及 其含量，如图2所示，可以根据茉莉酸、二氢茉莉酸、茉莉酸甲酯和二氢茉莉酸甲酯的保留 时间进行判定，得出待测石蒜样品中的四个茉莉酸类激素，含量可以根据峰面积判定。

以上所用无水甲醇、乙酸和去离子水均用0.45纳米微孔滤膜过滤，所用无水甲醇、乙 酸茉莉酸、二氢茉莉酸、茉莉酸甲酯和二氢茉莉酸甲酯化合物纯度为色谱纯。